本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其屬于骨科領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

(1)骨延遲愈合和不愈合是臨床骨科極具挑戰(zhàn)性的科學(xué)問題

長久以來，由于嚴(yán)重創(chuàng)傷、疾病、感染等因素而導(dǎo)致骨塊丟失過多的一系列并發(fā)癥嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，尤其是骨延遲愈合(Delayed bone healing)和骨不連(Bony non-union)。目前，如何使骨組織又好又快地愈合，提高患者生活質(zhì)量，已經(jīng)成為臨床骨科、口腔種植體醫(yī)師的研究熱點(diǎn)。在正常骨缺損愈合(Normal bone healing)過程中，主要包括三個(gè)階段：血腫(Hematoma)炎癥機(jī)化期(Reactive phase)，骨痂形成期(Reparative phase)，和骨板形成塑形期(Remodeling phase)(圖1)。

骨組織的正常愈合涉及許多因素，包括足量的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)、生長因子、充足的血供、受損部位的機(jī)械力學(xué)穩(wěn)定性等。在臨床實(shí)踐過程中，許多促進(jìn)骨快速愈合的治療方案已經(jīng)被嘗試，如骨替代物植入術(shù)、干細(xì)胞移植術(shù)等。然而，這些方法在運(yùn)用的同時(shí)，也不可避免地帶來一系列的問題，如新骨形成的誘導(dǎo)率不高、術(shù)中術(shù)后感染、材料本身的快速降解和機(jī)械強(qiáng)度不足、材料表面缺乏生物相容性。為了減少上述副作用，Platelet-rich plasma(PRP)技術(shù)曾一度被嘗試性運(yùn)用于臨床上幫助骨早期愈合。PRP技術(shù)是將患者自體血液(10mL)加入到10％檸檬酸鈉溶液中，在室溫下放入離心機(jī)中離心(160G，20分鐘)，血液將分為血清層和血細(xì)胞層，移取兩者分界線下6mm以上的溶液至新的無抗凝劑試管中，再次離心(400G，15分鐘)，得到上層的血清層和下層的PRP層。臨床使用前，需用凝血酶(Thrombin，T)和氯化鈣溶液將其激活后局部使用。理論上講，在骨折部位局部運(yùn)用患者自體的PRP，在凝血酶和氯化鈣刺激后，快速形成一個(gè)富集生長因子的纖維血凝塊，一方面填充骨缺損部位達(dá)到快速止血的作用，另一方面它能釋放內(nèi)部的大量生長因子，從而促進(jìn)骨折的早期愈合。盡管如此，一些學(xué)者通過構(gòu)建大鼠和羊等骨缺損模型后植入PRP，并未發(fā)現(xiàn)PRP有任何明顯促進(jìn)骨愈合的作用。

近年來，新興的Platelet-rich fibrin(PRF)技術(shù)得到臨床骨科醫(yī)師廣泛的認(rèn)可。PRF技術(shù)是在PRP技術(shù)基礎(chǔ)的一種改良。在制作過程中，患者的血液被快速和直接地加入試管中，隨后立即離心機(jī)(3000rpm，10分鐘，20℃)，血液將會分為三層：最上層Platelet poor plasma(PPP)，中間層PRF層，最下層紅細(xì)胞層。由于在整個(gè)制作過程中未涉及到任何抗凝劑和凝血酶等生物制劑的參與，相比PRP而言，PRF自然而緩慢地形成的纖維結(jié)構(gòu)被表明能更好地吸附激活血小板釋放的生長因子，從而緩慢釋放它們，提高成骨率。通過對比與成骨活動(dòng)密切相關(guān)的生長因子Transforming growth factor-β(TGF-β)和Platelet-derived growth factor(PDGF)發(fā)現(xiàn)，盡管PRP中含量明顯高于PRF，但兩者植入骨缺損部位后，PRF的成骨效果卻較PRP更為顯著。所以，有研究者認(rèn)為PRF中的纖維結(jié)構(gòu)可能為等邊連接(Equilateral junction)，為生長因子的緩慢釋放或細(xì)胞的遷移、粘附和增殖創(chuàng)造更有利的環(huán)境，而PRP中的纖維結(jié)構(gòu)可能為等腰連接(Bilateral junction)，導(dǎo)致過快地釋放生長因子或阻止細(xì)胞的遷移，因而并未達(dá)到顯著成骨作用。

血纖維結(jié)構(gòu)的不同，提供給細(xì)胞活動(dòng)的環(huán)境不同，對生長因子的粘附能力也有著不同，最終竟能導(dǎo)致截然不同的成骨效應(yīng)。在導(dǎo)致骨延遲愈合或不愈合的眾多因素中，骨缺損面積大小(Gap size)一直被公認(rèn)為是最為重要的因素之一。由于創(chuàng)傷過大，骨塊丟失面積達(dá)到或超過臨界點(diǎn)(Critical size defect，CSD)時(shí)，必將引發(fā)骨不連的出現(xiàn)。因此，值得我們考慮的是，那么創(chuàng)傷較小的正常骨愈合和創(chuàng)傷較大的骨延遲愈合，兩種不同骨缺損中所形成的血凝塊的結(jié)構(gòu)性質(zhì)似乎也存在一些差異呢？簡言之，骨折血凝塊可能也有“好”或“壞”之分。

