本申請(qǐng)是基于申請(qǐng)日為2011年12月27日，申請(qǐng)?zhí)枮?01180068588.9(pct/us2011/067397)，發(fā)明名稱為：“通過質(zhì)譜法定量胰島素”的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。相關(guān)專利申請(qǐng)案本申請(qǐng)要求2010年12月28日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)no.61/427,749的權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式整體并入本文以用于所有用途。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及胰島素的定量測(cè)量。在具體方面，本發(fā)明涉及通過質(zhì)譜法定量測(cè)量胰島素的方法。發(fā)明背景以下對(duì)發(fā)明背景的描述僅僅作為理解本發(fā)明的幫助而提供并不承認(rèn)是描述或組成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。胰島素是由表示為a鏈和b鏈，通過半胱氨酸殘基之間的二硫橋鍵連接的兩條鏈中的51個(gè)氨基酸組成的小肽。人胰島素的摩爾質(zhì)量為約5607.4amu。a鏈具有21個(gè)氨基酸而b具鏈有30個(gè)氨基酸。胰島素是對(duì)于調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪和類固醇代謝至關(guān)重要的激素。當(dāng)餐后血糖水平升高時(shí)，胰島素釋放至血流中并允許葡萄糖從循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中。胰島素生成或利用的缺陷導(dǎo)致糖尿病。常常施用胰島素治療糖尿病。糖尿病及其并發(fā)癥代表主要公共健康問題。因此，糖尿病和糖尿病前期患者樣品中胰島素的定量作為診斷工具和檢測(cè)患者治療均很重要。已將免疫學(xué)技術(shù)廣泛用于胰島素定量(參見例如，manley等，clinchem.,2007,53:922-32)，并且已經(jīng)報(bào)道了若干種檢測(cè)和/或定量胰島素的質(zhì)譜方法。參見例如，r.等，diabetes1997,46:44-50(報(bào)道了通過免疫親和色譜法-固相萃取-hplc-單一質(zhì)譜法定量血清樣品中的胰島素)；darby,s.m.等，j.analtoxicol2001,25:8-14(報(bào)道了高生理水平下對(duì)血漿中胰島素的spe-hplc-ms定量)；fierens,c.等，rapidcommun.massspectrom.2001,15:1433-41(報(bào)道了通過hplc-(esi)ms/ms檢測(cè)水溶液中的胰島素)；magnes,c.等，2004年5月第52次asms會(huì)議(報(bào)道了通過高分辨率/高精度質(zhì)譜法定量血清中的胰島素)；thevis,m.等，anal.chem.,2005,77:3579-85(報(bào)道了用于定量來自血漿的胰島素并檢測(cè)胰島素b鏈的免疫親和色譜法-固相萃取-hplc-串聯(lián)質(zhì)譜法)；thevis,m.等，anal.chem.,2006,77:3579-85和thomas,a.等，anal.chem.,2007,79:2518-24(報(bào)道了用于定量來自血漿的胰島素并檢測(cè)胰島素b鏈的固相萃取-免疫親和色譜法-固相萃取-hplc-串聯(lián)質(zhì)譜法)；uytfanghe,k.等，rapidcommmassspectrom.,2007,21:819-821(報(bào)道了用于定量來自血清的胰島素的免疫親和色譜法-固相萃取-hplc-串聯(lián)質(zhì)譜法)；rodríguez-cabaleiro,d.等，clinchem.,2007,53:1462-69(報(bào)道了用于定量來自血漿的胰島素并檢測(cè)胰島素b鏈的免疫親和色譜法-固相萃取-hplc-串聯(lián)質(zhì)譜法)；thevis,m.等，massspectrom.reviews,2008,27:35-50(報(bào)道了用于定量來自血漿的胰島素并檢測(cè)胰島素b鏈的免疫親和色譜法-固相萃取-hplc-串聯(lián)質(zhì)譜法)；和guedes,s.,j.amsocmassspectrom,2009,20:1319-26。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種通過質(zhì)譜法測(cè)定樣品中胰島素的量的方法。在一個(gè)方面，所述方法利用串聯(lián)質(zhì)譜法。在一些串聯(lián)質(zhì)譜法實(shí)施方案中，所述方法用于測(cè)定取自人類時(shí)的生物樣品中胰島素的量。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括：(a)使樣品經(jīng)受固相萃取(spe)和高效液相色譜法(hplc)以由樣品獲得富含胰島素的成分；(b)在適合生成可通過質(zhì)譜法檢測(cè)的一種或多種胰島素離子的條件下使富集的胰島素經(jīng)受電離源；(c)通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定一種或多種胰島素離子的量，其中所述樣品在電離之前未經(jīng)受免疫純化。在這些實(shí)施方案中，使用步驟(c)中測(cè)定的所述一種或多種離子的量測(cè)定樣品中胰島素的量。在一些實(shí)施方案中，在正離子模式下電離之前使所述樣品經(jīng)受酸性條件。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，使所述樣品經(jīng)受酸性條件包括使富集的胰島素經(jīng)受甲酸。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，步驟(c)中測(cè)定的一種或多種離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為1162.5±0.5和968.9±0.5的離子的胰島素前體離子。在另外的相關(guān)實(shí)施方案中，步驟(c)中測(cè)定的一種或多種離子包括選自m/z為226.2±0.5和135.9±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在其它相關(guān)實(shí)施方案中，一種或多種碎片離子包括來自m/z為1162.5±0.5的胰島素前體離子的一種或多種碎片離子和來自m/z為968.9±0.5的胰島素前體離子的一種或多種碎片離子。在相關(guān)實(shí)施方案中，來自每種前體離子的一種或多種碎片離子包括選自m/z為226.2±0.5和135.9±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在一些實(shí)施方案中，在正離子模式下電離之前使所述樣品經(jīng)受堿性條件。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，使所述樣品經(jīng)受堿性條件包括使樣品經(jīng)受氨。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，步驟(c)中測(cè)定的一種或多種離子包括選自m/z為1453.8±0.5和1163.0±0.5的離子的胰島素前體離子。在另外的相關(guān)實(shí)施方案中，步驟(c)中測(cè)定的一種或多種離子包括選自m/z為226.2±0.5和135.9±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在其它相關(guān)實(shí)施方案中，一種或多種碎片離子包括來自m/z為1453.8的胰島素前體離子的一種或多種碎片離子和來自質(zhì)荷比為1163.0±0.5的胰島素前體離子的一種或多種碎片離子。在利用串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定樣品中胰島素的量的一些實(shí)施方案中，所述方法包括：(a)通過萃取技術(shù)使樣品中的胰島素富集；(b)使來自步驟(a)的純化胰島素經(jīng)受高效液相色譜法(hplc)以從樣品獲得富含胰島素的成分；(c)在適合生成可通過質(zhì)譜法檢測(cè)的胰島素前體離子的條件下使富集的胰島素經(jīng)受電離源，其中胰島素前體離子的m/z為1162.5±0.5；(d)在約40-70ev范圍內(nèi)的碰撞能下使胰島素前體離子經(jīng)受碰撞誘導(dǎo)解離以生成可通過質(zhì)譜法檢測(cè)的一種或多種碎片離子；以及(e)通過質(zhì)譜法測(cè)定一種或多種所述碎片離子的量。在這些實(shí)施方案中，步驟(e)中測(cè)定的離子的量與所述樣品中胰島素的量有關(guān)。在一些實(shí)施方案中，萃取技術(shù)為固相萃取(spe)。在一些實(shí)施方案中，在正離子模式下電離之前使所述樣品經(jīng)受酸性條件。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，使所述樣品經(jīng)受酸性條件包括使樣品經(jīng)受甲酸。在替代實(shí)施方案中，在電離之前使所述樣品經(jīng)受堿性條件。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，使所述樣品經(jīng)受堿性條件包括氨。在一些實(shí)施方案中，碰撞能在約40-60ev范圍內(nèi)，例如在約40-50ev范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，步驟(d)中生成的一種或多種碎片離子包括選自m/z為226.2±0.5和135.9±0.5的離子的一種或多種離子。在利用串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定取自人類時(shí)的生物樣品中胰島素的量的一些實(shí)施方案中，所述方法包括：(a)使樣品經(jīng)受適合由胰島素生成胰島素a鏈的條件；(b)使來自步驟(a)的樣品經(jīng)受固相萃取(spe)和高效液相色譜法(hplc)以獲得富含胰島素a鏈的成分；(c)在適合生成可通過質(zhì)譜法檢測(cè)的一種或多種胰島素a鏈離子的條件下使富集的胰島素a鏈經(jīng)受電離源；(d)通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定一種或多種胰島素a鏈離子的量。在這些實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的離子的量與所述樣品中胰島素的量有關(guān)。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，在正離子模式下電離之前使樣品經(jīng)受酸性條件。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，使樣品經(jīng)受酸性條件包括使所述樣品經(jīng)受甲酸。在一些實(shí)施方案中，在電離之前未經(jīng)化學(xué)修飾步驟(a)中生成的胰島素a鏈。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自m/z為1192.9±0.5和795.4±0.5的離子的胰島素a鏈前體離子。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自m/z為513.0±0.5、399.0±0.5、236.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括來自m/z為1192.9±0.5的胰島素a鏈前體離子的一種或多種碎片離子和來自m/z為795.4±0.5的胰島素a鏈前體離子的一種或多種碎片離子。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，來自每種前體離子的所述一種或多種碎片離子包括選自m/z為513.0±0.5、399.0±0.5、236.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在替代實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在電離之前化學(xué)修飾步驟(a)中生成的胰島素a鏈。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)修飾包括烷基化胰島素a鏈。在另外的相關(guān)實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的一種或多種離子包括選自m/z為1306.0±0.5和871.0±0.5的離子的烷基化胰島素a鏈前體離子。在其它相關(guān)實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的一種或多種離子包括選自m/z為570.0±0.5、456.0±0.5、293.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在其它相關(guān)實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的一種或多種離子包括來自m/z為1306.0±0.5的烷基化胰島素a鏈前體離子的一種或多種碎片離子和來自m/z為871.0±0.5的烷基化胰島素a鏈前體離子的一種或多種碎片離子。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，來自每種烷基化前體離子的一種或多種碎片離子包括選自m/z為570.0±0.5、456.0±0.5、293.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，利用串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生物樣品中胰島素的量。在這些實(shí)施方案中，所述方法包括：(a)使樣品經(jīng)受適合由胰島素生成胰島素b鏈的條件；(b)處理來自步驟(a)的樣品以獲得富含胰島素b鏈的成分；(c)在適合生成可通過質(zhì)譜法檢測(cè)的一種或多種胰島素b鏈離子的條件下使富集的胰島素b鏈經(jīng)受電離源；(d)通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定一種或多種胰島素b鏈離子的量。在這些實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的離子的量與樣品中胰島素的量有關(guān)。在一些實(shí)施方案中，步驟(b)的處理包括通過固相萃取(spe)、高效液相色譜法(hplc)或二者使胰島素b鏈富集。在使用spe和hplc的一些相關(guān)實(shí)施方案中，兩種富集技術(shù)可以在線方式進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，生物樣品包括人血漿或血清樣品。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，當(dāng)取自人類時(shí)，測(cè)定的胰島素的量是樣品中存在的胰島素的量。在一些實(shí)施方案中，電離源是電噴霧電離(esi)源，例如加熱esi源。在一些實(shí)施方案中，在正離子模式下電離之前使樣品經(jīng)受酸性條件。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，使樣品經(jīng)受酸性條件包括使所述樣品經(jīng)受甲酸。在一些實(shí)施方案中，在電離之前未經(jīng)化學(xué)修飾胰島素b鏈。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的一種或多種離子包括選自m/z為1144.2±0.5、858.3±0.5和686.8±0.5的離子的胰島素b鏈前體離子。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的一種或多種離子包括選自m/z為906.0±0.5、825.0±0.5、768.5±0.5、753.0±0.5、703.0±0.5、345.0±0.5和226.2±0.5的離子，例如m/z為768.5±0.5、753.0±0.5、345.0±0.5和226.2±0.5的離子，例如m/z為768.5±0.5和753.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在一些實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的一種或多種離子包括選自以下的兩種或更多種碎片離子：來自m/z為1144.2±0.5的胰島素b鏈前體離子的碎片離子，來自m/z為858.3±0.5的胰島素b鏈前體離子的碎片離子和來自m/z為686.8±0.5的胰島素b鏈前體離子的碎片離子。在一些實(shí)施方案中，串聯(lián)質(zhì)譜法包括生成質(zhì)荷比(m/z)為686.8±0.5的人胰島素b鏈前體離子并將前體離子破碎成選自m/z為906.0±0.5、825.0±0.5、768.5±0.5、753.0±0.5、703.0±0.5、345.0±0.5和226.2±0.5的離子的一種或多種碎片離子，例如選自768.5±0.5和753.0±0.5的一種或多種碎片離子。在一些實(shí)施方案中，串聯(lián)質(zhì)譜法包括以在10-25v范圍內(nèi)且包括10v和25v的碰撞能破碎前體離子。在替代實(shí)施方案中，在電離之前化學(xué)修飾胰島素b鏈。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)修飾包括烷基化所述胰島素b鏈。在一些實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的一種或多種離子包括選自m/z為1181.9±0.5、886.9±0.5和709.8±0.5的離子的烷基化胰島素b鏈前體離子。