本發(fā)明涉及免疫測(cè)定
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種熒光免疫層析檢測(cè)卡及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目前，檢測(cè)疾病標(biāo)志物的方法主要有放射免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECLIA)和POCT法等。放射免疫法因提取樣本或125I標(biāo)記不穩(wěn)定常出現(xiàn)較大誤差，靈敏度和特異性相對(duì)較低，測(cè)定方法復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，并且所需樣本量也較大，不是理想的測(cè)定方法。近年來，酶聯(lián)免疫分析法在疾病的臨床診斷中取得了廣泛的應(yīng)用，但是此方法試劑制備困難，操作步驟復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，影響因素多，控制難以保證，最后測(cè)定的是顏色的光密度，其精密度和敏感性不如發(fā)光免疫技術(shù)。目前，血清中的疾病標(biāo)志物檢測(cè)國(guó)內(nèi)外主要采用RocheElesys電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有極高的靈敏度，可定量分析樣本中疾病標(biāo)志物的含量，且準(zhǔn)確度高，但檢測(cè)操作較POCT法復(fù)雜，且采用電化學(xué)發(fā)光免疫熒光法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)多為批量采集樣品進(jìn)行檢測(cè)，不適用于中小型醫(yī)院及個(gè)人進(jìn)行疾病標(biāo)志物濃度的檢測(cè)。除此之外，檢測(cè)所需的昂貴的儀器和試劑價(jià)格限制了化學(xué)發(fā)光免疫分析法的廣泛應(yīng)用。采用POCT法使用現(xiàn)有的檢測(cè)卡檢測(cè)疾病標(biāo)志物時(shí)，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、能快速得到結(jié)果、儀器體積小方便攜帶等優(yōu)點(diǎn)，但是靈敏度不高。因此有待開發(fā)一種通用的高靈敏度的疾病標(biāo)志物檢測(cè)卡。例如，心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，病情兇險(xiǎn)，死亡率高，如不能早期識(shí)別并及時(shí)處理，往往預(yù)后不佳，因此，對(duì)心力衰竭患者特別是急診送診的患者進(jìn)行快速診斷并給予盡早的治療非常重要。眾多研究表明，氨基末端B型鈉尿鈦原(NT-proBNP)是很好的心衰診斷標(biāo)志物。NT-proBNP濃度的檢測(cè)對(duì)于臨床上診斷心衰具有重要意義，NT-proBNP是美國(guó)和歐洲心臟病學(xué)會(huì)推薦使用的目前最好的用于評(píng)價(jià)心力衰竭的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)。由于血清中NT-proBNP濃度極低，通常情況下，采用POCT法時(shí)，判斷標(biāo)準(zhǔn)為是NT-proBNP濃度＞300ng/L即為陽性，使用傳統(tǒng)的免疫熒光技術(shù)制備的心衰標(biāo)志物檢測(cè)卡在檢測(cè)NT-proBNP時(shí)，靈敏度低，濃度極低的NT-proBNP很難被T線捕捉，難以檢測(cè)。因此開發(fā)一種高靈敏度的心衰標(biāo)志物檢測(cè)卡應(yīng)用于POCT法檢測(cè)NT-proBNP十分重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高靈敏度高、高特異性、高穩(wěn)定性的熒光免疫層析檢測(cè)卡及其制備方法和在疾病標(biāo)志物快速檢測(cè)中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種熒光免疫層析檢測(cè)卡，包括處理液A、處理液B和檢測(cè)卡，所述處理液A中含有偶聯(lián)熒光微球的針對(duì)待測(cè)抗原的抗體1；所述處理液B中含有偶聯(lián)生物素的針對(duì)待測(cè)抗原的抗體2，所述檢測(cè)卡包括檢測(cè)線區(qū)域和質(zhì)控線區(qū)域，所述檢測(cè)線區(qū)域固定有鏈霉親和素檢測(cè)T線，所述質(zhì)控線區(qū)域固定有抗體質(zhì)控C線。