迄今為止，血凝塊變“好”或“壞”的最根本原因仍不清楚。血凝塊的性質(zhì)似乎與發(fā)生部位有一定的聯(lián)系。顯而易見地是，頭皮血腫和皮下血腫通常不會分化成為骨組織，而骨折血凝塊則可以機(jī)化、礦化為新鮮的骨組織。一般情況下，骨折部位形成的血凝塊能演變?yōu)檎９墙M織而沒有任何并發(fā)癥，但某些時(shí)候由于缺損過大、感染、血供不足等情況，骨折延遲愈合或骨不連仍會發(fā)生。所以，對于正常骨愈合和骨延遲愈合中血凝塊結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)性研究，仍然是一個(gè)巨大的疑問。早在1990年，Mizuno就將一個(gè)4天的血凝塊從大鼠股骨骨折部位，移植入肌肉內(nèi)，最終發(fā)現(xiàn)肌肉內(nèi)新骨形成。而把一個(gè)2天的血凝塊采用相同的手術(shù)方式進(jìn)行對照，則并未觀察到新骨形成。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明了血凝塊內(nèi)部結(jié)構(gòu)的成熟程度能顯著影響骨愈合的能力。

一個(gè)“好”血凝塊應(yīng)該具備以下的特征：①.除了有效止血以外，它能作為一個(gè)臨時(shí)的纖維基質(zhì)材料，進(jìn)而促進(jìn)MSC、成骨細(xì)胞的遷移、粘附、增殖和分化，因?yàn)榧?xì)胞的遷移和粘附活動(dòng)很大程度上依賴于基質(zhì)的參與。②.一個(gè)“好”血凝塊還應(yīng)具有一定的多孔性，才能更好地促進(jìn)氧氣和其他營養(yǎng)物質(zhì)的交換，同時(shí)也有利于代謝產(chǎn)物的排出。③.一個(gè)“好”血凝塊，由于高滲透性和低密度纖維束，使它更容易被降解，從而為新生肉芽組織的長入提供更多的空間。④.一個(gè)“好”血凝塊還應(yīng)擁有一個(gè)較大的表面積，用以吸附游離的生長因子，并緩慢釋放它們，從而更有效地提高成骨細(xì)胞分化率。

(2)血凝塊的形成過程和結(jié)構(gòu)特征

經(jīng)典的凝血反應(yīng)包括內(nèi)源性和外源性兩條通路。內(nèi)源性凝血起始于前激肽釋放酶、高分子量肽原(High Molecular Weight Kininogen，HMWK)和凝血因子XII等物質(zhì)接觸到異物表面。凝血因子XII一旦被激活，首先激活HMWK，HMWK正反饋進(jìn)一步激活更多的XII因子，從而放大凝血效應(yīng)。XIIa繼續(xù)激活下游的XI因子，而XIa進(jìn)一步在鈣離子的協(xié)助下激活I(lǐng)X因子，激活的IXa和VIIIa因子，在鈣離子和磷脂(Phospholipid，PL)存在的條件下，激活X因子轉(zhuǎn)變?yōu)閄a，最后進(jìn)入共同通路。

對于骨折血凝塊(實(shí)質(zhì)上是纖維血凝塊)而言，是通過外源性凝血通路來達(dá)到止血效果的(圖2)。外源性凝血通路始于組織因子(Tissue Factor,TF)的釋放，它能進(jìn)一步激活凝血因子VII，從而形成TF-VIIa復(fù)合物。該復(fù)合物繼續(xù)激活下游的凝血因子X生成Xa，Xa激活凝血因子V并與其形成FXa-Va復(fù)合物，進(jìn)而在鈣離子和磷脂協(xié)助下，使促凝血酶原(Prothrombin)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘哪?。?nèi)源性和外源性的共同通路是從凝血因子X轉(zhuǎn)化為激活的Xa開始。凝血酶的生成具有兩個(gè)主要作用是：一方面可以轉(zhuǎn)化纖維蛋白原(Fibrinogen,Fg)成為纖維素纖維(Fibrin fiber)，另一方面它還可以激活凝血因子XIII。激活后的XIIIa在纖維素纖維形成網(wǎng)狀纖維血凝塊的過程中，起著至關(guān)重要的作用。