在一些實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的一種或多種離子包括選自m/z為345.0±0.5和226.2±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在一些實(shí)施方案中，步驟(d)中測(cè)定的一種或多種離子包括選自以下的兩種或更多種碎片離子：來自質(zhì)荷比(m/z)為1181.9±0.5的烷基化胰島素b鏈前體離子的碎片離子，來自m/z為886.9±0.5的烷基化胰島素b鏈前體離子的碎片離子和來自m/z為709.8±0.5的烷基化胰島素b鏈前體離子的碎片離子。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，來自每種前體離子的碎片離子包括選自m/z為345.0±0.5和226.2±0.5的離子的離子。在第二方面，本文提出的某些方法利用高分辨率/高精度質(zhì)譜法來測(cè)定樣品中胰島素的量。在利用高分辨率/高精度質(zhì)譜法的一些實(shí)施方案中，所述方法包括：(a)在適合生成多電荷胰島素離子的條件下，使來自樣品的胰島素經(jīng)受電離源，其中可通過質(zhì)譜法檢測(cè)胰島素離子；以及(b)通過高分辨率/高精度質(zhì)譜法測(cè)定一種或多種多電荷胰島素離子的量。在這些實(shí)施方案中，步驟(b)中測(cè)定的一種或多種離子的量與樣品中胰島素的量有關(guān)。在一些實(shí)施方案中，在10,000或更高的fwhm和50ppm的質(zhì)量精度下進(jìn)行高分辨率/高精度質(zhì)譜法。在一些實(shí)施方案中，用高分辨率/高精度飛行時(shí)間(tof)質(zhì)譜儀進(jìn)行所述高分辨率/高精度質(zhì)譜法。在一些實(shí)施方案中，電離條件包括在酸性條件下電離胰島素。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，酸性條件包括在電離之前用甲酸處理所述樣品。在一些實(shí)施方案中，多電荷胰島素離子選自4+、5+和6+電荷胰島素離子。在一些實(shí)施方案中，一種或多種呈6+電荷態(tài)的胰島素離子包括m/z在約968.0±1.5范圍內(nèi)的一種或多種離子。一種或多種呈6+電荷態(tài)的胰島素離子包括選自m/z為968.28±0.1、968.45±0.1、968.62±0.1、968.79±0.1、968.95±0.1、969.12±0.1、969.28±0.1、969.45±0.1、969.61±0.1的離子的一種或多種離子；例如m/z為968.95±0.1的離子。在一些實(shí)施方案中，一種或多種呈5+電荷態(tài)的胰島素離子包括m/z在約1162.5±1.0范圍內(nèi)的一種或多種離子。在一些實(shí)施方案中，一種或多種呈5+電荷態(tài)的胰島素離子包括選自m/z為1161.72±0.1、1161.92±0.1、1162.12±0.1、1162.32±0.1、1162.52±0.1、1162.72±0.1、1162.92±0.1、1163.12±0.1和1163.32±0.1的離子的一種或多種離子；例如m/z為1162.54±0.1的離子。在一些實(shí)施方案中，一種或多種呈4+電荷態(tài)的胰島素離子包括m/z在約1452.9±0.8范圍內(nèi)的一種或多種離子。在本文所述任何方法中，樣品可包括生物樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品可包括生物流體，例如尿、血漿或血清。在一些實(shí)施方案中，生物樣品可包括來自人類的樣品；例如來自成年男性或女性，或青少年男性或女性，其中青少年在18歲以下，15歲以下，12歲以下或10歲以下?？煞治鋈祟悩悠芬栽\斷或監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)或病狀，或監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)或病狀治療的療效。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，本文所述方法可用于測(cè)定取自人類時(shí)的生物樣品中胰島素的量。在利用串聯(lián)質(zhì)譜法的實(shí)施方案中，可通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜法，包括例如多反應(yīng)監(jiān)測(cè)、前體離子掃描或產(chǎn)物離子掃描。在一些實(shí)施方案中，串聯(lián)質(zhì)譜法包括將前體離子破碎成一種或多種碎片離子。在測(cè)定兩種或更多種碎片離子的量的實(shí)施方案中，可使所述量進(jìn)行本領(lǐng)域已知的任何數(shù)學(xué)運(yùn)算以便使測(cè)量的離子量與樣品中胰島素的量相關(guān)。例如，可對(duì)兩種或更多種碎片離子的量求合以作為測(cè)定樣品中胰島素的量的一部分。在本文所述任何方法中，可在電離之前通過高效液相色譜法(hplc)從樣品中純化目標(biāo)分析物(例如，胰島素、經(jīng)化學(xué)修飾或未經(jīng)修飾的胰島素a鏈或經(jīng)化學(xué)修飾或未經(jīng)修飾的胰島素b鏈)。在本文所述任何方法中，可通過萃取技術(shù)，例如使樣品經(jīng)由固相萃取(spe)柱，從樣品中純化目標(biāo)分析物。在一些實(shí)施方案中，萃取技術(shù)不是免疫純化技術(shù)。具體地，在一些實(shí)施方案中，spe柱不是免疫親和柱。在一些實(shí)施方案中，在所述方法的任何時(shí)候都不適用免疫純化。在一些實(shí)施方案中，可以在線方式進(jìn)行萃取技術(shù)和hplc以允許自動(dòng)化樣品處理和分析。在一些實(shí)施方案中，在大于或等于約10,000，例如大于或等于約15,000，例如大于或等于約20,000，例如大于或等于約25,000的分辨力(fwhm)下進(jìn)行高分辨率/高精度質(zhì)譜法。在一些實(shí)施方案中，在小于或等于約50ppm，例如小于或等于約20ppm，例如小于或等于約10ppm，例如小于或等于約5ppm，例如小于或等于約3ppm的精度下進(jìn)行高分辨率/高精度質(zhì)譜法。在一些實(shí)施方案中，在大于或等于約10,000的分辨力(fwhm)和小于或等于約50ppm的精度下進(jìn)行高分辨率/高精度質(zhì)譜法。在一些實(shí)施方案中，分辨力大于約15,000而精度小于或等于約20ppm。在一些實(shí)施方案中，分辨力大于或等于約20,000而精度小于或等于約10ppm；優(yōu)選分辨力大于或等于約20,000而精度小于或等于約5ppm，例如小于或等于約3ppm。在一些實(shí)施方案中，用軌道阱質(zhì)譜儀、飛行時(shí)間(tof)質(zhì)譜儀或傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(有時(shí)稱為傅里葉變換質(zhì)譜儀)進(jìn)行高分辨率/高精度質(zhì)譜法。在一些實(shí)施方案中，可通過高分辨率/高精度質(zhì)譜法檢測(cè)的所述一種或多種胰島素離子是選自m/z在約1452.9±0.8、1162.5±1和968.8±1.5范圍內(nèi)的離子的一種或多種離子。這些范圍內(nèi)的離子分別對(duì)應(yīng)帶4+、5+和6+電荷的胰島素離子。帶這些電荷的單一同位素離子主要屬于所提及的m/z范圍。然而，低豐度天然同位素變體可能出現(xiàn)在這些范圍外。1162.5±1范圍內(nèi)的胰島素離子優(yōu)選包括m/z為約1161.72±0.1、1161.92±0.1、1162.12±0.1、1162.32±0.1、1162.52±0.1、1162.72±0.1、1162.92±0.1、1163.12±0.1、1163.32±0.1的胰島素離子；例如m/z為1162.54±0.1的離子。968.8±1.5范圍內(nèi)的胰島素離子優(yōu)選包括m/z為約968.28±0.1、968.45±0.1、968.62±0.1、968.79±0.1、968.95±0.1、969.12±0.1、969.28±0.1、969.45±0.1、969.61±0.1的胰島素離子；例如m/z為968.95±0.1的離子。在一些實(shí)施方案中，將通過質(zhì)譜法檢測(cè)的一種或多種胰島素離子的量與樣品中胰島素蛋白的量聯(lián)系起來包括與內(nèi)標(biāo)比較；例如人或非人類胰島素蛋白?？扇芜x地用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)。在本文提出的任何方法中，樣品可包括生物樣品；優(yōu)選體液樣品，包括(例如)血漿或血清?？稍谡娮幽Ｊ较逻M(jìn)行質(zhì)譜法(串聯(lián)或高分辨率/高精度)。或者，可在負(fù)電子模式下進(jìn)行質(zhì)譜法?？墒褂酶鞣N電離源，包括(例如)大氣壓化學(xué)電離(apci)或電噴霧電離(esi)源電離胰島素。在一些實(shí)施方案中，在正電子模式下通過esi電離胰島素和/或經(jīng)化學(xué)修飾或未經(jīng)修飾的胰島素a鏈或胰島素b鏈。在本文提出的任何方法中，可在樣品中提供可單獨(dú)檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)，也測(cè)定了樣品中內(nèi)標(biāo)的量。在利用可單獨(dú)檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)的實(shí)施方案中，電離樣品中存在的全部或部分目標(biāo)分析物和內(nèi)標(biāo)以生成在質(zhì)譜儀中可檢測(cè)的多種離子，并通過質(zhì)譜法檢測(cè)各自生成的一種或多種離子。在這些實(shí)施方案中，可通過與檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)離子的量作比較，使目標(biāo)分析物生成的離子的存在或量與樣品中目標(biāo)分析物的存在或量相關(guān)。或者，可通過與一種或多種外部參考標(biāo)準(zhǔn)作比較測(cè)定樣品中胰島素的量。示例性外部參考標(biāo)準(zhǔn)包括用人或非人類胰島素、合成胰島素類似物或其同位素標(biāo)記變體示蹤的空白血漿或血清。在一些實(shí)施方案中，所述方法能夠測(cè)定樣品中在約10μiu/ml至500μiu/ml(等于約60pmol/l至3000pmol/l，或約0.35ng/ml至17.4ng/ml)，包括10μiu/ml和500μiu/ml范圍內(nèi)的水平的胰島素的量。如本文所使用，除非另有說明，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物。因此，例如，提到“一種蛋白質(zhì)”包括多個(gè)蛋白質(zhì)分子。如本文所使用，術(shù)語“純化”和“富集(enriching)”并不指從樣品中去除除目標(biāo)分析物外的所有物質(zhì)。相反，這些術(shù)語指使一種或多種目標(biāo)分析物的量相對(duì)于樣品中可能干擾目標(biāo)分析物的檢測(cè)的其它組分富集的過程。通過各種方式純化樣品可使一種或多種干擾物質(zhì)，例如可能或可能不干擾通過質(zhì)譜法檢測(cè)所選母離子或子離子的一種或多種物質(zhì)相對(duì)減少。當(dāng)使用該術(shù)語時(shí)，相對(duì)減少不需要通過純化完全去除待純化材料中與目標(biāo)分析物一起存在的任何物質(zhì)。如本文所使用，術(shù)語“免疫純化”指利用抗體，包括多克隆或單克隆抗體，使所述一種或多種目標(biāo)分析物富集的純化過程?？墒褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的免疫純化方法進(jìn)行免疫純化。通常，免疫純化過程利用結(jié)合、偶聯(lián)或以其它方式附著于載體，例如柱、孔、管、凝膠、膠囊、顆粒等的抗體。如本文所使用的免疫純化包括但不限于本領(lǐng)域中常稱為免疫沉淀的過程，以及本領(lǐng)域中常稱為親和色譜法或免疫親和色譜法的過程。如本文所使用，術(shù)語“免疫顆?！敝赣锌贵w結(jié)合、偶聯(lián)或以其它方式附著于其表面(顆粒上和/或內(nèi))的膠囊、珠粒、凝膠顆粒等。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫顆粒為瓊脂糖凝膠或瓊脂糖珠。在替代性優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫顆粒包括玻璃珠、塑料珠或硅珠或硅膠。如本文所使用，術(shù)語“抗胰島素抗體”指對(duì)胰島素有親和力的任何多克隆或單克隆抗體。在各個(gè)實(shí)施方案中胰島素抗體對(duì)除胰島素外的化學(xué)物類的特異性可能不同；例如在某些優(yōu)選實(shí)施方案中抗胰島素抗體對(duì)胰島素有特異性，因此對(duì)除胰島素外的其它化學(xué)物類有很少或沒有親和力，而在其它優(yōu)選實(shí)施方案中抗胰島素抗體無特異性，因此結(jié)合除胰島素外的某些化學(xué)物類。如本文所使用，術(shù)語“樣品”指可能含有目標(biāo)分析物的任何樣品。如本文所使用，術(shù)語“體液”指可從各個(gè)體內(nèi)分離的任何流體。例如，“體液”可包括血液、血漿、血清、膽汁、唾液、尿、眼淚、汗等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品包括來自人類的體液樣品；優(yōu)選血漿或血清。如本文所使用，術(shù)語“固相萃取”或“spe”指由于溶于或懸浮于溶液(即，流動(dòng)相)中的組分對(duì)溶液通過或圍繞的固體(即，固相)的親和力，使化學(xué)混合物分離成組分的過程。在一些情況下，當(dāng)流動(dòng)相通過或圍繞固相時(shí)，固相可保留流動(dòng)相不需要的組分，導(dǎo)致對(duì)流動(dòng)相中分析物的純化。在其它情況下，固相可保留分析物，使流動(dòng)相不需要的組分通過或圍繞固相。在這些情況下，然后使用第二流動(dòng)相將保留的分析物從固相洗脫做進(jìn)一步處理或分析。spe，包括tflc，可通過單一或混合模式機(jī)制操作?；旌夏Ｊ綑C(jī)制利用相同柱中的離子交換和疏水保留；例如，混合模式spe柱的固相可表現(xiàn)出強(qiáng)的陰離子交換和疏水保留；或可表現(xiàn)出強(qiáng)的陽離子交換和疏水保留。通常，spe柱填充材料對(duì)分析物的親和力可能是由于多種機(jī)制中的任一種，例如一種或多種化學(xué)相互作用或免疫親和性相互作用。在一些實(shí)施方案中，不使用免疫親和柱填充材料進(jìn)行胰島素的spe。即，在一些實(shí)施方案中，用不是免疫親和柱的spe柱從樣品中純化胰島素。如本文所使用，術(shù)語“色譜法”指由于化學(xué)實(shí)體在固定液或固相周圍或上面流動(dòng)時(shí)，化學(xué)實(shí)體的差異性分布，使液體或氣體攜帶的化學(xué)混合物分離成組分的過程。如本文所使用，術(shù)語“液相色譜法”或“l(fā)c”指流體均勻地滲過細(xì)碎物質(zhì)柱或滲過毛細(xì)管通道時(shí)，選擇性阻滯流體溶液的一種或多種組分的過程。阻滯是由該流體相對(duì)于固定相移動(dòng)時(shí)，混合物組分分布于(多個(gè))固定相和體相流體(即，流動(dòng)相)之間引起?！耙合嗌V法”的實(shí)例包括反相液相色譜法(rplc)、高效液相色譜法(hplc)和湍流液相色譜法(tflc)(有時(shí)稱為高湍流液相色譜法(htlc)或高通量液相色譜法)。如本文所使用，術(shù)語“高效液相色譜法”或“hplc”(有時(shí)稱為“高壓液相色譜法”)指通過在壓力下迫使流動(dòng)相通過固定相，通常為密集填充柱，提高分離程度的液相色譜法。如本文所使用，術(shù)語“湍流液相色譜法”或“tflc”(有時(shí)稱為高湍流液相色譜法或高通量液相色譜法)指利用通過柱填充物的測(cè)定材料湍流作為進(jìn)行分離的基礎(chǔ)的一種色譜法形式。已經(jīng)應(yīng)用tflc在通過質(zhì)譜法分析之前制備含有兩種不知名藥物的樣品。參見例如，zimmer等，jchromatogra854:23-35(1999)；同樣參見美國(guó)專利no.5,968,367、5,919,368、5,795,469和5,772,874，其進(jìn)一步對(duì)tflc進(jìn)行了闡述。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解“湍流”。當(dāng)流體緩慢平穩(wěn)地流動(dòng)時(shí)，將所述流稱為“層流”例如，以低流速穿過hplc柱的流體為層狀。在層流中，流體顆粒的運(yùn)動(dòng)有序配合通常呈大體直線移動(dòng)的顆粒。在更快的速率下，水的慣性克服流體摩擦力并導(dǎo)致湍流。未接觸不規(guī)則邊界的流體“超過”因摩擦減緩或因粗糙表面偏離的流體。當(dāng)流體湍急地流動(dòng)時(shí)，流體呈旋轉(zhuǎn)渦流流動(dòng)(漩渦)，“拖曳力”比所述流為層狀時(shí)更大。當(dāng)流體流為層狀或湍流時(shí)，許多參考可用于幫助測(cè)定(例如，turbulentflowanalysis:measurementandprediction,p.s.bernard&j.m.wallace,johnwiley&sons,inc.,(2000)；anintroductiontoturbulentflow,jeanmathieu&julianscott,cambridgeuniversitypress(2001))。如本文所使用，術(shù)語“氣相色譜法”或“gc”指汽化樣品混合物并注入穿過含有由液體或固體微粒構(gòu)成的固定相的柱的運(yùn)載氣體流(如氮?dú)饣蚝?中，并且根據(jù)化合物對(duì)固定相的親和力分離成器組成化合物的色譜法。如本文所使用，術(shù)語“大顆粒柱”或“萃取柱”指含有平均粒徑大于約50μm的色譜法。如該上下文中所使用，術(shù)語“約”指±10％。