本發(fā)明涉及藥材質(zhì)量的檢測方法，具體涉及苦瓜葉中總黃酮含量的檢測方法。

背景技術(shù)：

苦瓜葉為葫蘆科苦瓜屬一年生蔓性草本植物苦瓜(Momordica charantia L.)的干燥葉。性涼、味苦。具清熱解毒、殺菌、止痢、止痛的功效，能治療胃痛，痢疾，疔瘡腫毒?？喙先~作為常用民間藥，使用廣泛，常用于治療蚊蟲叮咬后皮膚的紅腫熱痛、小兒痱子、熱毒瘡腫、楊梅瘡、狗咬和鵝掌風(fēng)。

苦瓜葉資源豐富，療效確切，民間使用廣泛，認(rèn)可度高且方便易得，具有較好的開發(fā)價值。但是目前，國內(nèi)外多對苦瓜果實(shí)進(jìn)行多角度研究而其葉研究甚少，尚缺乏對苦瓜葉的質(zhì)量評價方法和標(biāo)準(zhǔn)。

因此，為了確?？喙先~的質(zhì)量和安全，需要一種檢測方法，用于評估苦瓜葉的質(zhì)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種苦瓜葉中總黃酮含量的檢測方法，包括以下步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

a、對照品溶液的制備：

取蘆丁對照品，加乙醇配制成對照品溶液；

b、對照品溶液的測定：

取對照品溶液，依次加入5％亞硝酸鈉溶液、10％硝酸鋁溶液、氫氧化鈉溶液，乙醇定容，在紫外分光光度儀中于506nm下測定吸光度，根據(jù)檢測結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(2)待測樣品中總黃酮含量的測定：

c、供試品溶液的制備：

取待測苦瓜葉樣品，60℃～90℃的石油醚回流提取，過濾，棄去濾液，重復(fù)一次，取殘?jiān)?0％～90％的乙醇超聲或回流提取，過濾，用相應(yīng)濃度的乙醇補(bǔ)足所失重量，得供試品溶液；

d、供試品溶液的測定：

取供試品溶液，以步驟b的方法進(jìn)行測定，根據(jù)步驟(1)的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測樣品中總黃酮的含量。

進(jìn)一步地，步驟a中，所述乙醇為50％乙醇。

進(jìn)一步地，步驟b中，所述5％亞硝酸鈉溶液與對照品溶液的體積比為1：1。

進(jìn)一步地，步驟b中，所述10％硝酸鋁溶液溶液與對照品溶液的體積比為1：1。

進(jìn)一步地，步驟b中，所述氫氧化鈉溶液與對照品溶液的體積比為10：1。

進(jìn)一步地，步驟c中，所述乙醇為80％的乙醇。

進(jìn)一步地，步驟c中，所述乙醇提取為回流提取。

進(jìn)一步地，所述乙醇回流提取的時間為0.5～3小時，優(yōu)選1.5小時。

進(jìn)一步地，所述乙醇回流提取的溫度為60℃～80℃。

進(jìn)一步地，所述乙醇回流提取的溫度為70℃。

進(jìn)一步地，所述乙醇與待測苦瓜葉樣品的體積質(zhì)量比為100mL：1g～160mL：1g，優(yōu)選140mL：1g。

本發(fā)明苦瓜葉中總黃酮含量的檢測方法，通過多個工藝的篩選，可以準(zhǔn)確、可靠、簡便地檢測苦瓜葉中總黃酮的含量，從而有效監(jiān)控苦瓜葉藥材的質(zhì)量，為苦瓜葉的臨床療效提供了有效保障。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1苦瓜葉總黃酮紫外測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2不同產(chǎn)地苦瓜葉總黃酮含量測定。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例所用實(shí)驗(yàn)材料如下：

不同采收地點(diǎn)的樣品于2011年8月前后分別采自四川省成都市、彭州市、簡陽市、內(nèi)江市、自貢市、宜賓市及河北保定，浙江嘉興，廣東佛山等地。采集新鮮葉，除去雜質(zhì)，陰干即得。以上實(shí)驗(yàn)樣品均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蔣桂華教授鑒定為葫蘆科植物苦瓜Momordica charantia L.的干燥葉。樣品采集地點(diǎn)、時間及生長環(huán)境見表1。

于2011年8月20日對口采于四川省彭州市敖平鎮(zhèn)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蔣桂華教授鑒定為葫蘆科苦瓜屬植物苦瓜Momordica charantia L.的干燥葉，作為對照藥材；所用試劑均為分析純。