上述的熒光免疫層析檢測(cè)卡，優(yōu)選地，所述熒光微球?yàn)闊晒夥肿油ㄟ^內(nèi)部包埋的方式形成熒光微球，所述T線劃線物質(zhì)為鏈霉親和素，所述C線劃線抗體為羊抗鼠抗體。上述的熒光免疫層析檢測(cè)卡，優(yōu)選地，所述待測(cè)抗原為NT-proBNP。上述的熒光免疫層析檢測(cè)卡，優(yōu)選地，所述抗體1為抗體15C4或抗體5B6，所述抗體2為抗體13G12或抗體15F11。作為一個(gè)總的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種熒光免疫層析檢測(cè)卡的制備方法，包括以下步驟：(1)配制處理液A：(1.1)將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-羥基琥珀酰亞胺溶液加入到羧基熒光微球中進(jìn)行活化，活化后離心，收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液重懸，得到活化后的羧基熒光微球分散液；(1.2)將抗體1加入到步驟(1.1)所得的活化后的羧基熒光微球分散液中進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，離心后取沉淀物，得到偶聯(lián)抗體1的羧基熒光微球；(1.3)向步驟(1.2)所得的偶聯(lián)抗體1的羧基熒光微球中加入牛血清白蛋白，封閉未偶聯(lián)抗體的活化羧基位點(diǎn)，封閉后離心，取沉淀，加入抗體保存液，得到處理液A；(2)配制處理液B：將抗體2加入到生物素溶液中進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，稀釋后透析，以去除未結(jié)合的生物素，收集樣品，得到處理液B；(3)檢測(cè)卡劃線：采用鏈霉親和素溶液在檢測(cè)卡的檢測(cè)線區(qū)域內(nèi)劃T線，采用抗體溶液在檢測(cè)卡的質(zhì)控線區(qū)域內(nèi)劃C線。上述的熒光免疫層析檢測(cè)卡的制備方法，優(yōu)選地，所述步驟(1.1)中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與羧基熒光微球的質(zhì)量比為1∶1，所述N-羥基琥珀酰亞胺與羧基熒光微球的質(zhì)量比為1∶1，活化時(shí)間為45min。上述的熒光免疫層析檢測(cè)卡的制備方法，優(yōu)選地，所述步驟(1.2)中，所述抗體1與羧基熒光微球的質(zhì)量比為3∶500，所述偶聯(lián)反應(yīng)溫度為4℃，時(shí)間為8h～12h。上述的熒光免疫層析檢測(cè)卡的制備方法，優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述抗體2與所述生物素的摩爾比為1∶50～200，偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為4h，透析溫度為4℃，時(shí)間為48h。上述的熒光免疫層析檢測(cè)卡的制備方法，優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述鏈霉親和素溶液的濃度為10μg/μL，所述抗體溶液的濃度為1μg/cm。作為一個(gè)總的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的熒光免疫層析檢測(cè)卡或上述的熒光免疫層析檢測(cè)卡的制備方法所制備的熒光免疫層析檢測(cè)卡在疾病的早期診斷中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1、本發(fā)明基于熒光免疫層析法，同時(shí)結(jié)合生物素-鏈霉親和素標(biāo)記技術(shù)，提供了一種高靈敏度待測(cè)抗原檢測(cè)卡及其制備方法。鏈霉親和素與生物素都可與蛋白質(zhì)(包括抗原、抗體、酶等)、熒光素等分子結(jié)合而不影響后者的生物活性，是理想的標(biāo)記劑。一個(gè)抗體分子可偶聯(lián)數(shù)十個(gè)生物素或鏈霉親和素分子，而鏈霉親和素或生物素分子又可與酶或熒光素結(jié)合，利用生物素和鏈霉親和素之間極強(qiáng)的親和力以及鏈霉親和素具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的特性，從而組成一個(gè)生物放大系統(tǒng)，將信號(hào)多極放大，并且生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)(BAS)具有高特異性、高靈敏度、高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高。從而實(shí)現(xiàn)痕量物質(zhì)快速靈敏的檢測(cè)，成功地解決了痕量物質(zhì)濃度太低造成難以檢測(cè)的困擾。