如本文所使用，術(shù)語“分析柱”指具有足夠色譜板以實(shí)現(xiàn)樣品中從柱上洗脫的物質(zhì)的分離，足以允許測(cè)定分析物的存在或量的色譜柱。常常將此類柱與“萃取柱”加以區(qū)別，“萃取柱”具有從非保留物質(zhì)中分離或萃取保留物質(zhì)以便獲得純化樣品做進(jìn)一步分析的通用用途。如該上下文中所使用，術(shù)語“約”指±10％。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，分析柱含有直徑約5μm的顆粒。如本文所使用，如在“在線自動(dòng)化形式”或“在線萃取”中使用的術(shù)語“在線(on-line)”和“在線(inline)”指不需要操作員干預(yù)而進(jìn)行的過程。相反，如本文所使用的術(shù)語“離線(off-line)”指需要操作員人工干預(yù)的過程。因此，如果使樣品沉淀，然后將上清液手動(dòng)加載至自動(dòng)取樣器中，沉淀和加載步驟與后續(xù)步驟離線。在所述方法的各個(gè)實(shí)施方案中，可以在線自動(dòng)化形式進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)步驟。如本文所使用，術(shù)語“質(zhì)譜法”或“ms”指通過其質(zhì)量鑒定化合物的分析技術(shù)。ms指基于其質(zhì)荷比或“m/z”過濾、檢測(cè)和測(cè)量的方法。ms技術(shù)通常包括(1)電離化合物以形成帶電化合物；和(2)檢測(cè)帶電化合物的分子量并計(jì)算質(zhì)荷比?？赏ㄟ^任何適合方式電離并檢測(cè)化合物?！百|(zhì)譜儀”通常包括離子發(fā)生器、質(zhì)量分析器和離子檢測(cè)器。一般而言，電離一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)分子，并且隨后將離子引入質(zhì)譜儀中，其中由于磁場(chǎng)和電場(chǎng)的組合，離子在空間上跟隨取決于質(zhì)量(“m”)和電荷(“z”)的途徑。參見例如，標(biāo)題為“massspectrometryfromsurfaces”的美國(guó)專利no.6,204,500；標(biāo)題為“methodsandapparatusfortandemmassspectrometry”的美國(guó)專利no.6,107,623；標(biāo)題為“dnadiagnosticsbasedonmassspectrometry”的美國(guó)專利no.6,268,144；標(biāo)題為“surface-enhancedphotolabileattachmentandreleasefordesorptionanddetectionofanalytes”的美國(guó)專利no.6,124,137；wright等，prostatecancerandprostaticdiseases1999,2:264-76；和merchant和weinberger，electrophoresis2000,21:1164-67。如本文所使用，“高分辨率/高精度質(zhì)譜法”指用能夠以足夠精確性和精度測(cè)量帶電物類的質(zhì)荷比以確認(rèn)獨(dú)特化學(xué)離子的質(zhì)量分析器進(jìn)行的質(zhì)譜法。當(dāng)來自該離子的各個(gè)同位素峰易于辨別時(shí)，對(duì)于離子而言可能確認(rèn)獨(dú)特化學(xué)離子。確認(rèn)獨(dú)特化學(xué)離子所必需的特定分辨力和質(zhì)量精度隨離子的質(zhì)量和電荷態(tài)變化。如本文所使用，術(shù)語“分辨力”或“分辨力(fwhm)”(在本領(lǐng)域中也稱為“m/δm50％”)指觀察到的質(zhì)荷比除以50％最大高度的質(zhì)量峰寬度(半峰全寬，“fwhm”)。圖1a-c中說明了分辨力差異的影響，其示出了m/z為約1093的離子的理論質(zhì)譜。圖1a示出了來自分辨力為約3000(常規(guī)四極質(zhì)量分析器的典型操作條件)的質(zhì)量分析器的理論質(zhì)譜。如圖1a所見，各個(gè)同位素峰不可辨別。通過比較，圖1b示出了來自分辨力為約10,000的質(zhì)量分析器的理論質(zhì)譜，各個(gè)同位素峰清晰可辨別。圖1c示出了來自分辨力為約12,000的質(zhì)量分析器的理論質(zhì)譜。在這個(gè)最高分辨力下，各個(gè)同位素峰包含小于1％的自基線的貢獻(xiàn)。如本文所使用，關(guān)于質(zhì)譜法的“獨(dú)特化學(xué)離子”指具有單一原子構(gòu)成的單離子。單離子可能帶單個(gè)或多個(gè)電荷。如本文所使用，關(guān)于質(zhì)譜法的“精度”(或“質(zhì)量精度”)指儀器響應(yīng)與調(diào)查離子的真實(shí)m/z的可能偏差。通常將精度表示為百萬分之幾(ppm)。圖2a-d說明了質(zhì)量精度差異的影響，其示出了對(duì)于m/z為1093.52094的理論峰值而言，測(cè)得m/z和實(shí)際m/z之間的可能差異界限。圖2a示出了120ppm精度下測(cè)得m/z的可能范圍。相反，圖2b示出了50ppm精度下測(cè)得m/z的可能范圍。圖2c和2d示出了20ppm和10ppm精度下測(cè)得m/z甚至更窄的可能范圍?？稍谀軌蛞源笥?0,000、15,000、20,000、25,000、50,000、100,000或甚至更高的fwhm進(jìn)行質(zhì)量分析的儀器上進(jìn)行本發(fā)明的高分辨率/高精度質(zhì)譜法。同樣，可在能夠以小于50ppm、20ppm、15ppm、10ppm、5ppm、3ppm或甚至更低的精度進(jìn)行質(zhì)量分析的儀器上進(jìn)行本發(fā)明的方法。有這些性能特征的儀器可并入某些軌道阱質(zhì)量分析器、飛行時(shí)間(“tof”)質(zhì)量分析器或傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)量分析器。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用包括軌道阱質(zhì)量分析器或tof質(zhì)量分析器的儀器進(jìn)行所述方法。術(shù)語“軌道阱”描述了由桶形外電極和同軸內(nèi)電極組成的離子阱。將離子切線注入電極之間的電場(chǎng)中并且因?yàn)楫?dāng)離子沿同軸內(nèi)電極軌道運(yùn)行時(shí)，離子和電極之間的靜電相互作用被離心力平衡而捕獲離子。當(dāng)離子沿同軸內(nèi)電極軌道運(yùn)行時(shí)，捕獲離子的軌跡在相對(duì)于離子質(zhì)荷比的諧振頻率下沿中心電極的軸振蕩。檢測(cè)軌道振蕩頻率允許將軌道阱用作具有高精度(低至1-2ppm)和高分辨力(fwhm)(高達(dá)約200,000)的質(zhì)量分析器。在以引用方式整體并入本文的美國(guó)專利no.6,995,364中詳細(xì)描述了基于軌道阱的質(zhì)量分析器。已經(jīng)報(bào)道使用軌道阱分析器進(jìn)行各種分析物的定性和定量分析。參見例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公布no.2008/0118932(2007年11月9日提交)；等，rapidcommun.massspectrom.，2008，22:477-485；lebreton等，rapidcommun.massspectrom.，2008，22:3130-36；thevis等，massspectrom.reviews，2008，27:35-50；thomas等，j.massspectrom.，2008，43:908-15；schenk等，bmcmedicalgenomics，2008，1:41；和olsen等，naturemethods，2007，4:709-12。如本文所使用，術(shù)語“在負(fù)離子模式下操作”指生成并檢測(cè)負(fù)離子的那些質(zhì)譜法。如本文所使用，術(shù)語“在正離子模式下操作”指生成并檢測(cè)正離子的那些質(zhì)譜法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜法。如本文所使用，術(shù)語“電離”指生成具有等于一個(gè)或多個(gè)電子單位的凈電荷的分析物離子的過程。負(fù)離子是具有一個(gè)或多個(gè)電子單位的凈負(fù)電荷的離子，而正離子是具有一個(gè)或多個(gè)電子單位的凈正電荷的離子。如本文所使用，術(shù)語“電子電離”或“ei”指氣相或汽相中的目標(biāo)分析物與電子流相互作用的方法。電子與分析物的碰撞生成然后可進(jìn)行質(zhì)譜技術(shù)的分析物離子。如本文所使用，術(shù)語“化學(xué)電離”或“ci”指試劑氣體(例如氨)經(jīng)受電子碰撞，并且通過試劑氣體離子和分析物分子的相互作用形成分析物離子的方法。如本文所使用，術(shù)語“快原子轟擊”或“fab”指一束高能原子(常常為xe或ar)碰撞非揮發(fā)性樣品，解吸附并電離樣品中所含的分子的方法。將試樣溶于粘性液體基質(zhì)，例如甘油、硫代甘油、間硝基芐醇、18-冠-6-冠醚、2-硝基苯基辛基醚、環(huán)丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。為化合物或樣品選擇適當(dāng)?shù)幕|(zhì)是經(jīng)驗(yàn)性過程。如本文所使用，術(shù)語“基質(zhì)輔助激光解吸電離”或“maldi”指將非揮發(fā)性樣品暴露于激光照射，通過各種電離途徑，包括光致電離、質(zhì)子化、去質(zhì)子化和集團(tuán)衰變，解吸附并電離樣品中的分析物的方法。對(duì)于maldi而言，將樣品與吸能基質(zhì)混合，促進(jìn)分析物分子的解吸附。如本文所使用，術(shù)語“表面增強(qiáng)激光”解吸電離”或“seldi”指將非揮發(fā)性樣品暴露于激光照射，通過各種電離途徑，包括光致電離、質(zhì)子化、去質(zhì)子化和集團(tuán)衰變，解吸附并電離樣品中的分析物的另一種方法。對(duì)于seldi而言，通常使樣品與優(yōu)先保留一種或多種目標(biāo)分析物的表面結(jié)合。與maldi一樣，這個(gè)過程也可采用吸能材料促進(jìn)電離。如本文所使用，術(shù)語“電噴霧電離”或“esi”指使溶液沿末端施加了高正或負(fù)電位的長(zhǎng)度較短的毛細(xì)管通過的方法。使到達(dá)管末端的溶液蒸發(fā)(霧化)成于溶劑蒸汽中非常小的溶液液滴射流或噴霧。這種霧滴流過蒸發(fā)室。當(dāng)液滴變小時(shí)，電氣表面電荷密度增大，直至相同電荷之間的自然排斥引起離子以及中性分子被釋放。如本文所使用，術(shù)語“大氣壓化學(xué)電離”或“apci”指類似于esi的質(zhì)譜法；然而，apci通過在大氣壓下血漿內(nèi)發(fā)生的離子-分子反應(yīng)生成離子。通過噴霧毛細(xì)管和對(duì)電極之間的放電保持血漿。然后通常通過使用一組差動(dòng)泵送撇渣器階段將離子萃取至質(zhì)量分析器中?？墒褂媚媪鞯母稍镱A(yù)熱n2氣體提高溶劑的去除。apci中的氣相電離可比esi分析低極性物類更有效。如本文所使用，術(shù)語“大氣壓光致電離”或“appi”指分子m電離的機(jī)制是光子吸收和電子發(fā)射以形成分子離子m+的質(zhì)譜法形式。因?yàn)楣庾幽芰客ǔH高于電離電位，所以分子離子不易受解離影響。在許多情況下，分析樣品可能不需要色譜法，從而節(jié)約了大量時(shí)間和費(fèi)用。在水蒸汽或質(zhì)子溶劑存在下，分子離子可吸取h形成mh+。這往往在m具有高質(zhì)子親和力時(shí)發(fā)生。因?yàn)閙+和mh+的總和為常數(shù)，所以這并不影響定量精度。通常觀察到質(zhì)子溶劑中的藥物化合物為mh+，然而非極性化合物，例如萘或睪酮通常形成m+。參見例如，robb等，anal.chem.2000,72(15):3653-3659。如本文所使用，術(shù)語“電感耦合等離子體”或“icp”指在足夠高的溫度下，樣品與部分電離氣體相互作用，以致大部分元素分裂為原子并電離的方法。如本文所使用，術(shù)語“場(chǎng)解吸”指將非揮發(fā)性試樣置于電離表面，并使用強(qiáng)電場(chǎng)生成分析物離子的方法。如本文所使用，術(shù)語“解吸”指將分析物從分析物的表面和/或入口移至氣相中。激光解吸熱解吸是其中通過激光脈沖將含有分析物的樣品熱解吸至氣相中的技術(shù)。激光打中具有金屬底座的特制96孔板的背面。激光脈沖加熱底座并且熱量使樣品轉(zhuǎn)移至氣相中。然后將氣相樣品吸入質(zhì)譜儀中。如本文所使用，術(shù)語“選擇性離子監(jiān)測(cè)”是質(zhì)譜儀的一種檢測(cè)模式，其中僅檢測(cè)質(zhì)量范圍相對(duì)狹窄，通常約一個(gè)質(zhì)量單位的離子。如本文所使用，術(shù)語“多反應(yīng)模式”，有時(shí)稱為“選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)”，是質(zhì)譜儀的一種檢測(cè)模式，其中選擇性檢測(cè)前體離子和一種或多種碎片離子。如本文所使用，術(shù)語“量化下限”、“定量下限”或“l(fā)loq”指測(cè)量在數(shù)量上變得有意義的點(diǎn)。在這個(gè)loq的分析物反應(yīng)可識(shí)別、不連續(xù)并且可重現(xiàn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd％)小于20％并且精度為85％-115％。如本文所使用，術(shù)語“檢測(cè)限”或“l(fā)od”指測(cè)量值大于與之相關(guān)的不確定度的點(diǎn)。lod是值超過與之測(cè)量相關(guān)的不準(zhǔn)確度的點(diǎn)并且定義為零濃度下平均數(shù)rsd的3倍。如本文所使用，體液樣品中分析物的“量”通常指反映樣品體積中可檢測(cè)的分析物質(zhì)量的絕對(duì)值。然而，量也涵蓋與另一分析物量相比的相對(duì)量。例如，樣品中分析物的量可為大于樣品中一般存在的分析物的對(duì)照或正常水平的量。如本文所使用，關(guān)于定量測(cè)量(不高考離子質(zhì)量的測(cè)量)的術(shù)語“約”指指示值加上或減去10％。在測(cè)定指定分析物的質(zhì)量中，質(zhì)譜儀可稍有變化。在離子質(zhì)量或離子質(zhì)/荷比上下文中的術(shù)語“約”指+/-0.50個(gè)原子質(zhì)量單位。上述本發(fā)明的概述是非限制性的，通過以下對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見。附圖詳述圖1a-c示出了通過分辨力為約3000(圖1a)、約10,000(圖1b)和約12,000(圖1c)的質(zhì)量分析器分析的m/z為約1093的離子的理論質(zhì)譜。圖2a-d示出了在為1093.52094的m/z下，在120ppm質(zhì)量精度(圖2a)、50ppm質(zhì)量精度(圖2b)、20ppm質(zhì)量精度(圖2c)和10ppm質(zhì)量精度(圖2d)下，儀器反應(yīng)與研究理論峰值的離子的真實(shí)m/z的可能偏差。圖3a和b分別示出了在酸性和堿性條件下，通過esi離子正離子模式電離人胰島素收集的示例光譜。實(shí)施例3中描述了詳情。圖4a示出了用qtof質(zhì)譜儀生成的人胰島素約900-1200m/z范圍的示例光譜。圖4b示出了用qtof質(zhì)譜儀生成的來自反萃血清樣品基質(zhì)的污染物峰。實(shí)施例4中描述了詳情。圖5a示出了用qtof質(zhì)譜儀生成的人胰島素約1154-1177m/z范圍的示例性高分辨率/高精度光譜。圖5b示出了約1159-1166m/z范圍的展開圖。實(shí)施例4中描述了詳情。圖6a示出了用qtof質(zhì)譜儀生成的人胰島素約964-973m/z范圍的示例性高分辨率/高精度光譜。圖6b示出了約967-971m/z范圍的展開圖。實(shí)施例4中描述了詳情。圖7示出了用胰島素高分辨率/高精度ms測(cè)量的示蹤模擬血清標(biāo)準(zhǔn)中人胰島素定量的線性圖線。實(shí)施例4中描述了詳情。圖8示出了用胰島素高分辨率/高精度ms測(cè)量的示蹤反萃血清標(biāo)準(zhǔn)中人胰島素定量的線性圖線。實(shí)施例4中描述了詳情。圖9示出了顯示生成呈5+和6+電荷態(tài)的人胰島素的串聯(lián)質(zhì)譜q1掃描。實(shí)施例5中描述了詳情。圖10示出了顯示來自破碎呈6+電荷態(tài)的人胰島素前體離子的產(chǎn)物離子掃描。實(shí)施例5中討論了詳情。圖11示出了顯示來自破碎呈5+電荷態(tài)的人胰島素前體離子的產(chǎn)物離子掃描。實(shí)施例5中討論了詳情。圖12示出了在不同碰撞能下破碎6+和5+人胰島素前體離子生成的選擇碎片離子的相對(duì)強(qiáng)度。實(shí)施例5中討論了詳情。圖13示出了顯示兩種可能的人胰島素a鏈前體離子(呈2+和3+電荷態(tài))和兩種可能的人胰島素b鏈前體離子(呈3+和4+電荷態(tài))的復(fù)合光譜。實(shí)施例6中討論了詳情。圖14示出了顯示生成呈3+、4+和5+電荷態(tài)的可能人胰島素b鏈前體離子的串聯(lián)質(zhì)譜q1掃描。實(shí)施例6中描述了詳情。圖15示出了在不同碰撞能下破碎3+人胰島素a鏈前體離子生成的選擇碎片離子的相對(duì)強(qiáng)度。實(shí)施例6中討論了詳情。圖16示出了來自破碎呈4+電荷態(tài)的人胰島素b鏈前體離子的產(chǎn)物離子掃描。實(shí)施例6中討論了詳情。圖17示出了來自破碎呈3+電荷態(tài)的人胰島素b鏈前體離子的產(chǎn)物離子掃描。實(shí)施例10中討論了詳情。圖18示出了在不同碰撞能下破碎3+人胰島素b鏈前體離子生成的選擇碎片離子的相對(duì)強(qiáng)度。實(shí)施例10中討論了詳情。圖19示出了用于通過人胰島素b鏈的串聯(lián)質(zhì)譜法評(píng)估患者血清樣品中人胰島素的lloq的圖。實(shí)施例12中討論了詳情。