本發(fā)明涉及食品安全免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種無標(biāo)記型丙烯酰胺電化學(xué)免疫傳感器及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

丙烯酰胺是一種高水溶性的不飽和酰胺類小分子化合物，對(duì)人體具有神經(jīng)毒性、遺傳毒性和生殖毒性，國際腫瘤機(jī)構(gòu)(IARC)把丙烯酰胺列為2A級(jí)致癌物質(zhì)，即人類可能致癌物。研究表明，丙烯酰胺廣泛存在于高溫加工的還原糖含量高的食品中。生活飲用水是人體攝入丙烯酰胺的主要來源之一，WHO規(guī)定飲水中丙烯酰胺限量為0.5μg/L，歐盟規(guī)定飲水中限量為0.1μg/L，美國環(huán)境保護(hù)局規(guī)定的限量為0.5μg/L。因此，建立靈敏、快速、簡(jiǎn)單、高效的丙烯酰胺檢測(cè)方法具有重大意義。

目前丙烯酰胺的常規(guī)檢測(cè)方法主要是儀器分析法，如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳等方法，這些方法需要昂貴復(fù)雜的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員，加之樣品處理繁瑣、檢測(cè)流程復(fù)雜、檢測(cè)費(fèi)用高，難以滿足高通量、現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要，很難適應(yīng)許多場(chǎng)合快速檢測(cè)的需要，在應(yīng)用上不能廣泛推廣。

基于抗原-抗體分子識(shí)別的免疫分析技術(shù)具有檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)單、檢測(cè)限低、特異性高、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)藥、生物毒素、有機(jī)污染物、微生物等分析領(lǐng)域得到了廣泛的研究。目前關(guān)于丙烯酰胺免疫檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)道較少，大多采用傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)。Preston等將3-巰基苯甲酸(3-MBA)與丙烯酰胺的衍生產(chǎn)物Ade-3-MBA作為半抗原，偶聯(lián)蛋白后免疫兔子得到多克隆抗體，可以特異性地檢測(cè)識(shí)別Ade-3-MBA，由此建立的ELISA檢測(cè)方法，對(duì)水樣中丙烯酰胺的檢測(cè)限為65.7μg/L。趙美萍等于2008年申請(qǐng)了題為“丙烯酰胺全抗原的制備及其酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法”的專利(申請(qǐng)?zhí)?00710090394.4)，采用N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(NAS)為半抗原，建立了丙烯酰胺酶聯(lián)免疫分析方法，檢測(cè)限為0.03μg/mL。2011年，Quan等建立了化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，對(duì)丙烯酰胺的檢測(cè)限為18.6ng/mL。

然而，上述免疫分析方法，對(duì)丙烯酰胺的檢測(cè)靈敏度還有待進(jìn)一步提高。近年來，基于抗原抗體反應(yīng)的免疫傳感器發(fā)展迅速?？乖贵w結(jié)合前后可導(dǎo)致光學(xué)、熱學(xué)、電化學(xué)等方面的信號(hào)改變，因此可通過對(duì)其測(cè)定得到抗原或抗體的濃度。在各類傳感器中，電化學(xué)免疫傳感器具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物分析中。近年來，納米材料被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)免疫傳感器中，納米材料獨(dú)特的性能，為光、電信號(hào)傳導(dǎo)和新一代生物傳感的設(shè)計(jì)提供了優(yōu)良的載體。納米材料具有良好的導(dǎo)電性和生物相容性，常作為信號(hào)放大可以提高靈敏度。目前，還未存在特異性針對(duì)丙烯酰胺的電化學(xué)免疫傳感器。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種無標(biāo)記型丙烯酰胺電化學(xué)免疫傳感器。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種無標(biāo)記型丙烯酰胺電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的無標(biāo)記型丙烯酰胺電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)食品中丙烯酰胺的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種無標(biāo)記型丙烯酰胺電化學(xué)免疫傳感器，包括基底電極，所述基底電極表面修飾氧化石墨烯/銀納米/殼聚糖納米復(fù)合物后，電化學(xué)聚合聚苯胺納米線，然后電化學(xué)沉積金納米顆粒，固定抗體，并以牛血清蛋白封閉非特異性活性位點(diǎn)。