在心臟內(nèi)科和血液內(nèi)科的前期基礎(chǔ)研究中，血栓凝塊主要包括以下結(jié)構(gòu)特征：纖維的直徑、密度、分支點(diǎn)的數(shù)量、分支點(diǎn)之間的距離、孔徑率(Porosity)和孔徑大小(Pore size)等。一般來說，纖維直徑的粗細(xì)與纖維的密度是成反比關(guān)系，但和孔徑的大小成正比關(guān)系。纖維直徑的粗細(xì)和孔徑大小對MSC的生理功能的調(diào)節(jié)起著非常重要的作用。盡管單根粗纖維(Coarse fiber)和單根細(xì)纖維(Thin fiber)相比，有較高的機(jī)械強(qiáng)度，然而由粗纖維構(gòu)成為主的纖維凝塊卻通常表現(xiàn)出較低的硬度，可能的原因是由于粗纖維形成的數(shù)量較少。從血栓凝塊降解角度來看，纖維的密度是較為主要的決定性因素，而非直徑大小。決定纖維直徑和密度兩個(gè)極為重要的因素就是纖維蛋白原和凝血酶的濃度。低濃度的纖維蛋白原和(或)凝血酶能形成一個(gè)較渾濁、粗的、疏松的血栓凝塊；相反，高濃度的纖維蛋白原和(或)凝血酶則形成一個(gè)不渾濁、細(xì)的、致密的血栓凝塊。這兩種不同類型的血栓凝塊，表現(xiàn)出不同的纖維降解速率，前者往往降解較快，從而增大了過早溶解、出血等可能；后者往往降解較慢，卻增加了血栓長期存在的風(fēng)險(xiǎn)。除了這兩個(gè)因素對血栓凝塊結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)起著重要作用外，局部的PH值、離子強(qiáng)度、鈣離子濃度等諸多變量也能影響其結(jié)構(gòu)變化。

(3)纖維素纖維形成的機(jī)制

纖維蛋白原是一個(gè)分子量約為340kDa的糖蛋白，長約45μm，由2組3條多肽鏈(AαBβγ)2組成，多肽鏈之間以二硫鍵相互連接而成。纖維蛋白原按區(qū)域來劃分，包括一個(gè)中央?yún)^(qū)(E domain)，二個(gè)外圍區(qū)(D domain)由Bβ鏈和γ鏈的羧基端組成，Aα鏈的羧基端(αC region)折回參與E區(qū)結(jié)構(gòu)，以及連接E區(qū)與D區(qū)之間的帶狀結(jié)構(gòu)(Coiled-coil區(qū))。

在轉(zhuǎn)變成纖維素纖維的聚合反應(yīng)中(圖3)，凝血酶首先會裂解2條Aα鏈氨基端Arg16-Gly17釋出一對纖維蛋白肽A(Fibrinopeptide A,FpA)從而暴露出Gly-Pro-Arg-Pro(GPRP)區(qū)域(也稱為knob A)，從從而形成纖維蛋白單體Ⅰ(αBβγ)2(FMI)，與knob A相對應(yīng)的結(jié)構(gòu)是位于γ鏈羧基端的hole‘a(chǎn)’或pocket‘a(chǎn)’結(jié)構(gòu)。20-25個(gè)FMI間通過A：a間氫鍵結(jié)合(A：a interaction)，先形成低聚體(Oligomer)，最后聚合成以22.5nm為周期橫紋的不穩(wěn)定的雙鏈原纖維(protofibrils)。此外，凝血酶繼續(xù)裂解原纖維上的2條Bβ鏈氨基端Arg14-Gly15釋出一對纖維蛋白肽B(FPB)，暴露出Gly-His-Arg-Pro(GHRP)區(qū)域(也稱為knob B),形成纖維蛋白單體Ⅱ(αβγ)2，與之相對應(yīng)的則是位于β鏈羧基端的hole‘b’或pocket‘b’結(jié)構(gòu)。它們之間形成的B：b結(jié)合(B：b interaction)主要作用至今未知，但可以明確的是，B：b結(jié)合能促進(jìn)側(cè)向聚集作用(Lateral aggregation)。最終，上述的(αβγ)2在凝血因子XIIIa的作用下，形成一個(gè)成熟的網(wǎng)狀纖維凝塊，從而達(dá)到止血目的。

B：b結(jié)合加強(qiáng)側(cè)向聚集作用的可能原因是：首先，由于knob B本身較長且靈活，以致于它和pocket‘b’之間的綁定并不會顯著影響到原纖維結(jié)構(gòu)的重新排列。其次，B：b結(jié)合后可能會誘導(dǎo)β鏈羧基端向外更加突出，從而使得與相鄰分子的β鏈羧基端接觸更為緊密。再次，F(xiàn)pB的釋放使原本依附于FpB的αC domain變成游離狀態(tài)(untethered state)，而相鄰分子間游離狀的αC domain通過多種聚合方式形成αC多聚體(αC polymer)，從而使纖維變粗。最后，B：b結(jié)合可能從動(dòng)力學(xué)上更加穩(wěn)定了原纖維的結(jié)構(gòu)，繼而加強(qiáng)了側(cè)向聚集作用。不管以何種機(jī)制，可以肯定的是B：b結(jié)合鍵是真實(shí)存在并且在纖維聚合反應(yīng)中起著重大作用。因此，如果僅僅釋放FpA而不釋放FpB，形成的纖維凝塊主要由致密的細(xì)纖維構(gòu)成。