圖20示出了用人胰島素b鏈的串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)量的示蹤反萃血清樣品中人胰島素定量的線性圖線。實(shí)施例13中描述了詳情。發(fā)明詳述描述了測(cè)定樣品中胰島素的量的方法。更具體地，描述了檢測(cè)并量化樣品中的胰島素的質(zhì)譜法。所述方法可利用固相萃取(spe)和/或液相色譜法(lc)，進(jìn)行所選分析物的純化，與質(zhì)譜法(ms)相結(jié)合，從而通過檢測(cè)并量化樣品中的胰島素的測(cè)定系統(tǒng)。優(yōu)選實(shí)施方案特別適合應(yīng)用于大型臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行自動(dòng)化胰島素量化測(cè)定。適合用于本發(fā)明方法中的試樣包括可能含有目標(biāo)分析物的任何試樣。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品為生物樣品；即，從任何生物來源，例如動(dòng)物、細(xì)胞培養(yǎng)物或器官培養(yǎng)物等獲得的樣品。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，從哺乳動(dòng)物，例如狗、貓、馬等獲得樣品。特別優(yōu)選的哺乳動(dòng)物為靈長(zhǎng)類動(dòng)物，最優(yōu)選男性或女性。優(yōu)選樣品包括體液，例如血液、血漿、血清、唾液、腦脊髓液或組織樣品；優(yōu)選血漿和血清。例如，此類樣品可從患者獲得；即，自身處于臨床環(huán)境下進(jìn)行疾病或病狀的診斷、預(yù)后或治療的活著的男人或女人。在樣品包括生物樣品的實(shí)施方案中，當(dāng)樣品從生物來源獲得時(shí)，可用所述方法測(cè)定樣品中胰島素的量。本發(fā)明還涵蓋用于胰島素定量測(cè)定的試劑盒。用于胰島素定量測(cè)定的試劑盒可包括包含本文提供的組合物的試劑盒。例如，試劑盒可包括包裝材料和測(cè)定量的同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)，量足以進(jìn)行至少一次測(cè)定。通常，試劑盒還將包括以有形形式記錄(例如，含于紙或電子媒介上)的使用包裝試劑用于胰島素定量測(cè)定的說明書。用于本發(fā)明實(shí)施方案中的校準(zhǔn)和qc混合血清優(yōu)選使用與預(yù)期樣品基質(zhì)相似的基質(zhì)制備，條件是基本上不存在胰島素。質(zhì)譜分析的樣品制備在對(duì)質(zhì)譜分析的準(zhǔn)備中，可通過本領(lǐng)域已知的各種方法，包括(例如)液相色譜法、過濾、離心、薄層色譜法(tlc)、電泳(包括毛細(xì)管電泳)、親和分離(包括免疫親和分離)、萃取法(包括乙酸乙酯或甲醇萃取)和使用離液劑或以上的組合等使胰島素相對(duì)于樣品中的一種或多種其它組分富集?？稍谫|(zhì)譜分析之前使用的一種樣品純化方法是在柱填充材料可逆性保留目標(biāo)分析物被，而不保留一種或多種其它物質(zhì)的條件下，將樣品施加到固相萃取(spe)柱上。這種技術(shù)中，可采用柱保留目標(biāo)分析物的第一流動(dòng)相條件，并且隨后可采用第二流動(dòng)相條件，以便一旦洗掉未保留的物質(zhì)就將保留的物質(zhì)從柱上去除。在一些實(shí)施方案中，樣品中的胰島素可被可逆性保留在具有包含烷基結(jié)合表面的填充材料的spe柱上。例如，在一些實(shí)施方案中，在質(zhì)譜分析之前可使用c-8在線spe柱(例如來自phenomenex,inc.的oasishlb在線spe柱/盒(2.1mm×20mm)或等效物)富集胰島素。在一些實(shí)施方案中，用hplc級(jí)0.2％含水甲酸作為洗滌液并使用0.2％于乙腈中的甲酸作為洗脫液進(jìn)行spe柱的使用。在一些實(shí)施方案中，不通過免疫親和技術(shù)純化胰島素。這些實(shí)施方案中的一些利用spe柱。在這些實(shí)施方案中，spe柱不是免疫親和柱。在其它實(shí)施方案中，所述方法包括在質(zhì)譜分析之前免疫純化胰島素?？墒褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的任何免疫純化方法進(jìn)行免疫純化步驟。常常免疫純化過程利用結(jié)合、偶聯(lián)或附著于載體，例如柱、孔、管、膠囊、顆粒等的抗體。通常，免疫純化方法包括(1)用抗體培養(yǎng)含有目標(biāo)分析物的樣品，以致分析物與抗體結(jié)合，(2)進(jìn)行有一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟，和(3)將分析物從抗體上洗脫。在某些實(shí)施方案中，用溶液中的游離抗體進(jìn)行免疫純化的培養(yǎng)步驟，隨后抗體在洗滌步驟之前結(jié)合或附著于固體表面。在某些實(shí)施方案中，這可使用為抗胰島素抗體的一次抗體和附著于對(duì)一次抗胰島素抗體有親和力的固體表面的二次抗體完成。在替代實(shí)施方案中，在培養(yǎng)步驟之前，一次抗體與固體表面結(jié)合。適當(dāng)?shù)妮d體包括但不限于管、載玻片、柱、珠粒、膠囊、顆粒、凝膠等。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，載體為多孔板，例如96孔板、384孔板等。在一些實(shí)施方案中，載體為瓊脂糖凝膠或瓊脂糖珠或凝膠。有許多本領(lǐng)域眾所周知的方法，通過所述方法抗體(例如，胰島素抗體或二次抗體)可結(jié)合、附著、固定或偶聯(lián)于載體上，例如，共價(jià)或非共價(jià)鍵吸附、親和結(jié)合、離子鍵等。在一些實(shí)施方案中，使用cnbr偶聯(lián)抗體，例如可使抗體與cnbr活化瓊脂糖凝膠偶聯(lián)。在其它實(shí)施方案中，通過抗體結(jié)合蛋白，例如蛋白質(zhì)a、蛋白質(zhì)g、蛋白質(zhì)a/g或蛋白質(zhì)l使抗體附著于載體上。免疫純化方法的洗滌步驟通常包括洗滌載體，以致胰島素保持與載體上的抗胰島素抗體結(jié)合。免疫純化的洗脫步驟通常包括添加破壞胰島素與抗胰島素抗體的結(jié)合的溶液。示例性洗脫液包括有機(jī)溶液、鹽溶液和高或低ph溶液?？稍谫|(zhì)譜分析之前使用的另一種樣品純化方法是液相色譜法(lc)。在液相色譜技術(shù)中，可通過在流動(dòng)性條件下將樣品施加到色譜分析柱上純化分析物，其中目標(biāo)分析物在與一種或多種其它物質(zhì)相比的差異速率下洗脫。此類過程可使所述量的一種或多種目標(biāo)分析物相對(duì)于樣品的一種或多種其它組分富集。某些液相色譜法，包括hplc，依賴于相對(duì)緩慢的層流技術(shù)。傳統(tǒng)hplc分析依賴于柱填充物，其中通過柱的層流樣品是從樣品中分離目標(biāo)分析物的基礎(chǔ)。技術(shù)人員將理解，在這種柱中的分離是分隔過程并且可選擇適合與c肽一起使用的lc(包括hplc)儀器和柱。色譜分析柱通常包括促進(jìn)化學(xué)組成部分的分離(即，分餾)的介質(zhì)(即，填充材料)。介質(zhì)可包括細(xì)微顆粒。顆粒通常包括與各種化學(xué)組成部分相互作用以促進(jìn)化學(xué)組成部分的分離的結(jié)合表面。一種適合的結(jié)合表面為疏水性結(jié)合表面，例如烷基結(jié)合表面或氰基結(jié)合表面。烷基結(jié)合表面可包括c-4、c-8、c-12或c-18結(jié)合的烷基。在一些實(shí)施方案中，色譜分析柱為整體式c-18柱。色譜分析柱包括接收樣品的入口和排出包括分餾樣品的流出物的出口?？上蛉肟谥苯庸┙o樣品，或從spe柱，例如在線spe柱或tflc柱供給。在一些實(shí)施方案中，可在spe柱和或hplc柱前面使用在線過濾器以在樣品到達(dá)spe和/或tflc和/或hplc柱之前去除樣品中的微粒和磷脂。在一個(gè)實(shí)施方案中，可將樣品施加到lc柱的入口處，用溶劑或溶劑混合物洗脫，并且在出口處排出?？蛇x擇不同溶劑模式洗脫目標(biāo)分析物。例如，可使用梯度模式、恒組成模式或多型(即混合)模式進(jìn)行液相色譜法。色譜法期間，物質(zhì)的分離受變量影響，例如洗脫液(也稱為“流動(dòng)相”)、洗脫模式、梯度條件、溫度等的選擇。在一些實(shí)施方案中，用hplc富集樣品中的胰島素?？捎谜w式c-18柱色譜系統(tǒng)，例如來自phenomenexinc.的onyx整體式c-18柱(50×2.0mm)或等效物進(jìn)行這種hplc。在某些實(shí)施方案中，使用作為溶劑a的hplc級(jí)0.2％含水甲酸和作為溶劑b的于乙腈中的0.2％甲酸進(jìn)行hplc。通過精心選擇閥門和連接器管道，需要時(shí)可連接兩個(gè)或多個(gè)色譜柱，以使材料從一個(gè)柱轉(zhuǎn)到下一個(gè)柱，無需任何手動(dòng)步驟。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過預(yù)先編程為進(jìn)行必需步驟的計(jì)算機(jī)控制閥門和管道的選擇。最優(yōu)選，還以這種在線方式將色譜系統(tǒng)連接到檢測(cè)器系統(tǒng)，例如ms系統(tǒng)。因此，操作員可將一盤樣品放在自動(dòng)取樣器中，在計(jì)算機(jī)控制下進(jìn)行剩余操作，導(dǎo)致純化并分析選擇的所有樣品。在一些實(shí)施方案中，tflc可用于在質(zhì)譜分析之前純化胰島素。在此類實(shí)施方案中，可使用捕獲分析物的tflc柱萃取樣品。然后洗脫分析物并在線轉(zhuǎn)移到分析hplc柱中。例如，可用具有大粒徑(50μm)填充物的tflc萃取盒實(shí)現(xiàn)樣品萃取。然后在質(zhì)譜分析之前，可將從這個(gè)柱上洗脫的樣品在線轉(zhuǎn)移至hplc分析柱上進(jìn)行進(jìn)一步純化。因?yàn)榭梢宰詣?dòng)化方式將這些色譜過程中牽涉的步驟連接起來，所以可將分析物純化期間對(duì)操作員牽涉的需要減到最少。這個(gè)特征可導(dǎo)致時(shí)間和成本的節(jié)約，并且消除操作員錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)。在一些實(shí)施方案中，可并行使用以上一種或多種純化技術(shù)純化胰島素以允許同時(shí)處理多種樣品。在一些實(shí)施方案中，采用的純化技術(shù)不包括免疫純化技術(shù)，例如免疫親和色譜法。通過質(zhì)譜法檢測(cè)并定量胰島素使用包括用于電離分餾樣品并產(chǎn)生帶電分子做進(jìn)一步分析的離子源的質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。在各個(gè)實(shí)施方案中，可通過技術(shù)人員已知的任何方法電離胰島素。例如，可通過電子電離、化學(xué)電離、電噴霧電離(esi)、質(zhì)子電離、大氣壓化學(xué)電離(apci)、光致電離、大氣壓光致電離(appi)、激光二極管熱解吸(ldtd)、快原子轟擊(fab)、液態(tài)二次電離(lsi)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(maldi)、場(chǎng)電離、場(chǎng)解吸、熱噴霧/等離子噴霧電離、表面增強(qiáng)激光解吸電離(seldi)、電感耦合等離子體(icp)和粒子束電離進(jìn)行胰島素的電離。技術(shù)人員將理解，可基于待測(cè)分析物、樣品類型、檢測(cè)器類型、正與負(fù)模式的選擇等確定電離方法的選擇，可在正或負(fù)模式下電離胰島素。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可在正離子模式下通過esi電離胰島素。通常在質(zhì)譜技術(shù)中，在電離樣品之后，可分析由此產(chǎn)生的帶正電或負(fù)電的離子以測(cè)定質(zhì)荷比(m/z)。測(cè)定m/z的各種分析器包括四極分析器、離子阱分析器、飛行時(shí)間分析器、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)量分析器和軌道阱分析器。在bartolucci等，rapidcommun.massspectrom.2000,14:967-73中描述了一些示例性離子阱方法?？墒褂脦追N檢測(cè)模式檢測(cè)離子。例如，即可使用選擇性離子監(jiān)測(cè)模式(sim)檢測(cè)選擇離子，或可選地，可監(jiān)測(cè)由碰撞誘導(dǎo)解離或中性丟失引起的質(zhì)量相變，例如，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(mrm)或選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(srm)。在一些實(shí)施方案中，使用四極分析器測(cè)定質(zhì)荷比。在“四極”或“四極離子阱”儀器中，振蕩射頻場(chǎng)中的離子經(jīng)歷與電極之間施加的dc電位、rf信號(hào)振幅和質(zhì)/荷比成比例的力?？蛇x擇電壓和振幅，以致僅僅具有特定質(zhì)/荷比的離子沿四極長(zhǎng)度移動(dòng)，而使所有其它離子。因此，四極儀器可用作注入儀器中的離子的“濾質(zhì)器”和“質(zhì)量檢測(cè)器”。當(dāng)離子與檢測(cè)器碰撞時(shí)，它們產(chǎn)生轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)的電子脈沖。將所需數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)發(fā)至計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)繪制收集離子計(jì)數(shù)與時(shí)間的圖。所得質(zhì)量色譜圖與傳統(tǒng)hplc-ms方法中生成的色譜圖類似。可測(cè)量與特定離子相對(duì)應(yīng)的峰下面積或此類峰值的振幅并且與目標(biāo)分析物的量相關(guān)聯(lián)。在某些實(shí)施方案中，測(cè)量碎片離子和/或前體離子的曲線下面積或峰值振幅以測(cè)定胰島素的量。可使用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，基于內(nèi)部或外部分子標(biāo)準(zhǔn)的一種或多種離子的峰值，將指定離子的相對(duì)豐度轉(zhuǎn)化為原始分析物的量?？赏ㄟ^“串聯(lián)質(zhì)譜法”或“ms/ms”提高采用某些質(zhì)譜分析器的ms技術(shù)的分辨率。在這種技術(shù)中，可在ms儀器中過濾由目標(biāo)分子生成的前體離子(也稱為母離子)，隨后破碎驅(qū)離子以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)碎片離子(也稱為子離子或產(chǎn)物離子)，然后在第二個(gè)ms過程中分析所述碎片離子。通過精心選擇前體離子，僅使某些分析物產(chǎn)生的離子通過到達(dá)破碎室，在那里與惰性氣體原子的碰撞產(chǎn)生碎片離子。因?yàn)樵谝幌盗兄付婋x/破碎條件下以可重現(xiàn)方式生成前體和碎片離子，所以ms/ms技術(shù)可提供極其強(qiáng)大的分析工具。例如，過濾/破碎的組合可用于消除干擾物質(zhì)，并且可能在復(fù)合樣品，例如生物樣品中特別有用。在某些實(shí)施方案中，采用具有多個(gè)四極分析器的質(zhì)譜儀(例如三級(jí)四極儀器)進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。在使用ms/ms技術(shù)的某些實(shí)施方案中，分離前體離子做進(jìn)一步破碎，并且使用碰撞活化解離(cad)由前體離子生成碎片離子做進(jìn)一步檢測(cè)。在cad中，前體離子通過與惰性氣體的碰撞獲得能量，隨后通過稱為“單分子分解”的過程破碎。必須在前體離子中存積足夠能量，以致由于振動(dòng)能增大，可破壞離子中的某些鍵。在一些實(shí)施方案中，如下使用ms/ms檢測(cè)和/或量化樣品中的胰島素。通過首先使樣品經(jīng)受spe，然后經(jīng)受液相色譜法，優(yōu)選hplc使胰島素在樣品中富集；來自色譜分析柱的液體溶劑流進(jìn)入ms/ms分析器的加熱噴霧器接口；并且在接口的加熱帶電管道內(nèi)將溶劑/分析物混合物轉(zhuǎn)化為蒸汽。在這些過程期間，分析物(即，胰島素)電離。離子，例如前體離子，通過儀器口并且進(jìn)入第一個(gè)四極。四極1和3(q1和q3)為濾質(zhì)器，允許基于其質(zhì)荷比(m/z)選擇離子(即，分別選擇q1和q3中的“前體”和“碎片”離子)。四極2(q2)是碰撞室，在碰撞室內(nèi)破碎離子。質(zhì)譜儀的第一個(gè)四極(q1)選擇具有胰島素離子的m/z的分子。使具有恰當(dāng)m/z的前體離子進(jìn)入碰撞室(q2)，而具有任何其它m/z的不合需要的離子與四極的側(cè)面碰撞并且被消除。進(jìn)入q2的前體離子與中性氣體分子(例如氬分子)碰撞并且破碎。使生成的碎片離子進(jìn)入四極3(q3)，在四極3中選擇碎片離子進(jìn)行檢測(cè)。電離胰島素可產(chǎn)生多電荷前體離子(例如4+、5+、6+前體離子等)。電離條件，特別是電噴霧技術(shù)中利用的緩沖液的ph，嚴(yán)重影響生成的胰島素前體離子的同一性和量。例如，在酸性條件下，正電噴霧電離可能主要生成m/z分別為1162.5±0.5和968.5±0.5的5+和6+電荷胰島素前體離子。然而，在堿性條件下，正電噴霧電離可能主要生成m/z分別為1453.75±0.5和1162.94±0.5的4+和5+電荷胰島素前體離子。所述方法可利用酸性或堿性條件；優(yōu)選酸性條件。所述方法可包括在正或負(fù)離子模式下進(jìn)行的ms/ms；優(yōu)選正離子模式。在某些實(shí)施方案中，電噴霧緩沖液為酸性并且q1選擇用于m/z為約1162.5±0.5或968.5±0.5的胰島素前體離子。破碎這些胰島素前體離子中的任一種生成m/z為約226.21±0.5和/或135.6±0.5的碎片離子。