如上所述無標(biāo)記型丙烯酰胺電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)基礎(chǔ)電極經(jīng)拋光、清洗、吹干后，在基礎(chǔ)電極表面滴加4～6μL的GO/Ag/CS溶液，烘干，所述GO/Ag/CS溶液是使用0.5mg/mL的GO/Ag溶液與0.1％的CS溶液按照2～4:1的體積比混合而成；

(2)將步驟(1)得到的電極清洗、吹干后，置于含苯胺的硫酸溶液中，利用三電極系統(tǒng)進(jìn)行CV掃描，得到聚苯胺納米線修飾的電極；

(3)將步驟(2)得到的電極清洗、吹干后，置于含有氯金酸的硫酸溶液中，利用三電極系統(tǒng)進(jìn)行CV掃描，得到金納米顆粒修飾的電極；

(4)將步驟(3)得到的電極清洗、吹干后，在其表面滴加抗體溶液，孵育過夜；

(5)將步驟(4)得到的電極沖洗后，在其表面滴加BSA溶液，水浴反應(yīng)后，沖洗、吹干即得。

優(yōu)選地，所述GO/Ag/CS溶液是使用0.5mg/mL的GO/Ag溶液與0.1％的CS溶液按照3:1的體積比混合而成。

優(yōu)選地，步驟(2)所述苯胺的濃度為0.1～0.2mM，硫酸溶液的濃度為0.3～0.5M。

優(yōu)選地，步驟(3)所述氯金酸的濃度為1.5～2mM，硫酸溶液的濃度為0.3～0.5M。

如上所述的無標(biāo)記型丙烯酰胺電化學(xué)免疫傳感器在檢測(cè)食品中丙烯酰胺的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述食品為油炸食品、膨化食品或曲奇餅干。

一種檢測(cè)食品中丙烯酰胺的方法，包括如下步驟：

(1)在如上所述的電化學(xué)免疫傳感器表面滴加待測(cè)藥物，恒溫水浴孵育后沖洗干凈；

(2)將上述電極置于鐵氰化鉀溶液中，利用三電極系統(tǒng)進(jìn)行微分脈沖伏安法掃描，所述鐵氰化鉀溶液包含3～5mM的鐵氰化鉀，3～5mM的亞鐵氰化鉀，0.1～0.2M的氯化鉀。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明采用導(dǎo)電性和生物相容性好的石墨烯/銀納米/殼聚糖納米復(fù)合物、聚苯胺納米線、電沉積金納米顆粒作為基底，可以很好地促進(jìn)電極表面的電子傳遞，同時(shí)有利于固定抗體并保持其較高的活性，所構(gòu)建的無標(biāo)記型丙烯酰胺電化學(xué)免疫傳感器操作簡(jiǎn)單、快速，可以應(yīng)用于食品中丙烯酰胺的高靈敏檢測(cè)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明電化學(xué)免疫傳感器的原理示意圖。

圖2氧化石墨烯/銀納米復(fù)合物的透射電鏡圖。

圖3免疫傳感器修飾過程的循環(huán)伏安表征圖。

圖4為免疫傳感器對(duì)Acrylamide-4-MPA的線性響應(yīng)圖

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實(shí)施例1

一種無標(biāo)記型丙烯酰胺電化學(xué)免疫傳感器，制備方法如下：

一、氧化石墨烯/銀納米復(fù)合物的制備：首先使用改進(jìn)的hummers方法制備氧化石墨烯，將H₂SO₄/H₃PO₄(180:20mL)加入到3.0g 325目石墨和18.0g高錳酸鉀中，50℃下懸臂攪拌12h，反應(yīng)物冷卻到室溫后倒到200mL的冰水中，加入1.5mL 30％的H₂O₂。抽濾后4000rpm離心4h。真空干燥過夜得到氧化石墨烯。取15mg制備好的氧化石墨烯超聲分散在30mL水中，透析3h除去多余的離子。磁力攪拌下加入10mL濃度為50mM的銀氨溶液，繼續(xù)攪拌40min，在紫外燈下照射12h。將所得黑色沉淀離心水洗3遍除去多余的銀氨離子，真空干燥過夜得到氧化石墨烯/銀(GO/Ag)納米復(fù)合材料。