側(cè)向聚集作用決定纖維的粗細(xì)程度，多種結(jié)構(gòu)位點(diǎn)參與了側(cè)向聚集作用的發(fā)生機(jī)制。已知的研究結(jié)果表明，knob B和pocket‘b’、γ鏈羧基端(γ350-360和γ370-380)和相鄰β鏈羧基端、Aα鏈羧基端的αC region、Coiled-coil區(qū)、和Bβ364Asn andγ52Asn上的N-葡糖胺多糖等都和側(cè)向聚集作用有密切關(guān)系。Lord在體外研究指出，運(yùn)用截?cái)嗟腁α251纖維蛋白原(缺乏αC region部分)，形成的纖維直徑較正常對照組下降25％。在αC region內(nèi)部結(jié)構(gòu)中，含有一條相對靈活的區(qū)域—αC連接體(αC connector)和一個(gè)獨(dú)立折疊的致密區(qū)域—αC區(qū)域(αCdomain)，αC連接體位于Aα221-391基因序列，而αC區(qū)域則位于Aα392-610序列(圖4)。更重要的是，αC區(qū)域還可以細(xì)分為兩個(gè)亞區(qū)域(subdomain)：即N端亞區(qū)域(Aα392-503)和C端亞區(qū)域(Aα504-610)。相鄰原纖維分子間發(fā)生側(cè)向聚集作用時(shí)，N端亞區(qū)域間通常以自交聯(lián)(Self-association)中的β發(fā)夾交換方式(β-hairpin swapping)相互聚合，而C端亞區(qū)域上存在一些受體位點(diǎn)，如Lys-418、-448、-508等，這些位點(diǎn)能與αC連接體上的供體，如Gln-221、-237、-328等，借助于激活的凝血因子XIII形成∈-amino(γ-Glutamyl)Lysine共軛鍵發(fā)生交聯(lián)(Crosslinking)。這種原纖維間的共軛交聯(lián)方式使整個(gè)纖維聚合過程不可逆轉(zhuǎn)，并形成穩(wěn)定的αC多聚體，最終增強(qiáng)纖維凝塊的機(jī)械強(qiáng)度和抵抗溶解的能力。除此之外，由凝血因子XIII介導(dǎo)的∈-amino(γ-Glutamyl)Lysine共軛鍵還出現(xiàn)在相鄰γ鏈上的γ406Lys和γ398/399Gln之間，這種聚合方式叫γ-γ交聯(lián)。αC-αC交聯(lián)(即αC多聚體形成)和γ-γ交聯(lián)兩者都和纖維凝塊的硬度有緊密聯(lián)系。因此，從一定程度上來說，αC多聚體的形成量能決定纖維凝塊中纖維直徑的粗細(xì)。也就是說，凡有利于發(fā)生側(cè)向聚集作用的因素，如αC多聚體形成越多，則形成一個(gè)粗纖維為主和少分支點(diǎn)的纖維凝塊；而不利于發(fā)生側(cè)向聚集作用的因素，則形成一個(gè)細(xì)纖維為主和多分支點(diǎn)的纖維凝塊。最近一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)表明，αC多聚體的形成能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞上整合素的聚集，從而增加它們的粘附、擴(kuò)散力，并激活整合素介導(dǎo)的Focal adhesion kinase(FAK)和Extracellular signal regulated kinase(ERK1/2)兩條通路，最終促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，促進(jìn)愈合。

亞硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione，GSNO)作為一種S-亞硝化谷胱甘肽衍生物，通過抑制血小板的激活發(fā)揮抗凝作用從而可預(yù)防血栓形成。除了對血小板的抑制作用，GSNO也被報(bào)道能夠通過增加αC多聚體生成，從而形成以粗纖維為主的易于溶解的纖維凝塊。在大鼠牙周炎的模型中，局部齒齦內(nèi)給藥注射GSNO可以明顯減少過度炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的骨破壞。臨床中，GSNO也被廣泛地用于預(yù)防心肌梗塞和心臟瓣膜術(shù)后的再度狹窄。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種調(diào)節(jié)血凝塊纖維的結(jié)構(gòu)在制備用于促進(jìn)骨愈合的藥物中的用途，所述藥物用于調(diào)節(jié)血凝塊纖維的結(jié)構(gòu)，所述調(diào)節(jié)血凝塊纖維的結(jié)構(gòu)包括調(diào)節(jié)血凝塊的纖維直徑、纖維密度、孔徑率和孔徑大小來促進(jìn)骨愈合。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)提供纖維致密型的血凝塊；