因此，在q1選擇用于選自m/z為約1162.5±0.5和968.5±0.5的離子的一種或多種胰島素前體離子的實(shí)施方案中，q3可選擇選自m/z為約226.21±0.5和135.6±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在某些實(shí)施方案中，可測(cè)量來自單個(gè)前體離子的單個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度?；蛘?，可測(cè)量自單個(gè)前體離子的兩個(gè)或更多個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度。在這些實(shí)施方案中，可使每個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度受任何已知數(shù)學(xué)處理以定量評(píng)估最初樣品中的胰島素。在其它實(shí)施方案中，可測(cè)量來自兩個(gè)或更多個(gè)前體離子的一個(gè)或多個(gè)碎片離子并如以上用于定量評(píng)估最初樣品中的胰島素。操作可用于某些實(shí)施方案中的串聯(lián)質(zhì)譜儀的替代模式包括產(chǎn)物離子掃描和前體離子掃描。這些操作模式的描述，參見例如，e.michaelthurman等，chromatographic-massspectrometricfoodanalysisfortracedeterminationofpesticideresidues，第8章(amadeor.fernandez-alba編輯，elsevier2005)(387)。在其它實(shí)施方案中，高分辨率/高精度質(zhì)量分析器可用于根據(jù)本發(fā)明的方法定量分析胰島素。為達(dá)到定量結(jié)果可接受的精確度，質(zhì)譜儀必須能夠?qū)δ繕?biāo)離子表現(xiàn)出10,000或更大的分辨力(fwhm)，精度為約50ppm或更低；優(yōu)選質(zhì)譜儀表現(xiàn)出18,000或更佳的分辨力(fwhm)，精度為約5ppm或更低；例如20,000或更佳的分辨力(fwhm)和約3ppm或更低的精度；例如25,000或更佳的分辨力(fwhm)和約3ppm或更低的精度。3種能夠?qū)σ葝u素離子表現(xiàn)出必需性能水平的示例分析器為軌道阱質(zhì)量分析器、某些tof質(zhì)量分析器和傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)量分析器。生物活性分子中發(fā)現(xiàn)的元素，例如碳、氧和氮，以許多不同同位素形式天然存在。例如，大多數(shù)碳以12c存在，但是所有天然存在的碳的約1％以13c存在。因此，一定分?jǐn)?shù)的天然存在的含有至少一個(gè)碳原子的分子將含有至少一個(gè)13c原子。分子中包括天然存在的元素同位素產(chǎn)生多種分子同位素形式。分子同位素形式質(zhì)量的差異為至少1個(gè)原子質(zhì)量單位(amu)。這是因?yàn)樵赝凰叵嗖钪辽僖粋€(gè)中子(一個(gè)中子的質(zhì)量≈1amu)。當(dāng)使分子同位素形式電離為多電荷態(tài)時(shí)，同位素形式之間的質(zhì)量區(qū)別可變得難以辨別，因?yàn)橘|(zhì)譜檢測(cè)基因質(zhì)荷比(m/z)。例如，質(zhì)量相差1amu，均電離為5+態(tài)的兩種同位素形式將在其m/z中表現(xiàn)出僅為0.2的差異。高分辨率/高精度質(zhì)譜儀能夠辨別高度多電荷離子(例如帶±2、±3、±4、±5或更高電荷的離子)的同位素形式。由于天然存在的元素同位素，對(duì)于每種分子離子而言，通常存在多種同位素形式(每種同位素形式可產(chǎn)生如果用足夠靈敏的質(zhì)譜儀分析，可單獨(dú)檢測(cè)的質(zhì)譜峰)。多種同位素形式的m/z比和相對(duì)豐度共同包括分子離子的同位素特征。在一些實(shí)施方案中，可利用兩種或更多種分子同位素形式的m/z比和相對(duì)豐度確認(rèn)研究的分子離子的同一性。在一些實(shí)施方案中，使用來自一種或多種同位素形式的質(zhì)譜峰定量分子離子。在一些相關(guān)實(shí)施方案中，使用來自一種同位素形式的單個(gè)質(zhì)譜峰定量分子離子。在其它相關(guān)實(shí)施方案中，使用多個(gè)同位素峰定量分子離子。在這些后者實(shí)施方案中，所述多個(gè)同位素峰可進(jìn)行任何恰當(dāng)數(shù)學(xué)處理。在本領(lǐng)域中已知幾種數(shù)學(xué)處理，包括但不限于求多個(gè)峰下面積的和，或平均來自多個(gè)峰的反應(yīng)。在圖4-6中觀察到展示了5+和6+胰島素離子的多種同位素形式的示例光譜。如圖5a-b中所見，觀察到來自5+胰島素離子的各種同位素形式的峰值為約1161.72、1161.92、1162.12、1162.32、1162.52、1162.72、1162.92、1163.12和1163.32。如圖6a-b中所見，觀察到來自6+胰島素離子的各種同位素形式的峰值為約968.28、968.45、968.62、968.79、968.95、969.12、969.28、968.45和969.61。然而應(yīng)注意，由于儀器變化，對(duì)任何離子的同位素變體觀察到的精確質(zhì)量可能稍有改變。在一些實(shí)施方案中，用高分辨率/高精度質(zhì)譜儀測(cè)量一種或多種離子的相對(duì)豐度以便定量評(píng)估樣品中胰島素的量。在一些實(shí)施方案中，通過高分辨率/高精度質(zhì)譜法測(cè)量的所述一種或多種離子為多電荷胰島素離子。這些多電荷離子可包括m/z在約1453±0.8(即，來自4+離子的一個(gè)或多個(gè)單同位素峰)和/或1162±1(即，來自5+離子的一個(gè)或多個(gè)單同位素峰)和/或約968.8±1.5(即，來自6+離子的一個(gè)或多個(gè)單同位素峰)范圍內(nèi)的一種或多種離子。已經(jīng)報(bào)道使用高分辨率軌道阱分析器定性和定量分析各種分析物。參見例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公布no.2008/0118932(2007年11月9日提交)；等，rapidcommun.massspectrom.,2008,22:477-485；lebreton等，rapidcommun.massspectrom.,2008,22:3130-36；thevis等，massspectrom.reviews,2008,27:35-50；thomas等，j.massspectrom.,2008,43:908-15；schenk等，bmcmedicalgenomics,2008,1:41；和olsen等，naturemethods,2007,4:709-12。可通過本領(lǐng)域已知的許多方法將分析物測(cè)定的結(jié)果與原樣品中分析物的量聯(lián)系起來。例如，考慮到仔細(xì)控制取樣和分析參數(shù)，可將指定離子的相對(duì)豐度與將相對(duì)豐度轉(zhuǎn)化為原分子絕對(duì)量的表作比較?；蛘?，外標(biāo)可與樣品一起進(jìn)行，并且基于由那些標(biāo)準(zhǔn)生成的離子作標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用這種標(biāo)準(zhǔn)曲線，可將指定離子的相對(duì)豐度轉(zhuǎn)化為原分子的絕對(duì)量。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，使用內(nèi)標(biāo)生成用于計(jì)算胰島素量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。生成并且使用這種標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法在本領(lǐng)域中眾所周知并且普通技術(shù)人員能夠選擇恰當(dāng)內(nèi)標(biāo)。例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，可使用一種或多種形式的同位素標(biāo)記胰島素作為內(nèi)標(biāo)。將離子的量與原分子的量聯(lián)系起來的許多其它方法將為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員眾所周知。如本文所使用，當(dāng)通過質(zhì)譜技術(shù)分析時(shí)，相對(duì)于未標(biāo)記分子，“同位素標(biāo)記”在標(biāo)記分子中產(chǎn)生質(zhì)量位移。適合標(biāo)記的實(shí)例包括氘(2h)、13c和15n?？稍诜肿拥囊粋€(gè)或多個(gè)位置并入一個(gè)或多個(gè)同位素標(biāo)記并且可在相同同位素標(biāo)記分子上使用一種或多種同位素標(biāo)記。通過用質(zhì)譜法定量未修飾胰島素a和/或b鏈來定量胰島素在其它實(shí)施方案中，可在質(zhì)譜分析之前使胰島素受化學(xué)處理以生成胰島素的組成鏈?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何化學(xué)處理分離胰島素的a鏈和b鏈以引起二硫化物還原。例如，可用tcep(三(2-羧乙基)膦處理胰島素以還原胰島素的二硫橋鍵并分離a鏈和b鏈。然后可使a鏈和b鏈進(jìn)行上述純化胰島素的一個(gè)或多個(gè)純化步驟。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在質(zhì)譜分析之前使a鏈和/或b鏈通過hplc純化。一經(jīng)純化，就使a鏈和/或b鏈經(jīng)受電離源。與胰島素一樣，技術(shù)人員將理解，可基于待測(cè)分析、樣品類型、檢測(cè)器類型、正與負(fù)模式的選擇等確定電離方法的選擇?？稍谡蜇?fù)模式下電離胰島素a鏈和b鏈。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在正模式下通過esi電離胰島素a鏈和/或b鏈。電離胰島素a鏈可產(chǎn)生多電荷a鏈前體離子(例如2+、3+前體離子等)。例如，正電噴霧電離胰島素a鏈分子可生成m/z分別為1192.0±0.5和795.0±0.5的2+和3+電荷a鏈前體離子。與胰島素相似，電離胰島素a鏈生成的多電荷物類的同一性和量受采用的電離條件影響。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在酸性條件下電離胰島素a鏈。在使胰島素a鏈進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析的實(shí)施方案中，q1可選擇用于m/z為約1192.0±0.5和795.0±0.5的一種或多種胰島素a鏈前體離子。破碎這些胰島素a鏈前體離子的任一種可生成m/z為約513.0±0.5、399.0±0.5、236.0±0.5和133.0±0.5的碎片離子。因此，在q1選擇用于選自m/z為約1192.0±0.5和795.0±0.5的離子的一種或多種胰島素a鏈前體離子的實(shí)施方案中，q3可選擇選自m/z為約513.0±0.5、399.0±0.5、236.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在某些實(shí)施方案中，可測(cè)量來自單個(gè)前體離子的單個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度?；蛘?，可測(cè)量自單個(gè)前體離子的兩個(gè)或更多個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度。在這些實(shí)施方案中，可使每個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度受任何已知數(shù)學(xué)處理以定量評(píng)估最初樣品中的胰島素。在其它實(shí)施方案中，可測(cè)量來自兩個(gè)或更多個(gè)前體離子的一個(gè)或多個(gè)碎片離子并如以上用于定量評(píng)估最初樣品中的胰島素。類似地，電離胰島素b鏈可產(chǎn)生多電荷b鏈前體離子(例如3+、4+、5+前體離子等)。例如，正電噴霧電離胰島素b鏈分子可生成m/z分別為1144.2±0.5、858.3±0.5和686.8±0.5的3+、4+和5+電荷b鏈前體離子。與胰島素相似，電離胰島素b鏈生成的多電荷物類的同一性和量受采用的電離條件影響。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在酸性條件下電離胰島素b鏈。在使胰島素b鏈進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析的實(shí)施方案中，q1可選擇用于m/z為約1144.2±0.5、858.3±0.5和686.8±0.5的一種或多種胰島素b鏈前體離子。破碎這3種胰島素b鏈前體離子可生成m/z為約825.4±0.5、768.5±0.5、753.2±0.5、345.0±0.5和226.2±0.5的碎片離子。因此，在q1選擇用于選自m/z為約1144.2±0.5、858.3±0.5和686.8±0.5的離子的一種或多種胰島素b鏈前體離子的實(shí)施方案中，q3可選擇選自m/z為約825.4±0.5、768.5±0.5、753.2±0.5、345.0±0.5和226.2±0.5的離子的一種或多種碎片離子；優(yōu)選選自m/z為約345.0±0.5和226.2±0.5的離子。在某些實(shí)施方案中，可測(cè)量來自單個(gè)前體離子的單個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度?；蛘撸蓽y(cè)量自單個(gè)前體離子的兩個(gè)或更多個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度。在這些實(shí)施方案中，可使每個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度受任何已知數(shù)學(xué)處理以定量評(píng)估最初樣品中的胰島素。在其它實(shí)施方案中，可測(cè)量來自兩個(gè)或更多個(gè)前體離子的一個(gè)或多個(gè)碎片離子并如以上用于定量評(píng)估最初樣品中的胰島素。通過用質(zhì)譜法定量經(jīng)化學(xué)修飾的胰島素a和/或b鏈來定量胰島素在替代實(shí)施方案中，可在電離和/或純化之前對(duì)單獨(dú)的胰島素a鏈和b鏈進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)化學(xué)修飾步驟。例如，一經(jīng)分離，胰島素a鏈和b鏈分子就可經(jīng)受脲甲基化以使組成型半胱氨酸完全烷基化。例如，在用dtt(1,4-二硫蘇糖醇)還原后，可通過使胰島素a鏈和/或b鏈與碘乙酰胺反應(yīng)實(shí)現(xiàn)脲甲基化。脲甲基化胰島素a鏈導(dǎo)致4個(gè)半胱氨酸甲基化，導(dǎo)致質(zhì)量增加約228.08amu(每個(gè)半胱氨酸約57.02)。脲甲基化胰島素b鏈導(dǎo)致2個(gè)半胱氨酸甲基化，導(dǎo)致質(zhì)量增加約114.04amu(每個(gè)半胱氨酸約57.02)。一經(jīng)純化，就使經(jīng)化學(xué)修飾(例如，烷基化)的a鏈和/或b鏈經(jīng)受電離源。與胰島素一樣，技術(shù)人員將理解，可基于待測(cè)分析、樣品類型、檢測(cè)器類型、正與負(fù)模式的選擇等確定電離方法的選擇?？稍谡蜇?fù)模式下電離烷基化胰島素a鏈和b鏈。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在正模式下通過esi電離烷基化胰島素a鏈和/或b鏈。電離烷基化胰島素a鏈可產(chǎn)生多電荷烷基化a鏈前體離子(例如2+、3+等前體離子)。例如，正電噴霧電離烷基化胰島素a鏈分子可生成m/z分別為1306.0±0.5和871.0±0.5的2+和3+電荷烷基化a鏈前體離子。與胰島素相似，電離烷基化胰島素a鏈生成的多電荷物類的同一性和量受采用的電離條件影響。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在酸性條件下電離烷基化胰島素a鏈。在使烷基化胰島素a鏈進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析的實(shí)施方案中，q1可選擇用于m/z為約1306.0±0.5和871.0±0.5的一種或多種烷基化胰島素a鏈前體離子。破碎這些烷基化胰島素a鏈前體離子的任一種可生成m/z為約570.0±0.5、456.0±0.5、293.0±0.5和133.0±0.5的碎片離子。因此，在q1選擇用于選自m/z為約1192.0±0.5和795.0±0.5的離子的一種或多種烷基化胰島素a鏈前體離子的實(shí)施方案中，q3可選擇選自m/z為約570.0±0.5、456.0±0.5、293.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在某些實(shí)施方案中，可測(cè)量來自單個(gè)前體離子的單個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度?；蛘撸蓽y(cè)量自單個(gè)前體離子的兩個(gè)或更多個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度。在這些實(shí)施方案中，可使每個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度受任何已知數(shù)學(xué)處理以定量評(píng)估最初樣品中的胰島素。在其它實(shí)施方案中，可測(cè)量來自兩個(gè)或更多個(gè)前體離子的一個(gè)或多個(gè)碎片離子并如以上用于定量評(píng)估最初樣品中的胰島素。類似地，電離烷基化胰島素b鏈可產(chǎn)生多電荷烷基化b鏈前體離子(例如3+、4+、5+前體離子等)。例如，正電噴霧電離烷基化胰島素b鏈分子可生成m/z分別為1181.9±0.5、886.9±0.5和709.8±0.5的3+、4+和5+電荷烷基化b鏈前體離子。