本發(fā)明涉及生物大分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種基于比色陣列傳感器與手機(jī)聯(lián)用檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

生物大分子的檢測(cè)在食品工業(yè)、生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要的作用。目前常用的分析方法有酶聯(lián)免疫法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、凝膠電泳法。雖然這些技術(shù)具有很高靈敏度和高特異性，但是操作復(fù)雜、分析時(shí)間較長(zhǎng)、成本高、效率低等缺陷，尤其在資源匱乏或場(chǎng)地檢測(cè)等實(shí)際應(yīng)用收到很大限制。

陣列傳感器用于生物大分子是近些年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種新型分析方法，該方法模擬哺乳動(dòng)物的嗅覺或味覺系統(tǒng)基于模式識(shí)別用于目標(biāo)物檢測(cè)，使用多種交互相應(yīng)的受體用于多種物質(zhì)進(jìn)行分析，能夠?qū)崿F(xiàn)平面上多點(diǎn)信息的同時(shí)獲取，極大地提高了分析效率和檢測(cè)通量。由于比色陣列傳感器具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單及成本低等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病診斷等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。因此開發(fā)比色陣列傳感器用于新型傳感材料和新的傳感機(jī)理仍然是主要的研究方向?；诩{米金的單一比色傳感器法已經(jīng)被用于疾病檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)中多種物質(zhì)的檢測(cè)，該傳感原理是“鑰匙和鎖”模式基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的。由于納米金制備簡(jiǎn)單，容易被多種生物大分子修飾，由待測(cè)物誘導(dǎo)納米金的聚集、解聚集和再生長(zhǎng)過(guò)程會(huì)改變其尺寸、形貌和組成，從而影響其等離子體共振吸收波長(zhǎng)的變化，最終導(dǎo)致膠體溶液的變化。

目前已報(bào)道的大多為蛋白質(zhì)的核酸適配體與納米金顆粒(AuNPs)復(fù)合，形成DNA-AuNPs復(fù)合物，基于此構(gòu)建的比色陣列傳感器用于蛋白質(zhì)識(shí)別(Anal.Chem.2013，85.6571-6574；Anal.Chem.2015，87.3354-3359)，成本高，操作復(fù)雜，不利于場(chǎng)地檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于比色陣列傳感器與手機(jī)聯(lián)用檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明基于比色陣列傳感器與手機(jī)聯(lián)用檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟：

S1、納米金顆粒的制備：通過(guò)檸檬酸鈉還原氯金酸制得，氯金酸和檸檬酸鈉的摩爾比為3.5-3.8:1，所得溶液中納米金顆粒的平均粒徑為13-18nm(優(yōu)選13nm)；

S2、蛋白質(zhì)-納米金復(fù)合物的制備：向上述含有納米金顆粒的溶液100μL中分別加入50μL 0.5μM的12種蛋白質(zhì)，孵育30min，得到不同的蛋白質(zhì)-納米金復(fù)合物；其中，所述12種蛋白質(zhì)包括Try、Hem、BSA、HSA、Pep、Lys、EA、HRP、TRF、Cyt-C、IgG和Con-A；

S3、鹽誘導(dǎo)的納米金顆粒聚沉體系的制備：向每種蛋白質(zhì)-納米金復(fù)合物中分別加入50μL不同濃度梯度的NaCl溶液，然后加入300μL超純水，孵育10min，形成不同鹽濃度誘導(dǎo)的納米金顆粒聚沉體系；其中，NaCl溶液的濃度范圍為0～100mM；優(yōu)選濃度梯度為0mM、5mM、10mM、15mM和20mM；

S4、蛋白質(zhì)圖譜的構(gòu)建：將步驟S3的聚沉體系作為傳感單元，利用光譜技術(shù)獲取不同的響應(yīng)光學(xué)信號(hào)，并基于吸光度值構(gòu)建不同蛋白質(zhì)的圖譜，并利用軟件SYSTAT 13繪制LDA圖；或者，

將步驟S3的聚沉體系作為傳感單元，利用成像技術(shù)獲取不同的響應(yīng)光學(xué)信號(hào)，并基于RGB值利用軟件IBM SPSS Statistics 16繪制不同蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的HCA圖，以及利用軟件Adobe Photoshop C6繪制相應(yīng)的色差圖；