表1不同產(chǎn)地苦瓜葉樣品

儀器如下：

紫外分光光度計(jì)(日本島津UV-1600型)，真空干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，DZG-6090型)，十萬分之一電子天平(德國SartoriusBP211D)，超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ5200E型)，電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，YP601N)等。

試藥與試劑如下：

蘆丁(中國藥品生物制品檢定所100080-201009)；石油醚，乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等均為分析純試劑。

實(shí)施例1

(1)總黃酮含量測定方法的考察

1對照品溶液

對照品溶液：取干燥至恒重的蘆丁對照品適量，精密稱定，置于100ml容量瓶，加入50％乙醇，定容，制成0.2mg/ml的蘆丁溶液。

2檢測波長考察

精密量取蘆丁溶液1.0ml，置于25ml容量瓶中，加入5％亞硝酸鈉溶液1.0ml，6min后加入10％硝酸鋁溶液1.0ml，6min后加入1mol/L氫氧化鈉試液10ml，15min后用50％乙醇定容。

將制好的蘆丁溶液，放入紫外分光光度計(jì)，于200～600nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，蘆丁溶液在506nm處有最大吸收。因此，將測定波長定為506nm。

3線性關(guān)系考察

照一定梯度分別精密量取蘆丁溶液適量，于25ml容量瓶中，顯色，定容，測定吸光度A。以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁溶液濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性方程A＝32.173x+0.0066，R2＝0.9977。在0.005～0.025mg/ml濃度范圍內(nèi)，吸光度值A(chǔ)與蘆丁溶液濃度C呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表2和圖1。

表2吸光度值與對照品濃度關(guān)系

4精密度考察

精密量取蘆丁溶液適量，7份，置于25ml容量瓶中，顯色，定容，測定吸光度A。結(jié)果見表3。

表3精密度考察

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘆丁溶液的吸光度值A(chǔ)穩(wěn)定，計(jì)算其RSD值，為0.12％，說明該精密度良好，可進(jìn)行蘆丁溶液的吸光度值A(chǔ)的測定。

5供試品溶液制備方法考察

5.1提取方法考察

取同一批次(表1中7號樣)苦瓜葉樣品粉末0.5g，6份，精密稱定，置于250ml錐形瓶中，加石油醚(60～90℃)50ml，水浴回流1h，濾過，棄去濾液。重復(fù)一次。殘?jiān)尤氩煌崛∪軇?0ml，稱重，采用不同提取方法下提取1小時，用相應(yīng)提取溶劑補(bǔ)至原重，過濾，取濾液4.0ml，置于25ml的容量瓶中，顯色，加入提取溶劑定容，測定吸光度A，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4供試品溶液提取方法考察

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：回流提取所測定的吸光度A明顯高于超聲提??；隨著乙醇濃度的升高，所測定的吸光度A也隨之升高，在乙醇濃度為80％時達(dá)到頂峰，隨后略有下降。80％乙醇回流提取時所測得的吸光度A最大，為0.870。因此，將苦瓜葉總黃酮的提取方法定為80％乙醇回流提取。

5.2回流溫度考察

取同一批次(表1中7號樣)苦瓜葉樣品粉末0.5g，6份，精密稱定，置于250ml錐形瓶中，加石油醚(60～90℃)50ml，水浴回流1h，濾過，棄去濾液。重復(fù)一次。殘?jiān)尤?0％乙醇50ml，稱重，在不同提取溫度下提取1小時，用80％乙醇補(bǔ)至原重，過濾，取濾液4.0ml于25ml的容量瓶中，顯色，用80％乙醇定容至25ml，測定吸光度，結(jié)果如表5。

表5提取溫度考察

結(jié)果顯示：70℃回流提取時所測定得到的吸光度A最大，故選擇回流提取溫度為70℃。

5.3提取時間考察

取同一批次(表1中7號樣)苦瓜葉樣品粉末0.5g，6份，精密稱定，置于250ml錐形瓶中，加石油醚(60～90℃)50ml，水浴回流1h，濾過，棄去濾液。重復(fù)一次。殘?jiān)?0％乙醇50ml，稱重，70℃回流提取不同時間，用80％乙醇補(bǔ)至原重，過濾，取濾液4.0ml于25ml的容量瓶中，顯色，用80％乙醇定容至25ml，測定吸光度，結(jié)果如表6。

表6提取時間考察

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著回流提取時間的延長，所測的吸光度A呈上升趨勢，當(dāng)回流提取時間為1.5h時，吸光度A最大，隨后趨于平穩(wěn)。即回流1.5h便可將苦瓜葉中黃酮類物質(zhì)基本提取完全。因此，將苦瓜葉總黃酮含量測定的供試品提取時間定為1.5h。