與胰島素相似，電離烷基化胰島素b鏈生成的多電荷物類的同一性和量受采用的電離條件影響。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在酸性條件下電離烷基化胰島素b鏈。在使烷基化胰島素b鏈進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析的實(shí)施方案中，q1可選擇m/z為約1181.9±0.5、886.9±0.5和709.8±0.5的一種或多種胰島素b鏈前體離子。破碎這3種烷基化胰島素b鏈前體離子可生成m/z為約345.0±0.5和226.2±0.5的碎片離子。因此，在q1選擇用于選自m/z為約1144.2±0.5、858.3±0.5和686.8±0.5的離子的一種或多種烷基化胰島素b鏈前體離子的實(shí)施方案中，q3可選擇選自m/z為約345.0±0.5和226.2±0.5的離子的一種或多種碎片離子。在某些實(shí)施方案中，可測(cè)量來自單個(gè)前體離子的單個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度?；蛘?，可測(cè)量自單個(gè)前體離子的兩個(gè)或更多個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度。在這些實(shí)施方案中，可使每個(gè)碎片離子的相對(duì)豐度受任何已知數(shù)學(xué)處理以定量評(píng)估最初樣品中的胰島素。在其它實(shí)施方案中，可測(cè)量來自兩個(gè)或更多個(gè)前體離子的一個(gè)或多個(gè)碎片離子并如以上用于定量評(píng)估最初樣品中的胰島素?？墒褂米詣?dòng)化機(jī)器進(jìn)行上述任何方法的一個(gè)或多個(gè)步驟。在某些實(shí)施方案中，在線進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)純化步驟，并且更優(yōu)選以在線方式進(jìn)行所有純化和質(zhì)譜分析步驟。下列實(shí)施例用于說明本發(fā)明。這些實(shí)施例決非旨在限制所述方法的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1：樣品制備通過在各種濃度下示蹤模擬血清中的人胰島素(40mg/ml牛血清白蛋白(bsa)于具有0.002％蛋白酶抑制劑的aebsf磷酸鹽緩沖鹽(pbs)緩沖液中)制備含有不同量的胰島素的模擬血清樣品以評(píng)估線性響應(yīng)(以下在實(shí)施例4中討論)。還在各種濃度下，在從goldenwestbiologicals,inc.獲得的雙重活性炭反萃血清中示蹤了人胰島素以評(píng)估響應(yīng)線性度(以下在實(shí)施例4中討論)。實(shí)施例2：質(zhì)譜分析之前富集胰島素用cohesivetechnologiesariatx-420系統(tǒng)，使用ariaosv1.6或更新軟件進(jìn)行以上制備的人胰島素示蹤模擬和反萃血清的樣品注射。將75μl樣品引入watersoasishlb(25μm，2.1×20mm)、在線固相萃取(spe)柱。spe柱保留人胰島素，而使其它血清蛋白和大分子流過。用0.2％于40％乙腈的甲酸將胰島素從萃取柱上洗脫到分析柱上(來自phenomenexinc.的整體式c18分析柱(粒徑5μm，50×2.1mm))。將hplc梯度應(yīng)用于分析柱，以將胰島素與樣品所含的其它分析物分開。流動(dòng)相a是0.2％于水中的甲酸而流動(dòng)相b是0.2％于乙腈中的甲酸。hplc梯度從28.5％有機(jī)梯度開始，在約90s內(nèi)提高到37％。然后使胰島素富集樣品進(jìn)行高分辨率/高精度ms或ms/ms以定量胰島素。實(shí)施例3：ph對(duì)胰島素電離的影響在正離子模式下用esi源進(jìn)行胰島素的電離。在使用這種電離源生成正胰島素離子時(shí)，觀察到電噴霧載體溶液的ph影響生成的胰島素離子的量和特性。在酸性條件下，以968.5±0.50(對(duì)于6+離子而言)和1162.3±0.50(對(duì)于5+離子而言)的m/z觀察到多電荷胰島素離子。圖3a示出了從在酸性條件下電離胰島素收集的示例性光譜。在堿性條件下，以1163.0±0.50(對(duì)于5+離子而言)和1453.8±0.50(對(duì)于4+離子而言)的m/z觀察到多電荷胰島素離子。圖3b示出了從在堿性條件下電離胰島素收集的示例性光譜。在酸性和堿性條件下生成足夠信號(hào)，使得可在任一種條件下進(jìn)行定量分析。實(shí)施例4：通過高分辨率/高精度ms檢測(cè)并定量胰島素使用agilenttofms系統(tǒng)(agilenttechnologies,inc.)進(jìn)行高分辨率/高精度ms。該系統(tǒng)采用能夠進(jìn)行高分辨率/高精度ms的ms分析器。在測(cè)量胰島素的同時(shí)，儀器能夠表現(xiàn)出約25,000fwhm的分辨率和約1ppm的質(zhì)量精度。在正離子模式下用esi源進(jìn)行電離。如實(shí)施例3中討論，電噴霧載體溶液的ph影響生成的胰島素離子的量和同一性。當(dāng)用甲酸溶液從sep柱上洗脫實(shí)施例1中制備的樣品時(shí)，在電離之前酸化樣品。如實(shí)施例3中所述，觀察到多電荷胰島素離子呈6+和5+電荷態(tài)。觀察污染物峰從反萃血清樣品洗脫。圖4a示出了用qtof質(zhì)譜儀生成的模擬血清樣品中胰島素在約900-1200m/z范圍的示例光譜。圖4b示出了用qtof質(zhì)譜儀生成的來自反萃血清樣品基質(zhì)的污染物峰。觀察到污染物峰的來源在不同于胰島素峰的時(shí)間洗脫(數(shù)據(jù)未示出)。在圖5a中觀察到示出了5+離子的各個(gè)同位素峰，在約1155-1176m/z范圍的示例性高分辨率/高精度光譜。在圖5b中觀察到所述光譜在約1159和1166之間的部分的特寫。如光譜中所見，在約1161.72、1161.92、1162.12、1162.32、1162.52、1162.72、1162.92、1163.12和1163.34的m/z下觀察到各個(gè)示例性同位素峰。在圖6a中觀察到示出了6+離子的各個(gè)同位素峰，在約964-973m/z范圍的示例性高分辨率/高精度光譜。在圖6b中觀察到所述光譜在約967和971.4之間的部分的特寫。如光譜中所見，在約968.28、968.45、968.62、968.79、968.95、968.12、968.28、968.45和968.61的m/z下觀察到各個(gè)示例性同位素峰。收集m/z為1162.54±0.10的離子數(shù)據(jù)，以對(duì)示蹤模擬和反萃血清樣品中的胰島素進(jìn)行定量以評(píng)估定量線性。兩種樣品類型在約1.22ng/ml-1250ng/ml的濃度范圍均展示出線性。圖7和8中分別示出了顯示示蹤模擬血清樣品和示蹤反萃血清樣品中胰島素檢測(cè)的數(shù)據(jù)的線性。測(cè)定通過高分辨率/高精度質(zhì)譜定量胰島素的擬合優(yōu)度(r2)在示蹤模擬血清中為0.9981而在示蹤反萃血清中為0.9979。實(shí)施例5：通過串聯(lián)ms檢測(cè)并定量胰島素使用thermotsqvantagems/ms系統(tǒng)(thermoelectroncorporation)進(jìn)行ms/ms。在本文所述實(shí)施例中使用全部來自thermoelectron的下列軟件程序：tsqvantagev2.0.0或更新版本、xcaliburv2.0或更新版本和lcquanv2.5或更新版本。離開分析柱的液體溶劑/分析物流到ms/ms分析器的esi源接口。在接口的加熱管道內(nèi)溶劑/分析物混合物轉(zhuǎn)化為蒸汽。在正離子模式下，在酸性條件下通過esi電離分析物。離子進(jìn)入第一個(gè)四極(q1)。在q1處觀察到幾種可能的胰島素前體離子。在圖9中觀察到示例性q1光譜。對(duì)m/z為約1163.32±0.50(5+離子)和約969.56±0.50(6+離子)的多電荷胰島素前體離子進(jìn)行破碎研究。圖10和11中分別示出了來自破碎每種前體離子的示例性產(chǎn)物離子掃描。研究了碰撞能對(duì)5+和6+前體離子的破碎模式的影響。在范圍從約7ev至約80ev的碰撞能下破碎每種前體離子，并監(jiān)測(cè)選擇的3種碎片離子(m/z為約135.9±0.50、226.2±0.50和345.3±0.50)的相對(duì)強(qiáng)度。圖12中展示了這些研究的結(jié)果。如圖12所見，碎片離子的相對(duì)強(qiáng)度根據(jù)碰撞能顯著變化。表1中示出了每個(gè)監(jiān)測(cè)相變的最佳碰撞能值。表1.對(duì)胰島素觀察到的示例性質(zhì)量相變的最佳碰撞能(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產(chǎn)物離子(m/z)最佳碰撞能969.56±0.50(6+)135.9±0.5030ev226.2±0.5032ev345.4±0.5028ev1163.32±0.50(5+)135.9±0.5045ev226.2±0.5042ev345.4±0.5044ev對(duì)于通過破碎6+離子定量胰島素，進(jìn)入四極2(q2)的前體離子在30ev的碰撞能下與氬氣碰撞生成離子碎片，離子碎片進(jìn)入四極3(q3)作進(jìn)一步選擇。破碎969.56±0.50前體離子觀察到下列質(zhì)量相變。圖10中示出了從q3掃描(產(chǎn)物離子掃描)收集的示例性破碎光譜。在mrm模式下監(jiān)測(cè)觀察到的其中兩個(gè)相變并且加和作定量分析：969.56±0.50-135.9±0.50和226.2±0.50的前體離子(見表2)。雖然通過監(jiān)測(cè)兩個(gè)質(zhì)量相變完成了定量，但是可通過僅監(jiān)測(cè)單個(gè)質(zhì)量相變完成定量。相反，可選擇另外的質(zhì)量相變(包括，例如，圖10中觀察到的任何其它碎片離子)以任何組合代替或增大以上監(jiān)測(cè)的任何相變。類似地，雖然在30ev的碰撞能下完成定量，但是可使用產(chǎn)生足夠離子信號(hào)的任何碰撞能并且可取決于監(jiān)測(cè)碎片離子的同一性。例如，對(duì)于上面所指出的兩種碎片離子而言，碰撞能可在約20至約50ev范圍內(nèi)，例如在約25至約40ev范圍內(nèi)，例如約28-32ev。為通過破碎5+離子定量胰島素，進(jìn)入四極2(q2)的前體離子在49ev的碰撞能下與氬氣碰撞生成離子碎片，離子碎片進(jìn)入四極3(q3)作進(jìn)一步選擇。破碎1163.32±0.50前體離子觀察到下列質(zhì)量相變。圖11中示出了從q3掃描(產(chǎn)物離子掃描)收集的示例性破碎光譜。在mrm模式下監(jiān)測(cè)觀察到的其中兩個(gè)相變并且加和作定量分析：1163.32±0.50-135.9±0.50和226.2±0.50的前體離子(見表2)。雖然通過監(jiān)測(cè)兩個(gè)質(zhì)量相變完成了定量，但是可通過僅監(jiān)測(cè)單個(gè)質(zhì)量相變完成定量。相反，可選擇另外的質(zhì)量相變(包括，例如，圖10中觀察到的任何其它碎片離子)以任何組合代替或增大以上監(jiān)測(cè)的任何相變。類似地，雖然在49ev的碰撞能下完成定量，但是可使用產(chǎn)生足夠離子信號(hào)的任何碰撞能并且可取決于監(jiān)測(cè)碎片離子的同一性。例如，對(duì)于上面所指出的兩種碎片離子而言，碰撞能可在約25至約70ev范圍內(nèi)，例如在約30至約60ev范圍內(nèi)，例如約35-50ev。表2.為定量胰島素監(jiān)測(cè)的示例性質(zhì)量相變(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產(chǎn)物離子(m/z)碰撞能969.56±0.50(6+)135.9±0.50,226.2±0.5030ev1163.32±0.50(5+)135.9±0.50,226.2±0.5049ev實(shí)施例6：通過串聯(lián)ms檢測(cè)并定量胰島素a鏈和b鏈用tcep(三(2-羧乙基)膦處理如實(shí)施例1中所述制備的胰島素示蹤模擬血清和反萃血清樣品以還原胰島素的二硫橋鍵并分離a鏈和b鏈。二硫化物還原后，使含有分離a鏈和b鏈的樣品進(jìn)行實(shí)施例2中描述的相同純化過程。所得胰島素a鏈和b鏈進(jìn)行如實(shí)施例5所述的ms/ms分析。在正模式下，在酸性條件下通過esi電離兩種分析物。在q1處觀察到幾種可能的胰島素a鏈和b鏈前體離子。圖13中示出了顯示兩種可能a鏈前體離子(呈2+和3+電荷態(tài))和可能b鏈前體離子(呈3+和4+電荷態(tài))的復(fù)合光譜。觀察到這兩種a鏈前體離子m/z為約1192.86±0.50(2+離子)和795.43±0.50(3+離子)。觀察到這兩種b鏈前體離子m/z為約1144.09±0.50(3+離子)和858.40±0.50(4+離子)。還觀察到第3種可能b鏈前體離子(圖14中所示)m/z為約686.83±0.50(5+離子)。對(duì)以上所有a鏈和b鏈前體離子進(jìn)行破碎研究。研究了碰撞能對(duì)a鏈3+前體離子(m/z/為約795.43±0.50)的影響。在范圍從約7ev至約80ev的碰撞能下破碎前體離子，并檢測(cè)選擇的4種碎片離子(m/z為約513.0±0.50、399.0±0.50、236.0±0.50和133.0±0.50)的相對(duì)強(qiáng)度。圖15中展示了這些研究的結(jié)果。如圖15中所見，碎片離子的相對(duì)強(qiáng)度根據(jù)碰撞能顯著變化。表3中示出了每個(gè)監(jiān)測(cè)相變的最佳碰撞能值。表3.對(duì)胰島素a鏈3+前體離子觀察到的示例性質(zhì)量相變的最佳碰撞能(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產(chǎn)物離子(m/z)最佳碰撞能795.4±0.50(3+)133.0±0.5028ev236.0±0.5023ev399.0±0.5016ev513.0±0.5012ev用m/z/為約1192.86±0.50(2+離子)和795.43±0.50(3+離子)的a鏈前體離子進(jìn)行胰島素定量。用每種前體離子進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。在這些定量實(shí)驗(yàn)中，選擇2+離子(m/z/為約1192.86±0.50)或3+離子(m/z/為約795.43±0.50)作為前體離子并且在表3所示碰撞能下破碎。不管選擇的前體離子如何，監(jiān)測(cè)下列碎片離子：513.0±0.50、399.0±0.50、236.0±0.50和133.0±0.50。雖然通過監(jiān)測(cè)4個(gè)質(zhì)量相變完成定量，但是可通過僅監(jiān)測(cè)單個(gè)質(zhì)量相變完成定量。相反地，可選擇另外的質(zhì)量相變(包括，例如，觀察到的任何其它碎片離子)以任何組合代替或增大以上監(jiān)測(cè)的任何相變。表4.為定量胰島素a鏈監(jiān)測(cè)的示例性質(zhì)量相變(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產(chǎn)物離子(m/z)1192.86±0.50(2+離子)513.0±0.50、399.0±0.50、236.0±0.50和133.0±0.50795.43±0.50(3+離子)513.0±0.50、399.0±0.50、236.0±0.50和133.0±0.50還用m/z/為約1144.09±0.50(3+離子)、858.40±0.50(4+離子)和686.83±0.50(5+離子)的b鏈前體離子進(jìn)行胰島素定量。用每種前體離子進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。在這些定量實(shí)驗(yàn)中，選擇3+離子(m/z/為約1144.09±0.50)、4+離子(m/z/為約795.43±0.50)或5+離子(m/z/為約686.83±0.50)作為前體離子并且在30ev碰撞能下破碎。不管選擇的前體離子如何，監(jiān)測(cè)下列碎片離子：226.2±0.50和345.0±0.50。圖16中示出了在30ev碰撞能下破碎b鏈4+離子(即，產(chǎn)物離子掃描)的示例性光譜。雖然通過監(jiān)測(cè)2個(gè)質(zhì)量相變完成定量，但是可通過僅監(jiān)測(cè)單個(gè)質(zhì)量相變完成定量。相反，可選擇另外的質(zhì)量相變(包括，例如，圖16中觀察到的任何其它碎片離子)以任何組合代替或增大以上監(jiān)測(cè)的任何相變。表5.為定量胰島素b鏈監(jiān)測(cè)的示例性質(zhì)量相變(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產(chǎn)物離子(m/z)1144.09±0.50(3+離子)226.2±0.50、345.0±0.50858.40±0.50(4+離子)226.2±0.50、345.0±0.50686.83±0.50(5+離子)226.2±0.50、345.0±0.50實(shí)施例7：通過串聯(lián)ms檢測(cè)并定量胰島素a鏈(烷基化)和b鏈(烷基化)用dtt(1,4-二硫蘇糖醇)處理胰島素示蹤模擬血清和反萃血清樣品以生成含有分離a鏈和b鏈的模擬和反萃血清樣品。在純化之前，使胰島素a鏈和b鏈分子進(jìn)行脲甲基化以使分子中存在的每個(gè)組成型半胱氨酸完全烷基化。在a鏈中，通過這個(gè)過程使4個(gè)半胱氨酸烷基化，導(dǎo)致質(zhì)量增加約228.08amu。在b鏈中，通過這個(gè)過程使2個(gè)半胱氨酸烷基化，導(dǎo)致質(zhì)量增加約114.04amu。半胱氨酸烷基化后，使含有烷基化a鏈和烷基化b鏈的樣品進(jìn)行實(shí)施例2中描述的相同純化過程。使所得烷基化a鏈和烷基化b鏈進(jìn)行如實(shí)施例5所述的ms/ms分析。在正模式下，在酸性條件下通過esi電離兩種分析物。在q1處觀察到幾種可能的烷基化a鏈和烷基化b鏈前體離子。選擇m/z為約1306.0±0.50(2+離子)和871.0±0.50(3+離子)的2種可能a鏈前體離子進(jìn)行破碎和定量。