S5、按照S1制備納米金顆粒，向含有納米金顆粒的溶液100μL中加入M1濃度的待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，再加入300μL超純水，孵育30min后，利用光譜技術(shù)獲取光學(xué)信號(hào)，代入S4所述軟件SYSTAT 13中，根據(jù)LDA圖顯示結(jié)果，對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別；或者，

向含有納米金顆粒的溶液100μL中加入M1濃度的待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，再加入300μL超純水，孵育30min后，利用成像技術(shù)獲取光學(xué)信號(hào)，代入S4所述軟件IBM SPSS Statistics 16和軟件Adobe Photoshop C6中，根據(jù)HCA圖與色差圖顯示結(jié)果，對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別。

前述方法的步驟S5中，0.5μM≤M1≤1μM。優(yōu)選M1為0.5μM。

前述方法的步驟S5中利用光譜技術(shù)或成像技術(shù)獲取光學(xué)信號(hào)的具體操作同步驟S4。

前述方法的步驟S4中利用光譜技術(shù)采集光學(xué)信號(hào)的具體操作如下：對(duì)步驟S3的聚沉體系進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)，得到A_620/520值，構(gòu)建不同蛋白質(zhì)的圖譜并繪制LDA圖。

前述方法的步驟S4中利用成像技術(shù)采集光學(xué)信號(hào)的具體操作如下：將步驟S3的聚沉體系各取200μL分別加至96孔板中，并在所述96孔板的下方鋪設(shè)大小相同的邊緣畫有半徑0.5cm的黑圓點(diǎn)的白紙一張，通過(guò)將不同拍攝條件下黑圓點(diǎn)的RGB值與空白樣品圖片黑圓點(diǎn)的RGB值相統(tǒng)一，以避免光線差異；將96孔板水平放置，用智能手機(jī)(手機(jī)品牌不限)在96孔板的垂直上方進(jìn)行拍攝，手機(jī)鏡頭與96孔板的垂直距離為12cm。

對(duì)手機(jī)成像得到的RGB值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理(每個(gè)樣品做6次重復(fù)，取平均值)，并基于RGB值利用軟件IBM SPSS Statistics 16繪制不同蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的HCA圖，以及利用軟件Adobe Photoshop C6繪制相應(yīng)的色差圖。

前述的方法，每次手機(jī)拍攝均固定拍攝距離。

本發(fā)明進(jìn)一步提供上述方法在尿樣蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用。按照S1制備納米金顆粒，向含有納米金顆粒的溶液200μL中分別加入100μL含M1’濃度待測(cè)蛋白質(zhì)的稀釋6倍、3倍、2倍、1.5倍的健康人尿液，再加入200μL超純水，孵育30min后，利用光譜技術(shù)或成像技術(shù)獲取光學(xué)信號(hào)，代入S4所述軟件中，根據(jù)圖示結(jié)果，對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別(蛋白質(zhì)種類不限)。其中，0.1μM≤M1’≤100μM，優(yōu)選M1’為1μM。

本發(fā)明基于比色陣列傳感器與手機(jī)聯(lián)用檢測(cè)蛋白質(zhì)的流程示意圖見圖1。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(一)本發(fā)明不需要使用昂貴的儀器，可通過(guò)與智能手機(jī)聯(lián)用實(shí)現(xiàn)對(duì)多種蛋白質(zhì)的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，成本低、信號(hào)響應(yīng)快、靈敏度高；