如圖2所示為氧化石墨烯/銀納米復(fù)合物的透射電鏡圖，可見銀納米顆粒均勻地分散在片狀石墨烯上，90％的銀納米顆粒粒徑在8～12nm之間，平均直徑約為10nm。

二、無標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器的制備

1、電極的預(yù)處理：將玻碳電極用三氧化二鋁粉末在麂皮上拋光至鏡面，用去離子水沖洗干凈，移入超聲水浴中清洗3min；然后分別用1：1的HNO₃、無水乙醇和去離子水超聲各清洗5min。清洗好的電極用去離子水沖洗表面，氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

2、免疫傳感器的制備：將1mg GO/Ag超聲2h分散到2mL去離子水中，取150μL分散好的GO/Ag加入50μL濃度為0.1％的殼聚糖(CS)。斡旋震蕩混勻后，滴加上述GO/Ag/CS溶液5μL到經(jīng)過預(yù)處理的3mm直徑的玻碳電極表面，置于37℃烘箱中烘干。用去離子水沖洗修飾了GO/Ag/CS的玻碳電極，氮?dú)獯蹈珊笾糜?mL含有0.5mmol苯胺的硫酸溶液(0.5M)中，利用三電極系統(tǒng)(玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極)在0～1.0V的電位區(qū)間以100mV/s的掃速CV掃描20段，使玻碳電極表面生成聚苯胺納米線。用去離子水沖洗修飾了苯胺的玻碳電極，氮?dú)獯蹈?。再置于?jīng)氮?dú)獬?min的含有1.87mM的氯金酸的硫酸溶液(0.5M)中，利用三電極系統(tǒng)在-0.1～0.2V的電位區(qū)間以50mV/s的掃速CV掃描10段，用去離子水沖洗玻碳電極，氮?dú)獯蹈?。在電極表面滴加5μL按照一定比例稀釋的Acrylamide-4-MPA抗體，在4℃孵育過夜以使其固定在電極表面。

上述方法制備的電極用去離子水沖洗，繼續(xù)滴加10μL BSA并放置在37℃恒溫水浴鍋2h進(jìn)行封閉，以消除非特異性吸附。然后用PBS緩沖液(0.01M pH 7.4)反復(fù)沖洗干凈。最后將制備得到傳感器探針保存在4℃環(huán)境中備用。

圖3所示為免疫傳感器修飾過程在4mL鐵氰化鉀溶液(5mM Fe(CN)₆^3-/4-,0.1M KCl)溶液中的的循環(huán)伏安表征圖，掃描速度為50mV/s。如圖所示，裸玻碳電極(a)在Fe(CN)₆^3-/4-中呈現(xiàn)一對(duì)對(duì)稱的氧化還原峰，峰電流為99.5μA(曲線a)。滴加GO/Ag/CS后還原峰電流增大到126.4μA(曲線b)，這是由于滴加的GO/Ag/CS具有良好的導(dǎo)電性和較大的比表面積加速了電極表面的電子傳遞。電聚合苯胺后，由于聚苯胺納米線具有良好的導(dǎo)電性，其氧化還原峰電流進(jìn)一步增大到187.8μA(曲線c)。電化學(xué)沉積氯金酸后在電極表面還原成金納米顆粒，氧化還原峰電流顯著增大至363.3μA(曲線d)，這是由于金納米顆粒優(yōu)良的導(dǎo)電性和表面效應(yīng)促進(jìn)了電子傳遞。當(dāng)電極固定抗體后，其氧化還原峰電流急劇下降至69.5μA(曲線e)，表明不導(dǎo)電的蛋白質(zhì)分子成功固定到電極上，阻礙了電極表面的電子傳遞，引起了電流下降。電極不修飾GO/Ag/CS，直接電聚合苯胺和電化學(xué)沉積氯金酸的峰電流值分別148.3μA(曲線f)和185.7μA(曲線g)，明顯低于修飾了GO/Ag的峰電流，說明GO/Ag/CS作為基底能夠和PANINW及GNPs協(xié)同作用，增大基底電流，有利于信號(hào)的傳導(dǎo)。

實(shí)施例2

電化學(xué)免疫傳感器對(duì)烯酰胺衍生物Acrylamide-4-MPA標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)，具體方法如下：