選擇m/z為約1181.9±0.50(3+離子)、886.40±0.50(4+離子)和709.80±0.50(5+離子)的3種可能烷基化b鏈前體離子進(jìn)行破碎和定量。用m/z/為約1306.0±0.50(2+離子)和871.0±0.50(3+離子)的烷基化a鏈前體離子進(jìn)行胰島素定量。用每種前體離子進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。在這些定量實(shí)驗(yàn)中，選擇2+離子(m/z/為約1306.0±0.50)或3+離子(m/z/為約871.0±0.50)作為前體離子并且在30ev碰撞能下破碎。不管選擇的前體離子如何，監(jiān)測(cè)下列碎片離子：133.0±0.50,293.0±0.50,456.0±0.50和570.0±0.50。雖然通過監(jiān)測(cè)4個(gè)質(zhì)量相變完成定量，但是可通過僅監(jiān)測(cè)單個(gè)質(zhì)量相變完成定量。相反地，可選擇另外的質(zhì)量相變以任何組合代替或增大以上監(jiān)測(cè)的任何相變。表6.為定量烷基化胰島素a鏈監(jiān)測(cè)的示例性質(zhì)量相變(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產(chǎn)物離子(m/z)1306.0±0.50(2+離子)133.0±0.50,293.0±0.50,456.0±0.50和570.0±0.50871.0±0.50(3+離子)133.0±0.50,293.0±0.50,456.0±0.50和570.0±0.50還用約1181.9±0.50(3+離子)、886.9±0.50(4+離子)和709.8±0.50(5+離子)的烷基化b鏈前體離子進(jìn)行胰島素定量。用每種前體離子進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。在這些定量實(shí)驗(yàn)中，選擇3+離子(m/z為約1181.9±0.50)、4+離子(m/z為約886.9±0.50)或5+離子(m/z為約709.8±0.50)作為前體離子并且在30ev碰撞能下破碎。不管選擇的前體離子如何，監(jiān)測(cè)下列碎片離子：226.2±0.50和345.0±0.50。雖然通過監(jiān)測(cè)2個(gè)質(zhì)量相變完成定量，但是可通過僅監(jiān)測(cè)單個(gè)質(zhì)量相變完成定量。相反地，可選擇另外的質(zhì)量相變以任何組合代替或增大以上監(jiān)測(cè)的任何相變。表7.為定量烷基化胰島素b鏈監(jiān)測(cè)的示例性質(zhì)量相變(正極性-酸性條件)實(shí)施例8：制備人類樣品以通過定量胰島素b鏈進(jìn)行胰島素定量在人類樣品中胰島素的定量中使用兩種內(nèi)標(biāo)溶液。用溶于0.2％于水中的甲酸的牛胰島素制備濃度為10pmol/μl的第一內(nèi)標(biāo)溶液。然后用500ml含有比例為15:85的1.5mtris堿和乙醇的堿/萃取液稀釋30μl該溶液。用同位素標(biāo)記的人胰島素b鏈(用具有5個(gè)13c和1個(gè)15n的脯氨酸標(biāo)記)，通過將1mg肽溶于1ml0.2％于水中的甲酸中制備第二內(nèi)標(biāo)溶液。用1000μl水稀釋5μl這種濃溶液以制備第二內(nèi)標(biāo)溶液。解凍先前冷凍的人血清樣品，使其達(dá)到室溫并充分渦旋。一經(jīng)解凍，就將各150μl樣品添加到350μl用牛胰島素示蹤的堿/萃取液中。在1000rpm速度下渦旋所得混合物2min，并在-20℃冷凍機(jī)中培育60±5min，使沉淀形成。培育之后，在5500rpm下離心樣品10min。然后將來自每種樣品的250μl上清液轉(zhuǎn)移到96-微量滴定板中。然后使2mltcep還原溶液(thermoscientific目錄號(hào)#77720)與100μl第二內(nèi)標(biāo)溶液混合，并且將20μl這種混合物添加到96-微量滴定板中的每種樣品中。在1000rpm速度下再次渦旋樣品2min，并且在37℃培育箱中培育60±5min以使樣品中的胰島素發(fā)生還原，而使樣品中存在的任何完整胰島素分離成a鏈和b鏈。然后在-20℃冷凍機(jī)中培育10min，使沉淀形成。在5500rpm下再次離心沉淀的樣品10min。然后在ms/ms分析之前通過spe和hplc使來自每種樣品225上清液進(jìn)行富集。實(shí)施例9：進(jìn)行質(zhì)譜法之前使胰島素b鏈從人類樣品中富集用cohesivetechnologiesariatx-420系統(tǒng)，使用ariaosv1.6或更新的軟件進(jìn)行實(shí)施例8中制備的經(jīng)處理血清樣品的樣品注射。將225μl樣品引入watersoasishlb(25μm，2.1×20mm)、在線固相萃取(spe)柱。spe柱保留胰島素b鏈，而使其它血清蛋白和大分子流過。用0.2％甲酸洗滌保留的胰島素b鏈。用35％于0.2％甲酸中的乙腈(含有0.025％異丙醇)將胰島素b鏈從萃取柱上洗脫到裝有保護(hù)盒的分析柱上(michrombioresources300armstrongmagicc4(2.1×50mm，5μm粒徑)分析柱和phenomenex安全保護(hù)柱盒(phenomenexp/naho-4286))。將hplc梯度應(yīng)用于防護(hù)/分析柱，以將胰島素與樣品所含的其它分析物分開。流動(dòng)相a是0.2％于水中的甲酸而流動(dòng)相b是0.2％于乙腈中的甲酸(含有2.5％異丙醇)。hplc梯度從12.0％有機(jī)梯度開始，在約90s內(nèi)提高到42％。然后使胰島素富集樣品進(jìn)行ms/ms以定量胰島素。實(shí)施例10：通過串聯(lián)ms檢測(cè)并定量來自人血清的胰島素b鏈?zhǔn)褂胻hermotsqvantagems/ms系統(tǒng)(thermoelectroncorporation)進(jìn)行ms/ms。在本文所述實(shí)施例中使用全部來自thermoelectron的下列軟件程序：tsqvantagev2.0.0或更新版本、xcaliburv2.0或更新版本和lcquanv2.5或更新版本。離開分析柱的液體溶劑/分析物流到ms/ms分析器的esi源接口。在接口的加熱管道內(nèi)溶劑/分析物混合物轉(zhuǎn)化為蒸汽。在正離子模式下，在酸性條件下通過esi電離分析物。如以上實(shí)施例6中所述，在q1處觀察到幾種可能的胰島素b鏈前體離子。選擇m/z為約686.83±0.50(5+離子)的胰島素b鏈前體離子進(jìn)行破碎。破碎研究顯示許多胰島素b鏈碎片離子。圖17中示出了示例性破碎光譜。研究了碰撞能對(duì)人胰島素b鏈5+前體離子(m/z為約686.9±0.50)的破碎模式的影響。在范圍從約7v至約80v的碰撞能下破碎前體離子，并監(jiān)測(cè)選擇的5種碎片離子(m/z為約906.0±0.50、825.0±0.50、768.5±0.50、753.0±0.50和703.0±0.50)的相對(duì)強(qiáng)度。圖18中展示了這些研究的結(jié)果。如圖18所見，碎片離子的相對(duì)強(qiáng)度根據(jù)碰撞能顯著變化。表8中示出了每個(gè)監(jiān)測(cè)相變的近似最佳碰撞能值。表8.對(duì)人胰島素b鏈5+前體離子觀察到的示例性質(zhì)量相變的最佳碰撞能(正極性-酸性條件)前體離子(m/z)產(chǎn)物離子(m/z)最佳碰撞能(近似)686.9±0.50(5+)703.0±0.5017v753.0±0.5016v768.5±0.5020v825.0±0.5016v906.0±0.5014v選擇m/z為約768.5±0.50和753.2±0.50的人胰島素b鏈碎片離子用于定量。用實(shí)施例8中均有描述的牛胰島素(內(nèi)標(biāo)1)和同位素標(biāo)記胰島素b鏈(內(nèi)標(biāo)2)進(jìn)行類似研究。表9中示出了對(duì)選擇用于進(jìn)一步定量的每種類型的胰島素b鏈監(jiān)測(cè)到的質(zhì)量相變。表9.為定量胰島素b鏈監(jiān)測(cè)的示例性質(zhì)量相變(正極性-酸性條件)雖然可通過監(jiān)測(cè)表8所示每條胰島素b鏈的2個(gè)質(zhì)量相變完成定量，但是可通過僅監(jiān)測(cè)單個(gè)質(zhì)量相變完成任何所示分析物的定量。相反，可選擇另外的質(zhì)量相變(包括，例如，圖17中觀察到的任何其它人胰島素b鏈碎片離子)以任何組合代替或增大以上監(jiān)測(cè)的任何相變。實(shí)施例11：測(cè)定內(nèi)和測(cè)定間準(zhǔn)確性、再現(xiàn)性和精度研究用由用8、12、20、40和80μiu/ml人胰島素示蹤的反萃血清(biocelllaboratoriesinc.，1131-00，批次hhp03)制成的5種qc混合血清(pool)進(jìn)行實(shí)施例8-10中所述測(cè)定的測(cè)定內(nèi)和測(cè)定間準(zhǔn)確性、再現(xiàn)性和精度研究，以覆蓋假定可報(bào)道測(cè)定范圍。在單次測(cè)定中分析了來自5種qc混合血清的每一種的8種復(fù)制品以確定測(cè)定中樣品的變異系數(shù)(cv)。表10中示出了由這些研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)證明，5種qc混合血清的再現(xiàn)性(cv)范圍從3.0至7.9％，全部在可接受水平內(nèi)(即，≤15％cv，除可接受≤20％cv的loq水平外)。對(duì)表10中提出的數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析揭示每種混合血清的測(cè)定內(nèi)精度在80-120％可接受范圍內(nèi)。表10.測(cè)定內(nèi)變異和精度為研究測(cè)定間變異，在不同的5天分析來自5種qc混合血清的每一種的8種復(fù)制品。表11中示出了由這些研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。所述混合血清的測(cè)定間變異(％cv)范圍從7.1至14.0％。8、12、20、40和80μiu/ml靶向胰島素水平的總變異分別為14.0％、10.2％、10.0％、7.5％和7.1％。對(duì)所有混合血清的分析滿足可接受再現(xiàn)性≤15％cv的要求，除可接受≤20％cv的loq水平外。對(duì)表11中提出的數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析揭示每種混合血清的測(cè)定間精度在80-120％可接受范圍內(nèi)。表11.測(cè)定間變異和精度實(shí)施例12：分析靈敏度：空白限(lob)、檢測(cè)限(lod)和定量限(loq)選擇性是分析方法在樣品中有其它組分存在時(shí)區(qū)分并量化分析物的能力。lob和lod均為測(cè)量值大于與之測(cè)量相關(guān)的不確定度的指標(biāo)。將lob定義為與零濃度的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。將lod定義為與零濃度的4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)于選擇性試驗(yàn)，獲得適當(dāng)生物基質(zhì)的空白樣品(反萃血清)，測(cè)試干擾，并通過實(shí)施例8-10中描述的方法分析。測(cè)量空白反萃血清樣品14次。統(tǒng)計(jì)分析這些研究的結(jié)果，給定lob為1.4μiu/ml而lod為1.8μiu/ml。lloq是測(cè)量在數(shù)量上變得有意義的點(diǎn)。在這個(gè)lloq的分析物反應(yīng)可識(shí)別、不連續(xù)并且可重現(xiàn)，準(zhǔn)確性為20％并且精度為80％-120％。通過在接近預(yù)期lloq的濃度下(1.25、2.5、5、10、15和25μiu/ml)，測(cè)定用人胰島素示蹤的6種反萃血清樣本測(cè)定lloq，然后估計(jì)7次的測(cè)定內(nèi)再現(xiàn)性。分析這些研究的數(shù)據(jù)并繪圖(示于圖19中)并且由曲線確定lloq為3μiu/ml，獲得可接受性能的最低濃度，此時(shí)cv的95％置信區(qū)間仍低于20％。實(shí)施例13：測(cè)定可報(bào)道范圍和線性度為確定實(shí)施例8-10中所述測(cè)定的線性范圍，制備了8種示蹤反萃血清樣品(人胰島素濃度為5、10、15、25、50、100、200和300μiu/ml)并且在單獨(dú)的5天分析。連續(xù)5次的加權(quán)(1/x)線性回歸產(chǎn)生0.995或更高的相關(guān)系數(shù)，精度為±20％，揭示可量化范圍為5-300μiu/ml。圖20中示出了示例性校準(zhǔn)曲線。實(shí)施例14：樣本類型研究可通過在6種不同類型的bdvacutainertm管中收集10種人類患者混合血清(普通血清、sst、edta血漿、肝素鈉血漿、肝素鋰血漿和檸檬酸鈉血漿)估計(jì)基質(zhì)特異性。然后根據(jù)實(shí)施例8-10中描述的方法萃取并分析來自每種混合血清的樣品的胰島素。這些研究表明，不可接受檸檬酸鈉血漿樣品進(jìn)行分析，但是所有其它樣品類型可接受。實(shí)施例15：干擾研究通過示蹤低、中和高溶血性患者樣品中不同水平的胰島素估計(jì)溶血干擾對(duì)胰島素測(cè)定的影響。然后根據(jù)實(shí)施例8-10中描述的方法萃取并分析胰島素。這些研究的結(jié)果表明，對(duì)高和中等溶血樣品獲得可接受的結(jié)果(即，在80-120％精度內(nèi))。高溶血樣品不可接受。通過示蹤低、中和高脂血性患者樣品中不同水平的胰島素估計(jì)脂血干擾對(duì)胰島素測(cè)定的影響。然后根據(jù)實(shí)施例8-10中描述的方法萃取并分析胰島素。這些研究的結(jié)果表明，對(duì)于所有水平的脂血均獲得可接受的結(jié)果(即，在80-120％精度內(nèi))。通過示蹤低、中和高黃疸患者樣品中不同水平的胰島素估計(jì)膽紅素干擾對(duì)胰島素測(cè)定的影響。然后根據(jù)實(shí)施例8-10中描述的方法萃取并分析胰島素。這些研究的結(jié)果表明，對(duì)于所有水平的膽紅素均獲得可接受的結(jié)果(即，在80-120％精度內(nèi))。本文提及或引用的論文、專利和專利申請(qǐng)及所有其它文檔和以電子方式提供的信息均以引用方式整體并入，如同特別單獨(dú)地指出將每個(gè)單獨(dú)的公布以引用方式并入一樣。申請(qǐng)人保留將來自任何此類論文、專利、專利申請(qǐng)或其它物理和電子文檔的所有任何材料完全并入本申請(qǐng)的權(quán)利。本文說明性描述的方法可適合在不存在本文未特別公開的任何元素、限制的情況下實(shí)施。因此，例如，應(yīng)從廣義上理解術(shù)語“包含”、“包括”、“含有”等并且不受限制。另外，已經(jīng)將本文采用的術(shù)語和表達(dá)用作描述而非限制性術(shù)語，并且不打算使用不包括顯示并描述的特征的任何等效形式或其部分的此類術(shù)語和表達(dá)。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)可能有各種修改。因此，應(yīng)理解，雖然已經(jīng)通過優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征特別公開了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可采取本文公開的其中體現(xiàn)的本發(fā)明的修改和變化，并且認(rèn)為此類修改和變化在本發(fā)明范圍內(nèi)。本文已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了廣泛且一般性的描述。屬于一般公開內(nèi)容的每一狹窄種類和下位分組也構(gòu)成所述方法的一部分。這包括對(duì)所述方法的帶有限制型條款的一般描述，或?qū)λ龇椒ǖ膸в袕姆N中除去任何主題的負(fù)面限定的一般描述，無論所除去的主題是否在本文中被具體引用。其它實(shí)施方案在下列權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。另外，當(dāng)根據(jù)馬庫(kù)西群組(markushgroup)描述所述方法的特征或方面時(shí)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，還據(jù)此根據(jù)馬庫(kù)西群組的任何單個(gè)成員或亞組成員來描述本發(fā)明。本發(fā)明包括以下內(nèi)容：1.一種通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生物樣品中胰島素的量的方法，所述方法包括：(a)使所述樣品經(jīng)受適合由胰島素生成胰島素b鏈的條件；(b)處理來自步驟(a)的所述樣品以獲得富含胰島素b鏈的成分；(c)在適合生成可通過質(zhì)譜法檢測(cè)的一種或多種胰島素b鏈離子的條件下使所述富集的胰島素b鏈經(jīng)受電離源；以及(d)通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定一種或多種胰島素b鏈離子的量，其中步驟(d)中測(cè)定的離子的量與所述樣品中胰島素的量有關(guān)。2.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中所述步驟(b)的處理包括通過固相萃取(spe)使胰島素b鏈富集。3.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中所述步驟(b)的處理包括通過高效液相色譜法(hplc)使胰島素b鏈富集。4.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中所述生物樣品包括人血漿或血清樣品。5.根據(jù)實(shí)施方案4所述的方法，其中當(dāng)取自人類時(shí)，所述測(cè)定的胰島素的量是所述樣品中存在的胰島素的量。6.