(二)使用智能手機(jī)處理傳感體系的響應(yīng)信號(hào)，有利于簡(jiǎn)化信號(hào)的處理和縮短分析時(shí)間；

(三)僅用肉眼可簡(jiǎn)單識(shí)別，有利于場(chǎng)地檢測(cè)；

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明基于比色陣列傳感器與手機(jī)聯(lián)用檢測(cè)蛋白質(zhì)的流程示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中不同鹽濃度與納米金的聚沉程度以及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中AuNPs的紫外可見吸收光譜，AuNPs與不同的蛋白質(zhì)接觸時(shí)鹽誘導(dǎo)的納米金顆粒的聚沉。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1在水樣中對(duì)終濃度50nM的多種蛋白的識(shí)別結(jié)果；其中，A表示12種蛋白的圖譜，B表示12種蛋白的LDA圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中利用陣列傳感器在實(shí)際樣品中對(duì)200nM多種蛋白的識(shí)別結(jié)果(LDA圖)。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中利用陣列傳感器在實(shí)際樣品中對(duì)應(yīng)于200nM多種蛋白的色差圖與手機(jī)拍攝圖。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例2中利用陣列傳感器在實(shí)際樣品中對(duì)應(yīng)于200nM多種蛋白的HCA圖。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例2中對(duì)混合與單一蛋白以及未知濃度HSA的色差圖與HCA。

圖4中，factor 1和factor 2分別表示典型判別式函數(shù)1和典型判別式函數(shù)2。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1與手機(jī)連用的比色陣列傳感器用于多種蛋白質(zhì)的檢測(cè)

采用檸檬酸鈉還原氯金酸方法制備納米金，納米金顆粒(AuNPs)，作為粒徑范圍在納米級(jí)別的納米材料，其合成非常簡(jiǎn)單，以檸檬酸鹽還原氯金酸合成的AuNPs經(jīng)典方法最為便捷。

本實(shí)施例提供的基于比色陣列傳感器與手機(jī)聯(lián)用檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟：

1、納米金顆粒的制備：通過(guò)檸檬酸鈉還原氯金酸制得，氯金酸和檸檬酸鈉的摩爾比為3.5:1，所得溶液中納米金顆粒的平均粒徑為13nm。

2、蛋白質(zhì)-納米金復(fù)合物的制備：向上述含有納米金顆粒的溶液100μL中分別加入50μL 0.5μM的12種蛋白質(zhì)，孵育30min，得到不同的蛋白質(zhì)-納米金復(fù)合物；其中，所述12種蛋白質(zhì)包括Try、Hem、BSA、HSA、Pep、Lys、EA、HRP、TRF、Cyt-C、IgG和Con-A。

3、鹽誘導(dǎo)的納米金顆粒聚沉體系的制備：向每種蛋白質(zhì)-納米金復(fù)合物中分別加入50μL的0mM、5mM、10mM、15mM和20mM的NaCl溶液，然后加入300μL超純水，孵育10min，形成不同鹽濃度誘導(dǎo)的納米金顆粒聚沉體系。

4、蛋白質(zhì)圖譜的構(gòu)建：將步驟S3的聚沉體系作為傳感單元，利用光譜技術(shù)獲取不同的響應(yīng)光學(xué)信號(hào)，并基于吸光度值構(gòu)建不同蛋白質(zhì)的圖譜，并利用軟件SYSTAT 13繪制LDA圖。

或者，將步驟S3的聚沉體系作為傳感單元，利用成像技術(shù)獲取不同的響應(yīng)光學(xué)信號(hào)，并基于RGB值利用軟件IBM SPSS Statistics 16繪制不同蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的HCA圖，以及利用軟件Adobe Photoshop C6繪制相應(yīng)的色差圖。

5、按照步驟1制備納米金顆粒，向含有納米金顆粒的溶液100μL中加入M1濃度的待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，再加入300μL超純水，孵育30min后，利用光譜技術(shù)獲取光學(xué)信號(hào)，代入S4所述軟件SYSTAT 13中，根據(jù)LDA圖顯示結(jié)果，對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別。

或者，向含有納米金顆粒的溶液100μL中加入M1濃度的待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，再加入300μL超純水，孵育30min后，利用成像技術(shù)獲取光學(xué)信號(hào)，代入S4所述軟件IBM SPSS Statistics 16和軟件Adobe Photoshop C6中，根據(jù)HCA圖與色差圖顯示結(jié)果，對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別。