5.4料液比考察

取同一批次(表1中7號樣)苦瓜葉樣品粉末0.5g，6份，精密稱定，置于250ml錐形瓶中，加石油醚(60～90℃)50ml，水浴回流1h，濾過，棄去濾液。重復(fù)一次。殘?jiān)?0％乙醇不同體積，稱重，70℃回流提取1.5h，用80％乙醇補(bǔ)至原重，過濾，取濾液4.0ml于25ml的容量瓶中，顯色，用80％乙醇定容至25ml，測定吸光度，結(jié)果如表7。

表7料液比考察

結(jié)果顯示：提取溶劑為50ml時已能充分提取苦瓜葉中的總黃酮，當(dāng)提取溶劑為70ml時提取效率最高。

5.5本發(fā)明最佳的供試品溶液制備方法的確定

根據(jù)前述考察結(jié)果，確定本發(fā)明最佳的供試品溶液制備方法為：取苦瓜葉粉末0.5g，精密稱定，置于250ml錐形瓶中，加石油醚(60～90℃)50ml，水浴回流1h，濾過，棄去濾液。重復(fù)一次。殘?jiān)?0％乙醇50ml，稱重，70℃回流提取1.5h，用80％乙醇補(bǔ)至原重，過濾，即得供試品溶液。

6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察

取(表1中7號樣)苦瓜葉藥材粉末0.5g，精密稱定，照“5.5”項(xiàng)下苦瓜葉總黃酮含量測定供試品溶液制備方法制備供試品溶液。平行精密量取供試品溶液4.0ml共6份，置于25ml容量瓶中，分別顯色，80％乙醇定容，計(jì)時，每間隔10min測定一次吸光度值A(chǔ)。結(jié)果如表8。

表8苦瓜葉總黃酮測定穩(wěn)定性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：60min內(nèi)吸光度A無明顯變化，在0.546～0.550之間。計(jì)算得RSD值為0.26％，說明在本實(shí)驗(yàn)條件下，供試品溶液顯色60min內(nèi)吸光度值A(chǔ)穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性良好。

7重復(fù)性試驗(yàn)考察

取同一批次(表1中7號樣)苦瓜葉樣品粉末0.5g，6份，精密稱定，按“5.5”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液。取供試品溶液4.0ml于25ml的容量瓶中，顯色，用80％乙醇定容至25ml，測定吸光度。計(jì)算苦瓜葉藥材中總黃酮含量。結(jié)果如表9。

表9苦瓜葉總黃酮重復(fù)性試驗(yàn)

結(jié)果顯示：1～6平行供試品溶液的吸光度為0.617～0.636，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出1～6平行供試品總黃酮含量為1.19％～1.21％，平均含量為1.20％，計(jì)算得出其RSD值為0.68％，說明本實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。

8回收率實(shí)驗(yàn)

取同一批次(表1中7號)苦瓜葉樣品粉末0.5g，6份，精密稱定，加入蘆丁1mg，按“5.5”項(xiàng)下苦瓜葉總黃酮含量測定供試品溶液制備方法制備供試品溶液。取供試品溶液4.0ml于25ml容量瓶中，按顯色條件顯色，80％乙醇定容，測定吸光度，按回歸方程計(jì)算苦瓜葉總黃酮含量，結(jié)果見表10。

表10苦瓜葉總黃酮回收率考察

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：1～6號供試品的加樣回收率為99.94％～100.44％，均值為100.13％，計(jì)算其RSD為0.22％，說明本實(shí)驗(yàn)方法加樣回收率良好。

6.4苦瓜葉總黃酮含量測定

各取表1中10批苦瓜葉藥材粉末0.5g，精密稱定，照“5.5”項(xiàng)下苦瓜葉總黃酮含量測定供試品溶液制備方法制備供試品溶液。取供試品溶液4.0ml于25ml容量瓶中，按對照品溶液顯色條件顯色，80％乙醇定容，測定吸光度，按回歸方程計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見表11和圖2。

表11苦瓜葉總黃酮含量測定(n＝2)

綜上所述，本發(fā)明苦瓜葉中總黃酮含量的檢測方法，通過多個工藝的篩選，可以準(zhǔn)確、可靠、簡便地檢測苦瓜葉中總黃酮的含量，從而有效監(jiān)控苦瓜葉藥材的質(zhì)量，為苦瓜葉的臨床療效提供了有效保障。