(2)將待測物質(zhì)與步驟(1)的血凝塊混合，調(diào)節(jié)血凝塊的結(jié)構(gòu)；

(3)如果步驟(2)中的血凝塊的結(jié)構(gòu)由纖維致密型變?yōu)槔w維稀疏型，那么步驟(2)中的待測物質(zhì)為促進(jìn)骨愈合的藥物。

作為本發(fā)明所述的一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述纖維致密型的血凝塊纖維密度高、纖維直徑細(xì)；所述纖維稀疏型的血凝塊纖維密度低、纖維直徑粗。

作為本發(fā)明所述的一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述纖維致密型的血凝塊纖維密度為26.92～34.68根/40μm²，纖維直徑為180-220nm；所述纖維稀疏型的血凝塊纖維密度為6.55～10.75根/40μm²，纖維直徑大于或等于400nm。

作為本發(fā)明所述的一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中調(diào)節(jié)血凝塊纖維的結(jié)構(gòu)包括調(diào)節(jié)血凝塊的纖維直徑、纖維密度。

作為本發(fā)明所述的一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述藥物為亞硝基谷胱甘肽。

作為本發(fā)明所述的一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述亞硝基谷胱甘肽的濃度從0mM到10mM時(shí)，隨著亞硝基谷胱甘肽濃度的增加，血凝塊的纖維直徑逐漸增大；所述亞硝基谷胱甘肽的濃度超過10mM時(shí)，隨著亞硝基谷胱甘肽濃度的增加，血凝塊的纖維直徑逐漸變小。

作為本發(fā)明所述的一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述亞硝基谷胱甘肽的濃度從0mM到0.1mM時(shí)，隨著亞硝基谷胱甘肽濃度的增加，血凝塊的纖維密度基本不變；所述亞硝基谷胱甘肽的濃度從1mM增加到10mM時(shí)，隨著亞硝基谷胱甘肽濃度的增加，血凝塊的纖維密度逐漸下降。

作為本發(fā)明所述的一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述亞硝基谷胱甘肽的濃度從0mM到1mM時(shí)，隨著亞硝基谷胱甘肽濃度的增加，礦化骨組織新生量和總量逐漸增加；所述亞硝基谷胱甘肽的濃度從1mM增加到10mM時(shí)，隨著亞硝基谷胱甘肽濃度的增加，礦化骨組織新生量和總量逐漸減少；所述亞硝基谷胱甘肽的濃度為10mM時(shí)，添加亞硝基谷胱甘肽組與空白對照組的礦化骨組織新生量和總量差別不顯著。

作為本發(fā)明所述的一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，在早期血凝塊階段，在正常骨缺損愈合模型中，在血凝塊的邊緣部分可見孔狀結(jié)構(gòu)，而在骨延遲愈合模型中可見致密的纖維結(jié)構(gòu)。

作為本發(fā)明所述的一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，當(dāng)在正常骨缺損愈合模型中，在血凝塊的邊緣部分可見肉芽組織時(shí)，而在骨延遲愈合模型中血凝塊邊緣無明顯變化。

作為本發(fā)明所述的一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，當(dāng)在正常骨缺損愈合模型中，大部分血凝塊已經(jīng)消退時(shí)，而在骨延遲愈合模型中血凝塊的主體部分仍然存在。

作為本發(fā)明所述的一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，當(dāng)在正常骨缺損愈合模型的早期血凝階段和新生肉芽組織形成階段時(shí)，正常骨缺損愈合模型中的血凝塊纖維直徑均明顯大于骨延遲愈合模型中的血凝塊纖維直徑。

作為本發(fā)明所述的一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，當(dāng)在正常骨缺損愈合模型的早期血凝階段和新生肉芽組織形成階段時(shí)，正常骨缺損愈合模型中的血凝塊纖維密度均明顯小于骨延遲愈合模型中的血凝塊纖維密度。

另外，本發(fā)明公開一種骨缺損中纖維致密型血凝塊作為調(diào)節(jié)位點(diǎn)在篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物中的用途。

本發(fā)明所述調(diào)節(jié)血凝塊纖維的結(jié)構(gòu)在制備用于促進(jìn)骨愈合的藥物中的用途對于骨科、口腔種植、頜面修復(fù)等領(lǐng)域具有重要意義。血凝塊無疑是最理想的‘植入材料’，我們運(yùn)用常見的骨缺損大鼠模型，對骨缺損中血凝塊分類這一概念進(jìn)行了有益的提出，并通過調(diào)節(jié)血凝塊內(nèi)部結(jié)構(gòu)性質(zhì)，從而促進(jìn)骨缺損部位的骨再生，并且我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在正常骨缺損模型中的血凝塊邊緣存在一些“小孔”，而骨延遲愈合模型中血凝塊卻沒有發(fā)現(xiàn)類似結(jié)構(gòu)?？傊龎K內(nèi)部纖維結(jié)構(gòu)的變化必將影響局部細(xì)胞的移入、粘附、增殖、分化和生長因子的粘附、釋放等一系列生理性活動(dòng)，導(dǎo)致微環(huán)境的改變，從而影響骨的愈合進(jìn)程。