光譜技術(shù)的具體方法如下：

首先優(yōu)化NaCl濃度，確定所選濃度為5mM，10mM，15mM，20mM(終濃度)，然后確定蛋白質(zhì)孵育時(shí)間(動(dòng)力學(xué))，確定孵育時(shí)間為30min(圖2)，繪制各蛋白在體系中的吸光度譜圖，以說(shuō)明不同蛋白在該體系中有不同響應(yīng)，從而證明該體系的可行性(圖3)。在超純水中，加入13nm的AuNPs(100μL)，加50μL0.5μM的蛋白，孵育30min，然后分別加入50μL的0mM，5mM，10mM，15mM，20mM的NaCl，加300μL超純水，孵育10min，紫外檢測(cè)，得到A_620/520值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建不同蛋白質(zhì)的圖譜并繪制LDA圖。結(jié)果顯示，可完全區(qū)分50nM(終濃度)的12種蛋白(圖4)。

成像技術(shù)的具體方法如下：

在超純水中，加入13nm的AuNPs(100μL)，加50μL0.5μM的蛋白，孵育30min，然后分別加入50μL的0mM，5mM，10mM，15mM，20mM的NaCl，加300μL超純水，孵育10min，取200μL分別加至96孔板中，并在所述96孔板的下方鋪設(shè)大小相同的邊緣畫有半徑0.5cm的黑圓點(diǎn)的白紙一張，通過(guò)將不同拍攝條件下黑圓點(diǎn)的RGB值與空白樣品圖片黑圓點(diǎn)的RGB值相統(tǒng)一，以避免光線差異，將96孔板水平放置，用智能手機(jī)在96孔板的垂直上方進(jìn)行拍攝，手機(jī)鏡頭與96孔板的垂直距離為12cm。

對(duì)手機(jī)成像得到的RGB值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每個(gè)樣品做6次重復(fù)，取平均值，并基于RGB值利用軟件IBM SPSS Statistics 16，以及利用軟件Adobe Photoshop C6繪制相應(yīng)的色差圖，從而對(duì)12種蛋白進(jìn)行區(qū)分。

實(shí)施例2蛋白質(zhì)檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用

為證明實(shí)施例1陣列傳感器的可行性，在稀釋1倍的健康人的尿液中，對(duì)200nM的12種蛋白進(jìn)行檢測(cè)，因人體尿液中含有約155mM的NaCl，因此將尿液分別稀釋6倍、3倍、2倍和1.5倍以實(shí)現(xiàn)傳感單元所需的NaCl濃度。向200μL的AuNPs中分別加入100μL含1μM待測(cè)蛋白質(zhì)的稀釋6倍、3倍、2倍、1.5倍的健康人尿液，再加入200μL超純水，孵育30min，紫外檢測(cè)，結(jié)果顯示，可完全區(qū)分(圖5)。利用陣列傳感器在實(shí)際樣品中對(duì)應(yīng)于200nM多種蛋白的色差圖與手機(jī)拍攝圖見圖6。

后續(xù)又分別進(jìn)行了HSA，Lys的定量以及其混合物的檢測(cè)。對(duì)復(fù)雜背景下的手機(jī)拍攝圖進(jìn)行PS吸取顏色處理，手機(jī)拍攝均固定拍攝距離(垂直距離為12cm)，通過(guò)背景黑圓點(diǎn)的取值，來(lái)去除光照差異，來(lái)保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。對(duì)RGB值進(jìn)行HCA處理，結(jié)果顯示可完全區(qū)分12種蛋白，實(shí)現(xiàn)HAS、Lys及其混合物的定量，說(shuō)明手機(jī)拍攝來(lái)檢測(cè)蛋白的可行性(圖7，圖8)。

本發(fā)明僅使用不同濃度的鹽與納米金作為傳感單元，大大降低了成本，具有操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)速度快、高靈敏等優(yōu)點(diǎn)，在不同濃度鹽和蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)下，納米金顆粒聚集程度不同，使用智能手機(jī)處理傳感體系的響應(yīng)信號(hào)，有利于簡(jiǎn)化信號(hào)的處理和縮短分析時(shí)間，將會(huì)大大推動(dòng)該比色陣列傳感器用于蛋白質(zhì)檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，將在資源匱乏和場(chǎng)地檢測(cè)等領(lǐng)域的具有廣闊的應(yīng)用前景。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。