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中所述電離源是電噴霧(esi)電離源。7.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中在正離子模式下電離之前使所述樣品經(jīng)受酸性條件。8.根據(jù)實(shí)施方案7所述的方法，其中使所述樣品經(jīng)受酸性條件包括使所述樣品經(jīng)受甲酸。9.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中所述胰島素b鏈在電離之前未經(jīng)化學(xué)修飾。10.根據(jù)實(shí)施方案9所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為1144.2±0.5、858.3±0.5和686.8±0.5的離子的胰島素b鏈前體離子。11.根據(jù)實(shí)施方案9所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為906.0±0.5、825.0±0.5、768.5±0.5、753.0±0.5、703.0±0.5、345.0±0.5和226.2±0.5的離子的一種或多種碎片離子。12.根據(jù)實(shí)施方案9所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自以下的一種或多種碎片離子：來自質(zhì)荷比(m/z)為1144.2±0.5的胰島素b鏈前體離子的碎片離子，來自m/z為858.3±0.5的胰島素b鏈前體離子的碎片離子和來自m/z為686.8±0.5的胰島素b鏈前體離子的碎片離子。13.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中所述串聯(lián)質(zhì)譜法包括生成質(zhì)荷比(m/z)為686.8±0.5的人胰島素b鏈前體離子并將所述前體離子破碎成選自m/z為906.0±0.5、825.0±0.5、768.5±0.5、753.0±0.5、703.0±0.5、345.0±0.5和226.2±0.5的離子的一種或多種碎片離子。14.根據(jù)實(shí)施方案13所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述離子包括來自m/z為768.5±0.5和753.0±0.5的離子的一種或多種離子。15.根據(jù)實(shí)施方案13所述的方法，其中以在10-25v范圍內(nèi)且包括10v和25v的碰撞能進(jìn)行所述破碎。16.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中所述胰島素b鏈在電離之前經(jīng)化學(xué)修飾。17.根據(jù)實(shí)施方案16所述的方法，其中所述化學(xué)修飾包括烷基化所述胰島素b鏈。18.根據(jù)實(shí)施方案17所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為1181.9±0.5、886.9±0.5和709.8±0.5的離子的烷基化胰島素b鏈前體離子。19.根據(jù)實(shí)施方案17所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為345.0±0.5和226.2±0.5的離子的一種或多種碎片離子。20.根據(jù)實(shí)施方案17所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自以下的兩種或更多種碎片離子：來自質(zhì)荷比(m/z)為1181.9±0.5的烷基化胰島素b鏈前體離子的碎片離子，來自m/z為886.9±0.5的烷基化胰島素b鏈前體離子的碎片離子和來自m/z為709.8±0.5的烷基化胰島素b鏈前體離子的碎片離子。21.根據(jù)實(shí)施方案20所述的方法，其中來自每種前體離子的所述碎片離子包括選自m/z為345.0±0.5和226.2±0.5的離子的離子。22.一種通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定取自人類時(shí)的生物學(xué)樣品中胰島素的量的方法，所述方法包括：(a)使所述樣品經(jīng)受固相萃取(spe)和高效液相色譜法(hplc)以由所述樣品獲得富含胰島素的成分；(b)在適合生成可通過質(zhì)譜法檢測(cè)的一種或多種胰島素離子的條件下使所述富集的胰島素經(jīng)受電離源；以及(c)通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定一種或多種胰島素離子的量，其中所述樣品在電離之前未經(jīng)受免疫純化；并且其中步驟(c)中測(cè)定的所述離子的量與所述樣品中胰島素的量有關(guān)。23.根據(jù)實(shí)施方案22所述的方法，其中所述生物樣品包括血漿或血清樣品。24.根據(jù)實(shí)施方案22所述的方法，其中所述電離源是電噴霧(esi)電離源25.根據(jù)實(shí)施方案22所述的方法，其中在正離子模式下電離之前使所述樣品經(jīng)受酸性條件。26.根據(jù)實(shí)施方案25所述的方法，其中使所述樣品經(jīng)受酸性條件包括使所述樣品經(jīng)受甲酸。27.根據(jù)實(shí)施方案25所述的方法，其中步驟(c)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為1162.5±0.5和968.9±0.5的離子的胰島素前體離子。28.根據(jù)實(shí)施方案27所述的方法，其中步驟(c)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自m/z為226.2±0.5和135.9±0.5的離子的一種或多種碎片離子。29.根據(jù)實(shí)施方案27所述的方法，其中所述一種或多種碎片離子包括來自m/z為1162.5±0.5的胰島素前體離子的一種或多種碎片離子和來自m/z為968.9±0.5的胰島素前體離子的一種或多種碎片離子。30.根據(jù)實(shí)施方案29所述的方法，其中來自每種前體離子的所述一種或多種碎片離子包括選自m/z為226.2±0.5和135.9±0.5的離子的一種或多種碎片離子。31.根據(jù)實(shí)施方案21所述的方法，其中在正離子模式下電離之前使所述樣品經(jīng)受堿性條件。32.根據(jù)實(shí)施方案31所述的方法，其中使所述樣品經(jīng)受堿性條件包括使所述樣品經(jīng)受氨。33.根據(jù)實(shí)施方案31所述的方法，其中步驟(c)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為1453.8±0.5和1163.0±0.5的離子的胰島素前體離子。34.根據(jù)實(shí)施方案33所述的方法，其中步驟(c)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自m/z為226.2±0.5和135.9±0.5的離子的一種或多種碎片離子。35.根據(jù)實(shí)施方案33所述的方法，其中所述一種或多種碎片離子包括來自m/z為1163.0±0.5的胰島素前體離子的一種或多種碎片離子和來自m/z為968.9±0.5的胰島素前體離子的一種或多種碎片離子。36.一種通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定樣品中胰島素的量的方法，所述方法包括：(a)使所述樣品經(jīng)受固相萃取(spe)和高效液相色譜法(hplc)以由所述樣品獲得富含胰島素的成分；(b)在適合生成可通過質(zhì)譜法檢測(cè)的胰島素前體離子的條件下使所述富集的胰島素經(jīng)受電離源，其中所述胰島素前體離子的質(zhì)荷比(m/z)為1162.5±0.5；(c)在約40-70ev范圍內(nèi)的碰撞能下使所述胰島素前體離子經(jīng)受碰撞誘導(dǎo)解離以生成可通過質(zhì)譜法檢測(cè)的一種或多種碎片離子；以及(d)通過質(zhì)譜法測(cè)定一種或多種所述碎片離子的量，其中步驟(d)中測(cè)定的所述離子的量與所述樣品中胰島素的量有關(guān)。37.根據(jù)實(shí)施方案36所述的方法，其中所述樣品包括生物樣品。38.根據(jù)實(shí)施方案36所述的方法，其中所述樣品包括血漿或血清樣品。39.根據(jù)實(shí)施方案36所述的方法，其中所述樣品包括取自人類的生物樣品，并且所述方法用于測(cè)定取自人類時(shí)的生物樣品中胰島素的量。40.根據(jù)實(shí)施方案36所述的方法，其中所述電離條件包括在電離之前使所述樣品經(jīng)受酸性條件。41.根據(jù)實(shí)施方案40所述的方法，其中使所述樣品經(jīng)受酸性條件包括使所述樣品經(jīng)受甲酸。42.根據(jù)實(shí)施方案36所述的方法，其中所述電離條件包括在電離之前使所述樣品經(jīng)受堿性條件。43.根據(jù)實(shí)施方案42所述的方法，其中使所述樣品經(jīng)受堿性條件包括使所述樣品經(jīng)受氨。44.根據(jù)實(shí)施方案36所述的方法，其中在正離子模式下用電噴霧電離(esi)源進(jìn)行所述電離。45.根據(jù)實(shí)施方案36所述的方法，其中所述碰撞能在約40-60ev范圍內(nèi)。46.根據(jù)實(shí)施方案36所述的方法，其中所述碰撞能在約40-50ev范圍內(nèi)。47.根據(jù)實(shí)施方案36所述的方法，其中所述一種或多種碎片離子包括選自m/z為226.2±0.5和135.9±0.5的離子的一種或多種離子。48.一種通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定取自人類時(shí)的生物學(xué)樣品中胰島素的量的方法，所述方法包括：(a)使樣品經(jīng)受適合由胰島素生成胰島素a鏈的條件；(b)使來自步驟(a)的樣品經(jīng)受固相萃取(spe)和高效液相色譜法(hplc)以獲得富含胰島素a鏈的成分；(c)在適合生成可通過質(zhì)譜法檢測(cè)的一種或多種胰島素a鏈離子的條件下使所述富集的胰島素a鏈經(jīng)受電離源；以及(d)通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定一種或多種胰島素a鏈離子的量，其中步驟(d)中測(cè)定的離子的量與所述樣品中胰島素的量有關(guān)。49.根據(jù)實(shí)施方案48所述的方法，其中所述生物樣品包括血漿或血清樣品。50.根據(jù)實(shí)施方案48所述的方法，其中所述電離源是電噴霧(esi)電離源。51.根據(jù)實(shí)施方案48所述的方法，其中在正離子模式下電離之前使所述樣品經(jīng)受酸性條件。52.根據(jù)實(shí)施方案41所述的方法，其中使所述樣品經(jīng)受酸性條件包括使所述樣品經(jīng)受甲酸。53.根據(jù)實(shí)施方案48所述的方法，其中步驟(a)中生成的所述胰島素a鏈在電離之前未經(jīng)化學(xué)修飾。54.根據(jù)實(shí)施方案53所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為1192.9±0.5和795.4±0.5的離子的胰島素a鏈前體離子。55.根據(jù)實(shí)施方案53所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為570.0±0.5、456.0±0.5、293.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。56.根據(jù)實(shí)施方案53所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括來自質(zhì)荷比(m/z)為1192.9±0.5的胰島素a鏈前體離子的一種或多種碎片離子和來自m/z為795.4±0.5的胰島素a鏈前體離子的一種或多種碎片離子。57.根據(jù)實(shí)施方案56所述的方法，其中來自每種前體離子的所述一種或多種碎片離子包括選自m/z為570.0±0.5、456.0±0.5、293.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。58.根據(jù)實(shí)施方案48所述的方法，進(jìn)一步包括在電離之前化學(xué)修飾步驟(a)中生成的所述胰島素a鏈。59.根據(jù)實(shí)施方案58所述的方法，其中所述化學(xué)修飾包括烷基化所述胰島素a鏈。60.根據(jù)實(shí)施方案59所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為1306.0±0.5和871.0±0.5的離子的烷基化胰島素a鏈前體離子。61.根據(jù)實(shí)施方案59所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為570.0±0.5、456.0±0.5、293.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。62.根據(jù)實(shí)施方案59所述的方法，其中步驟(d)中測(cè)定的所述一種或多種離子包括來自質(zhì)荷比(m/z)為1306.0±0.5的烷基化胰島素a鏈前體離子的一種或多種碎片離子和來自m/z為871.0±0.5的烷基化胰島素a鏈前體離子的一種或多種碎片離子。63.根據(jù)實(shí)施方案62所述的方法，其中來自每種烷基化前體離子的所述一種或多種碎片離子包括選自m/z為570.0±0.5、456.0±0.5、293.0±0.5和133.0±0.5的離子的一種或多種碎片離子。64.一種通過高分辨率/高精度質(zhì)譜法測(cè)定樣品中胰島素的量的方法，所述方法包括：(a)在適合生成多電荷胰島素離子的條件下，使來自所述樣品的胰島素經(jīng)受電離源，其中可通過質(zhì)譜法檢測(cè)所述多電荷胰島素離子；(b)通過高分辨率/高精度質(zhì)譜法測(cè)定一種或多種多電荷胰島素離子的量；其中步驟(b)中測(cè)定的所述離子的量與所述樣品中胰島素的量有關(guān)。65.根據(jù)實(shí)施方案64所述的方法，其中在10,000或更高的fwhm和50ppm或更低的質(zhì)量精度下進(jìn)行所述高分辨率/高精度質(zhì)譜法。66.根據(jù)實(shí)施方案64所述的方法，其中在15,000或更高的fwhm和20ppm或更低的質(zhì)量精度下進(jìn)行所述高分辨率/高精度質(zhì)譜法。67.根據(jù)實(shí)施方案64所述的方法，其中在20,000或更高的fwhm和5ppm或更低的質(zhì)量精度下進(jìn)行所述高分辨率/高精度質(zhì)譜法。68.根據(jù)實(shí)施方案64所述的方法，其中用高分辨率/高精度飛行時(shí)間(tof)質(zhì)譜儀進(jìn)行所述高分辨率/高精度質(zhì)譜法。69.根據(jù)實(shí)施方案64所述的方法，其中所述電離源是電噴霧(esi)電離源。70.根據(jù)實(shí)施方案64所述的方法，其中所述電離條件包括在酸性條件下電離胰島素。71.根據(jù)實(shí)施方案69所述的方法，其中所述酸性條件包括在電離之前用甲酸處理所述樣品。72.根據(jù)實(shí)施方案64所述的方法，其中所述一種或多種多電荷胰島素離子包括選自4+、5+和6+電荷胰島素離子的一種或多種離子。73.根據(jù)實(shí)施方案72所述的方法，其中所述一種或多種多電荷胰島素離子包括6+電荷胰島素離子。74.根據(jù)實(shí)施方案73所述的方法，其中所述一種或多種6+電荷胰島素離子包括質(zhì)荷比(m/z)在約968.0±1.5范圍內(nèi)的一種或多種離子。75.根據(jù)實(shí)施方案73所述的方法，其中所述一種或多種呈6+電荷態(tài)的胰島素離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為968.28±0.1、968.45±0.1、968.62±0.1、968.79±0.1、968.95±0.1、968.12±0.1、968.28±0.1、968.45±0.1和968.61±0.1的離子的一種或多種離子。76.根據(jù)實(shí)施方案72所述的方法，其中所述一種或多種多電荷胰島素離子包括5+電荷胰島素離子。77.根據(jù)實(shí)施方案76所述的方法，其中所述一種或多種呈5+電荷態(tài)的胰島素離子包括質(zhì)荷比(m/z)在約1162.5±1.0范圍內(nèi)的一種或多種離子。78.根據(jù)實(shí)施方案76所述的方法，其中所述一種或多種呈5+電荷態(tài)的胰島素離子包括選自質(zhì)荷比(m/z)為1161.72±0.1、1161.92±0.1、1162.12±0.1、1162.32±0.1、1162.52±0.1、1162.72±0.1、1162.92±0.1、1163.12±0.1和1163.34±0.1的離子的一種或多種離子。79.根據(jù)實(shí)施方案76所述的方法，其中所述一種或多種呈5+電荷態(tài)的胰島素離子包括質(zhì)荷比(m/z)為1162.54±0.1的離子。80.根據(jù)實(shí)施方案72所述的方法，其中所述一種或多種多電荷胰島素離子包括4+電荷胰島素離子。81.根據(jù)實(shí)施方案80所述的方法，其中所述一種或多種呈4+電荷態(tài)的胰島素離子包括質(zhì)荷比(m/z)在約1452.9±0.8范圍內(nèi)的一種或多種離子。82.根據(jù)實(shí)施方案64所述的方法，其中在電離之前通過高效液相色譜法(hplc)從所述樣品中純化胰島素。83.根據(jù)實(shí)施方案81所述的方法，其中在hplc之前使樣品經(jīng)受固相萃取(spe)。84.根據(jù)實(shí)施方案64所述的方法，其中所述樣品包括生物樣品。85.根據(jù)實(shí)施方案64所述的方法，其中所述樣品來自人類。86.根據(jù)實(shí)施方案64所述的方法，其中所述樣品包括血漿或血清樣品。87.根據(jù)實(shí)施方案64所述的方法，其中所述樣品是來自人類的生物樣品，并且所述方法用于測(cè)定取自人類時(shí)的所述樣品中胰島素的量。當(dāng)前第1頁(yè)12