附圖說明

圖1為骨折愈合的生理過程，引用自http://www.mc3cb.com；

圖2為骨折血凝塊形成的外源性凝血通路圖；

圖3為凝血酶作用下的纖維素纖維形成示意圖；

圖4為αC region結(jié)構(gòu)及αC多聚體形成示意圖；

圖5為實(shí)施例1中正常骨缺損愈合模型和骨延遲愈合模型的骨缺損圖，即1mm和3mm骨缺損模型圖；

圖6中的A-E為實(shí)施例1中通過Micro-CT初步評估礦化骨組織新生量(BV)和總量(TV)的對比圖，Cartilage代表軟骨組織，Natural代表正常骨缺損愈合模型，Delayed代表骨延遲愈合模型，*代表新生礦化骨組織，A為第7天1mm骨缺損，B為第7天3mm骨缺損，C為第28天1mm骨缺損，D為第28天3mm骨缺損，E為第7和28天的BV/TV統(tǒng)計(jì)圖，F(xiàn)-I為組織學(xué)Safranin O染色圖，其中，F(xiàn)、G為第28天1mm的染色圖，H、I為第28天3mm的染色圖；

圖7為實(shí)施例3中正常骨缺損愈合模型和骨延遲愈合模型的纖維表面形貌和粗糙度等的差異電鏡圖(A-R)，A、G、M為第1、4、7天1mm骨缺損中血凝塊的形態(tài)圖，D、J、P為第1、4、7天3mm骨缺損中血凝塊的形態(tài)圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例4中血凝塊纖維結(jié)構(gòu)的直徑和密度掃描電鏡圖，Natural和Natural healing均代表正常骨缺損愈合模型，Delayed和Delayed healing均代表骨延遲愈合模型，S、T為第1、4天1mm骨缺損中血凝塊邊緣的形態(tài)圖，U、V為第1、4天3mm骨缺損中血凝塊邊緣的形態(tài)圖；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例5中調(diào)查不同濃度的GSNO調(diào)節(jié)血凝塊結(jié)構(gòu)后對成骨的影響的SEM圖，A為0、0.1、1、10mM GSNO作用下，第1天血凝塊的掃描電鏡圖，B為手術(shù)過程中，加GSNO到3mm骨缺損部位，并和血液進(jìn)行均勻地混合，C為不同濃度的GSNO作用下，纖維直徑的統(tǒng)計(jì)圖，D為不同濃度的GSNO作用下，纖維密度的統(tǒng)計(jì)圖；

圖10為本發(fā)明實(shí)施例5中調(diào)查不同濃度的GSNO調(diào)節(jié)血凝塊結(jié)構(gòu)后對骨缺損中新生骨量的影響的X-ray和Micro-CT圖，A為第7、28天時(shí)，不同濃度的GSNO影響下骨缺損的X光片圖，B為第7、28天時(shí)，不同濃度的GSNO影響下骨缺損的Micro-CT圖和纖維直徑、密度統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

為更好地說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1正常骨缺損愈合(Normal bone healing，NBH)和骨延遲愈合(Delayed bone healing,DBH)模型建立

實(shí)驗(yàn)方法：雄性Inbred fisher 344大鼠(6-8周)均分為正常骨缺損愈合組(直徑1mm，深度2mm)和骨延遲愈合組(直徑3mm，深度2mm)。Inbred fisher344大鼠是目前較為流行的一種鼠類，這種鼠類比較活躍相比其他種類，同時(shí)，該種屬的骨骼比較寬大，適合骨科手術(shù)。最重要的是，Inbred fisher 344大鼠屬于近親繁殖，所以一只老鼠的細(xì)胞、組織等可以移植入另一只老鼠體內(nèi)，因?yàn)樗鼈兊难壕哂型葱?。麻醉狀態(tài)下，我們使用兩種不同規(guī)格的圓柱狀鉆頭(Australian Jewelers Supplies Pty Ltd.,Australia)在大鼠的雙側(cè)股骨內(nèi)側(cè)髁上，分別鉆入直徑1mm+深度2mm和直徑3mm+深度2mm的骨缺損(圖5)。術(shù)后第7和28天，二氧化碳吸入法處死大鼠，取雙側(cè)股骨標(biāo)本，行Micro-CT和Safranin O染色等方法來鑒定模型是否成功建立。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，1mm的大鼠骨缺損鉆孔模型在14天內(nèi)，骨缺損愈合率高達(dá)92％，充分表明了1mm的骨缺損通過直接愈合的方式(膜內(nèi)成骨)。同時(shí)，Marsell和Oryan也指出骨缺損范圍在800μm to 1mm，可直接通過膜內(nèi)成骨。然而，在大鼠股骨內(nèi)側(cè)髁鉆孔模型中，直徑3mm×深度2mm的骨缺損直到第90天時(shí)，愈合率僅為76.5±3.0％(仍未完全愈合)，表明了該骨缺損通過間接愈合方式(軟骨內(nèi)成骨)。根據(jù)骨愈合的標(biāo)準(zhǔn)，大鼠的骨正常愈合周期約為4-6周(28-42天)，任何骨缺損超過42天或更長時(shí)間的愈合，均可視為骨延遲愈合。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖6中的A-E所示，通過Micro-CT初步評估礦化骨組織新生量(BV)和總量(TV)比值，可以發(fā)現(xiàn)在正常骨缺損愈合模型(1mm)中成骨速率遠(yuǎn)比骨延遲愈合模型(3mm)的高，且具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第7天，1mm骨缺損中BV/TV比值為6.13％±0.86％(圖6A)，而3mm骨缺損中BV/TV比值為1.80％±0.61％(圖6B)。第28天，1mm骨缺損中比值上升至66.01％±13.57％(圖6C)，3mm骨缺損中比值上升達(dá)到35.65％±0.85％(圖6D)。