1、往封閉好的電極表面滴加5μL不同濃度的Acrylamide-4-MPA，置于37℃恒溫水浴鍋孵育50min，取出用PBS緩沖液(0.01M pH 7.4)反復(fù)沖洗干凈。將上述電極置于4mL鐵氰化鉀溶液(5mM Fe(CN)₆^3-/4-,0.1M KCl)利用三電極系統(tǒng)在-0.2～0.5V的電位區(qū)間進(jìn)行微分脈沖伏安法(DPV)掃描。

2、免疫傳感器以GNPs/PANI/GO/Ag/CS作為基底用于固定抗體，具有良好的電子傳遞性能的納米材料加速了電子的傳遞，實(shí)現(xiàn)電流信號(hào)的放大。采用競(jìng)爭(zhēng)免疫分析模式，在最優(yōu)條件下，加入不同濃度的Acrylamide-4-MPA，在鐵氰化鉀溶液(5mM Fe(CN)₆^3-/4-,0.1M KCl)中利用三電極系統(tǒng)于-0.2～0.5V的電位區(qū)間進(jìn)行微分脈沖伏安法(DPV)掃描，測(cè)試不同濃度Acrylamide-4-MPA的電流響應(yīng)值

圖4為免疫傳感器對(duì)Acrylamide-4-MPA的線性響應(yīng)圖，在0.16～100ng/mL范圍內(nèi)，Acrylamide-4-MPA濃度(C)的對(duì)數(shù)與電流信號(hào)變化(ΔI)的關(guān)系為：ΔI＝2.31lgC+4.00，R²為0.9945，免疫傳感器的檢測(cè)限為26pg/mL。

實(shí)施例3

免疫傳感器的再現(xiàn)性與穩(wěn)定性測(cè)定：為評(píng)估構(gòu)建的免疫傳感器的再現(xiàn)性，對(duì)每個(gè)樣品的測(cè)量均重復(fù)三次。表1是傳感器在Acrylamide-4-MPA標(biāo)準(zhǔn)液的濃度分別為100、0.16、0ng/mL時(shí)的測(cè)量結(jié)果，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.86％、3.77％、12.6％，說明所構(gòu)建的免疫傳感器具有良好的再現(xiàn)性。

表1免疫傳感器的再現(xiàn)性

通過定期測(cè)量保存在4℃條件下的修飾好的電極隨時(shí)間的變化，評(píng)估免疫傳感器的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，免疫傳感器在3周后的電流響應(yīng)值保持在80％以上，如表2所示，修飾的電極具有很高的穩(wěn)定性。

表2傳感器的穩(wěn)定性

實(shí)施例4

電化學(xué)免疫傳感器對(duì)食品中丙烯酰胺含量的檢測(cè)，具體步驟如下：

1、實(shí)際樣品的提取和純化：稱取5g薯?xiàng)l樣品加入20mL甲醇，超聲波提取5min，8000rpm/min離心10min，用0.22μm有機(jī)膜過濾兩次，取10mL上清液，氮?dú)獯蹈?，加?mL色譜純甲醇復(fù)溶。

2、實(shí)際樣品的衍生：取1mL純化后的提取液加入2mL 0.01g/mL的對(duì)巰基苯乙酸溶液，50℃震蕩反應(yīng)1h，氮?dú)獯蹈?，加入?5％PB緩沖液和5％甲醇的復(fù)溶液溶解目標(biāo)物，進(jìn)行電化學(xué)免疫分析。

所構(gòu)建的無標(biāo)記型丙烯酰胺電化學(xué)免疫傳感器對(duì)薯?xiàng)l的檢測(cè)回收率在88.7％～104.7％之間，因此該方法可用于食品中丙烯酰胺的檢測(cè)。

實(shí)施例5

一種無標(biāo)記型丙烯酰胺電化學(xué)免疫傳感器，制備方法如下：

一、氧化石墨烯/銀納米復(fù)合物的制備：同實(shí)施例1。

二、無標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器的制備

1、電極的預(yù)處理：將玻碳電極用三氧化二鋁粉末在麂皮上拋光至鏡面，用去離子水沖洗干凈，移入超聲水浴中清洗3min；然后分別用1：1的HNO₃、無水乙醇和去離子水超聲各清洗5min。清洗好的電極用去離子水沖洗表面，氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