2、進(jìn)一步地，本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：使用熒光分子通過內(nèi)部包埋的方式形成熒光微球，所形成的熒光微球穩(wěn)定，不易淬滅，亮度強(qiáng)，靈敏度高。鏈霉親和素包被微粒子高效、均一、穩(wěn)定、通用，生物素化抗體與樣品中的抗原結(jié)合，使用鏈霉親和素劃線，利用生物素-鏈霉親和素之間極強(qiáng)的結(jié)合力，促進(jìn)標(biāo)記有熒光微球的抗體1和生物素化的抗體2捕捉樣品中的抗原，形成夾心結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物，通過標(biāo)記有生物素的免疫復(fù)合物與T線上的鏈霉親和素相結(jié)合，分別檢測(cè)T線(檢測(cè)線)上和C線(控制線)上的熒光強(qiáng)度,通過T線和C線上熒光強(qiáng)度的比值來定量樣品中疾病標(biāo)志物的濃度。鏈霉親和素-生物素是最牢固和特異的結(jié)合，保證了牢固的包被效果和特異的檢測(cè)結(jié)果。3、本發(fā)明的檢測(cè)卡所需儀器設(shè)備體積小，攜帶如方便，操作簡(jiǎn)單易于掌握，無需專業(yè)人員操作，并且檢測(cè)成本低。另外，只要針對(duì)不同的檢測(cè)項(xiàng)目更換相應(yīng)的處理液A和B，即可檢測(cè)不同的疾病標(biāo)志物。4、本發(fā)明尤其適用于NT-proBNP的快速檢測(cè)，利用生物素-鏈霉親和素標(biāo)記技術(shù)與免疫熒光法制備的NT-proBNP檢測(cè)卡能夠較靈敏地檢測(cè)出樣本中微量的NT-proBNP從而對(duì)心衰病人進(jìn)行準(zhǔn)確的快速診斷，結(jié)構(gòu)合理，使用鏈霉親和素劃?rùn)z測(cè)線，建立免疫層析法檢測(cè)樣品中NT-proBNP的含量。特異性強(qiáng)，靈敏度高，最低檢測(cè)濃度達(dá)20ng/ml；另外，本發(fā)明制備的抗體15C4標(biāo)記的熒光微球和生物素標(biāo)記的抗體13G12冷凍干燥后進(jìn)行保存，穩(wěn)定性好，常溫保存12個(gè)月檢測(cè)卡與4℃保存的檢測(cè)結(jié)果一致。附圖說明圖1為本發(fā)明的熒光免疫層析檢測(cè)卡的結(jié)構(gòu)原理示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1的NT-proBNP熒光免疫層析檢測(cè)卡檢測(cè)不同NT-proBNP濃度對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度擬合曲線。具體實(shí)施方式以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，以下實(shí)施例描述了本發(fā)明的特殊實(shí)施例子，以便對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，這些實(shí)施例只是說明而不表示本發(fā)明所有的可能性，本發(fā)明并不僅僅局限于這些實(shí)施例中的材料、反應(yīng)條件或參數(shù)。任何在相關(guān)領(lǐng)域具備經(jīng)驗(yàn)的人，都可以按照本專利的原理利用其他的材料或反應(yīng)條件實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所描述的生物素-鏈霉親和素標(biāo)記技術(shù)結(jié)合免疫層析技術(shù)制備疾病標(biāo)志物檢測(cè)卡。這些并不脫離本發(fā)明描述的基本概念，因此這些修改的或者不同的應(yīng)該都在本發(fā)明覆蓋的范圍內(nèi)。實(shí)施例1：一種本發(fā)明的NT-proBNP熒光免疫層析檢測(cè)卡，包括處理液A、處理液B和檢測(cè)卡，其中，處理液A中含有偶聯(lián)熒光微球的抗體15C4；處理液B中含有偶聯(lián)生物素的抗體13G12，檢測(cè)卡包括檢測(cè)線區(qū)域和質(zhì)控線區(qū)域，檢測(cè)線區(qū)域固定有鏈霉親和素檢測(cè)T線，所述質(zhì)控線區(qū)域固定有羊抗鼠抗體質(zhì)控C線。上述本實(shí)施例的NT-proBNP熒光免疫層析檢測(cè)卡的制備方法，包括以下步驟：(1)配制處理液A：(1.1)吸取200μL羧基熒光微球(濃度為10mg/mL)，離心(14400rpm，10min)。取1000μLpH6.0MES緩沖液清洗，離心(14400rpm，8min)，重復(fù)該操作一次。