如圖6中的F、H所示，通過組織學(xué)Safranin O染色，軟骨組織(Cartilage)被染成典型的紅色。從1mm骨缺損來看，清晰地展示了在第28天中出現(xiàn)大量的新生礦化骨組織(*)(6G)。而從3mm骨缺損來看，由于血腫降解緩慢，停留在缺損部位時(shí)間過長，最后出現(xiàn)以纖維軟骨組織(Cartilage)主的典型骨延遲愈合表現(xiàn)(6I)。因此，可以鑒定模型的成功建立。

實(shí)施例2關(guān)于術(shù)后時(shí)間點(diǎn)的選擇

正常骨愈合的大致時(shí)間順序是：術(shù)后第1天，代表早期的血凝塊階段；術(shù)后第4天，新生肉芽組織形成；術(shù)后第7天，血凝塊大部分消失，軟組織和早期的礦化組織出現(xiàn)；術(shù)后第28天，新骨形成和塑形階段。

實(shí)施例3調(diào)查血凝塊在正常骨缺損愈合模型和骨延遲愈合模型中的結(jié)構(gòu)性差異

實(shí)驗(yàn)方法：

A.原始血凝塊形態(tài)觀察：術(shù)后第1、4、7天，NBH組和DBH組大鼠股骨分離后，使用磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer solution，PBS)(PH＝7.4)沖洗至少3次，用3％戊二醛溶液過夜固定。標(biāo)本被置于環(huán)境掃描電鏡SEM TM3000(Hitachi High-Technologies Corporation,Japan)中觀察血凝塊的自然形態(tài)。分別取血凝塊的邊緣和中心兩個(gè)區(qū)域，進(jìn)行比較。放大率為50和1000倍，電壓范圍為15KV。

B.血凝塊中纖維結(jié)構(gòu)的觀察：術(shù)后第1和4天，NBH組和DBH組的血凝塊隨著周圍骨和軟組織一起被移至二甲砷酸鹽緩沖液(0.1M)溶液中，后經(jīng)4％餓酸后固定，不同梯度酒精脫水，固定和噴金。標(biāo)本在掃描電鏡SEM Quanta 200(FEI,USA)下，放大率為5000倍，觀察纖維的直徑和密度等結(jié)構(gòu)。通過組織學(xué)染色(HE染色)觀察血凝塊在NBH組和DBH組的形態(tài)學(xué)差異；通過原子力學(xué)顯微鏡(Atomic Force Microscopy，AFM)，觀察纖維表面形貌和粗糙度等差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖7中的A、D所示，通過環(huán)境掃描電鏡觀察到，第1天時(shí)，在1mm骨缺損中血凝塊的邊緣部分(圖7C)發(fā)現(xiàn)有一些小孔狀結(jié)構(gòu)(白色圓形框)，而在3mm骨缺損中相同位置(圖7F)卻發(fā)現(xiàn)的是致密的纖維結(jié)構(gòu)。而兩者血凝塊的中央部分(圖7B、E)，從視覺上來看，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的區(qū)別。第4天時(shí)，在1mm骨缺損的血凝塊(圖7G)邊緣出現(xiàn)一些肉芽組織(圖7I)，而3mm骨缺損的凝塊(圖7J)邊緣仍無明顯變化(圖7L)。而兩者血凝塊的中央部分(圖7H、K)，未發(fā)現(xiàn)有明顯的結(jié)構(gòu)變化。第7天時(shí)，在1mm骨缺損中大部分的血凝塊已經(jīng)消退(圖7M、N、O)，但在3mm骨缺損中血凝塊的主體部分仍然存在(圖7P、R、Q)，相比第4天而言，在血凝塊的表面上的血細(xì)胞似乎明顯減少。