2、免疫傳感器的制備：將1mg GO/Ag超聲2h分散到2mL去離子水中，取100μL分散好的GO/Ag加入50μL濃度為0.1％的殼聚糖(CS)。斡旋震蕩混勻后，滴加上述GO/Ag/CS溶液5μL到經(jīng)過預(yù)處理的3mm直徑的玻碳電極表面，置于37℃烘箱中烘干。用去離子水沖洗修飾了GO/Ag/CS的玻碳電極，氮?dú)獯蹈珊笾糜?mL含有1mmol苯胺的硫酸溶液(0.3M)中，利用三電極系統(tǒng)(玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極)在0～1.0V的電位區(qū)間以100mV/s的掃速CV掃描20段，使玻碳電極表面生成聚苯胺納米線。用去離子水沖洗修飾了苯胺的玻碳電極，氮?dú)獯蹈?。再置于?jīng)氮?dú)獬?min的含有1.5mM的氯金酸的硫酸溶液(0.3M)中，利用三電極系統(tǒng)在-0.1～0.2V的電位區(qū)間以50mV/s的掃速CV掃描10段，用去離子水沖洗玻碳電極，氮?dú)獯蹈?。在電極表面滴加5μL按照一定比例稀釋的Acrylamide-4-MPA抗體，在4℃孵育過夜以使其固定在電極表面。

3、上述方法制備的電極用去離子水沖洗，繼續(xù)滴加10μL BSA并放置在37℃恒溫水浴鍋2h進(jìn)行封閉，以消除非特異性吸附。然后用PBS緩沖液(0.01M pH7.4)反復(fù)沖洗干凈。最后將制備得到傳感器探針保存在4℃環(huán)境中備用。

實(shí)施例6

一種無標(biāo)記型丙烯酰胺電化學(xué)免疫傳感器，制備方法如下：

一、氧化石墨烯/銀納米復(fù)合物的制備：同實(shí)施例1。

二、無標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器的制備

1、電極的預(yù)處理：將玻碳電極用三氧化二鋁粉末在麂皮上拋光至鏡面，用去離子水沖洗干凈，移入超聲水浴中清洗3min；然后分別用1：1的HNO₃、無水乙醇和去離子水超聲各清洗5min。清洗好的電極用去離子水沖洗表面，氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

2、免疫傳感器的制備：將1mg GO/Ag超聲2h分散到2mL去離子水中，取200μL分散好的GO/Ag加入50μL濃度為0.1％的殼聚糖(CS)。斡旋震蕩混勻后，滴加上述GO/Ag/CS溶液5μL到經(jīng)過預(yù)處理的3mm直徑的玻碳電極表面，置于37℃烘箱中烘干。用去離子水沖洗修飾了GO/Ag/CS的玻碳電極，氮?dú)獯蹈珊笾糜?mL含有0.5mmol苯胺的硫酸溶液(0.4M)中，利用三電極系統(tǒng)(玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極)在0～1.0V的電位區(qū)間以100mV/s的掃速CV掃描20段，使玻碳電極表面生成聚苯胺納米線。用去離子水沖洗修飾了苯胺的玻碳電極，氮?dú)獯蹈伞Ｔ僦糜诮?jīng)氮?dú)獬?min的含有2mM的氯金酸的硫酸溶液(0.4M)中，利用三電極系統(tǒng)在-0.1～0.2V的電位區(qū)間以50mV/s的掃速CV掃描10段，用去離子水沖洗玻碳電極，氮?dú)獯蹈伞Ｔ陔姌O表面滴加5μL按照一定比例稀釋的Acrylamide-4-MPA抗體，在4℃孵育過夜以使其固定在電極表面。

3、上述方法制備的電極用去離子水沖洗，繼續(xù)滴加10μL BSA并放置在37℃恒溫水浴鍋2h進(jìn)行封閉，以消除非特異性吸附。然后用PBS緩沖液(0.01M pH 7.4)反復(fù)沖洗干凈。最后將制備得到傳感器探針保存在4℃環(huán)境中備用。