稱取0.0110g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶于110μL的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液中，稱取0.0034gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于34μLMES緩沖液中。向熒光微球中分別加入1250μLMES緩沖液、25μL上述EDC溶液和25μL上述NHS溶液，室溫下攪拌(60rpm)，活化45min。取1000μLpH7.4的10mM磷酸鹽(PB)緩沖液清洗，離心(14400rpm，10min)，重復(fù)該操作一次。清洗結(jié)束后，用1250μLPB緩沖液重懸，得到活化后的羧基熒光微球分散液。(1.2)在步驟(1.1)所得的活化后的羧基熒光微球分散液中加入1.64μL抗體15C4(9.2mg/mL)，在4℃的條件下過夜進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。離心(14400rpm，8min)后取沉淀物，得到偶聯(lián)抗體15C4的羧基熒光微球。(1.3)向步驟(1.2)所得的偶聯(lián)抗體15C4的羧基熒光微球中加入250μL牛血清白蛋白(BSA)，室溫下封閉2h，以封閉未偶聯(lián)抗體的活化羧基位點(diǎn)，封閉后離心(14400rpm，8min)，取沉淀，用1000μL10mMPB清洗一次，加入250μL抗體保存液，4℃保存，得到處理液A。(2)配制處理液B：取100μg抗體13G12加入到生物素中進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，抗體與生物素的摩爾比1:100，總體積50μL，室溫下反應(yīng)4h；反應(yīng)完成后稀釋溶液到250μL，4℃透析48h；以去除未結(jié)合的生物素，收集樣品，得到處理液B；(3)檢測(cè)卡劃線：制備濃度10μg/μL的鏈霉親和素溶液，濃度為1μg/cm的羊抗鼠IgG；分別使用上述濃度的鏈霉親和素溶液在檢測(cè)卡的檢測(cè)線區(qū)域內(nèi)劃T線，羊抗鼠IgG在檢測(cè)卡的質(zhì)控線區(qū)域內(nèi)劃C線；4℃保存?zhèn)溆?。上述本?shí)施例制備的NT-proBNP熒光免疫層析檢測(cè)卡在檢測(cè)NT-proBNP中的應(yīng)用，包括如下步驟：S1：將步驟(1)配制的處理液A(含偶聯(lián)熒光微球的抗體15C4)與血液樣品混合，抗體15C4與血液樣品中的NT-proBNP(抗原)形成抗原抗體復(fù)合物，再向其中加入步驟(2)配制的處理液B(含生物素標(biāo)記的抗體13G12)，抗體13G12與NT-proBNP結(jié)合，形成夾心結(jié)構(gòu)復(fù)合物。將混合物樣本滴入檢測(cè)卡的滴樣孔內(nèi)。檢測(cè)原理示意圖如圖1所示，(2)結(jié)果判定：使用定量熒光免疫分析儀進(jìn)行掃描，得到熒光強(qiáng)度曲線，經(jīng)特定算法分析計(jì)算后得到一個(gè)無量綱的比值T/C(檢測(cè)線上與質(zhì)控線上熒光強(qiáng)度比值)，參照標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線就可以得到待測(cè)樣本中NT-proBNP的濃度。檢測(cè)結(jié)果如表1和圖2所示。表1不同NT-proBNP濃度對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度比值編號(hào)T/C抗原濃度11.5960209721.2951157330.8872104940.709169950.620652560.516239370.453826280.413423390.3571131100.323178110.315366120.295633130.291726140.288720150.265116160.24120由表1和圖2可知，本發(fā)明利用生物素-鏈霉親和素標(biāo)記技術(shù)與免疫熒光法制備的NT-proBNP檢測(cè)卡能夠較靈敏地檢測(cè)出樣本中微量的NT-proBNP從而對(duì)心衰病人進(jìn)行準(zhǔn)確的快速診斷，結(jié)構(gòu)合理，使用鏈霉親和素劃?rùn)z測(cè)線，建立免疫層析法檢測(cè)樣品中NT-proBNP的含量。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施例。凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)該指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下的改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3