實(shí)施例4量化纖維的結(jié)構(gòu)特征

實(shí)驗(yàn)方法：由實(shí)施例3進(jìn)一步通過高分辨率的掃描電鏡觀察第1和4天標(biāo)本邊緣部分，借助于Image J軟件從而量化纖維的結(jié)構(gòu)特征。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由圖8中的S-V看出，一方面，第1天時(shí)(圖8S、U)，在1mm骨缺損中的血凝塊纖維直徑范圍約是397.58±125.34nm，而3mm骨缺損中的纖維直徑為245.76±41.26nm，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；第4天時(shí)(圖8T、V)，兩者的值分別為295.72±49.86nm(1mm骨缺損)和226.16±57.0(3mm骨缺損)，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。

另一方面，由圖8中的S-V看出，第1天時(shí)(圖8S、U)，在1mm骨缺損中纖維密度約為8.65±2.1根/40μm²，相比而言，在3mm的骨缺損中纖維密度則為30.8±3.88根/40μm²(P<0.001)。第4天時(shí)(圖8T、V)，1mm骨缺損中纖維密度為8.4±1.98根/40μm²，而3mm骨缺損中纖維密度為25.8±3.92根/40μm²(P<0.001)。

實(shí)施例5調(diào)查不同濃度的GSNO調(diào)節(jié)血凝塊結(jié)構(gòu)后對成骨的影響

實(shí)驗(yàn)方法：

A.麻醉狀態(tài)下，構(gòu)建上述的骨延遲愈合骨缺損模型，隨后，不同濃度的GSNO(0,0.1,1或10mM)立即與骨缺損中血液進(jìn)行適當(dāng)?shù)鼗旌?。過夜后，處死大鼠，使用上述高分辨率的SEM進(jìn)行血凝塊結(jié)構(gòu)的觀察。

B.進(jìn)行相同的手術(shù)方式后，加入不同濃度的GSNO，術(shù)后第7和28天，處死大鼠，進(jìn)行X光片和Micro-CT檢測，評估骨缺損中新生骨量的情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖9中的A-D所示，SEM觀察后統(tǒng)計(jì)顯示，血凝塊中纖維平均直徑從245.8±41.7nm(空白對照組)上升至316.9±104nm(0.1mM GSNO組)，隨著GSNO濃度增加，直徑增加到最大值596.6±249.4nm(1mM GSNO組)(P<0.05)。隨后，繼續(xù)增加GSNO，直徑將下降到189.7±47.8nm(10mMGSNO)。另一方面，當(dāng)對比空白對照組和0.1mM GSNO組時(shí)，發(fā)現(xiàn)血凝塊中纖維密度卻沒有明顯改變(P>0.05)。而對比1mM GSNO組時(shí)，纖維密度則發(fā)生明顯下降(空白對照組為18.0±2.7根/40μm²，1mM GSNO為5.2±2.3根/40μm²)，繼續(xù)增加GSNO至10mM時(shí)，纖維的生成幾乎全部消失。

如圖10中的A所示，第7和28天時(shí)，通過X-ray可以發(fā)現(xiàn)0.1和1mM GSNO組中骨缺損部位有骨愈合跡象，而10mM GSNO組骨缺損部位，仍有較明顯的缺損存在。圖10中的B所示，通過Micro-CT再次評估BV和TV比值發(fā)現(xiàn)，第7天時(shí)，在0.1和1mM GSNO組中骨量增加有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其值分別為(15.41％±1.24％和18.35％±1.34％)(P<0.01)。第28天時(shí)，在0.1mM GSNO組中BV和TV比值達(dá)到55.17％±11.05％，相比空白對照組中36.65％±1.04％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。隨著GSNO濃度達(dá)到1mM時(shí)，其比值繼續(xù)增大至63.72％±14.13％。然而，對比10mM GSNO組和空白對照組，并未發(fā)現(xiàn)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié)論，我們首次揭示了血凝塊的質(zhì)地在正常骨愈合模型和骨延遲愈合模型中的顯著差異，通過亞硝基谷胱甘肽干預(yù)血凝塊的纖維結(jié)構(gòu)，使其變?yōu)槔w維疏松型血凝塊后能明顯地加快骨缺損愈合進(jìn)程，從而得出一種篩選用于促進(jìn)骨愈合的藥物的方法，其包括以下步驟：(1)提供纖維致密型的血凝塊；(2)將待測物質(zhì)與步驟(1)的血凝塊混合，調(diào)節(jié)血凝塊的結(jié)構(gòu)；(3)如果步驟(2)中的血凝塊的結(jié)構(gòu)由纖維致密型變?yōu)槔w維稀疏型，那么步驟(2)中的待測物質(zhì)為促進(jìn)骨愈合的藥物。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。