本發(fā)明屬于藥物分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體來說，涉及到一種鹽酸氨溴索注射劑有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。
背景技術(shù)：
：氨溴索(ambroxol)最早由德國學(xué)者于1976年首先研制并注冊(cè),1981年開始臨床應(yīng)用。氨溴索在我國臨床的應(yīng)用是從1991年開始的,臨床療效及安全性已得到臨床證實(shí)。氨溴索為溴己新的活性代謝產(chǎn)物,是一種新的粘痰溶解藥,能促進(jìn)支氣管纖毛排空運(yùn)動(dòng),有利于氣道分泌物排出。鹽酸氨溴索自上市以來，經(jīng)過多年臨床應(yīng)用表明，其療效顯著，毒副作用小。目前鹽酸氨溴索已是市場上作用最強(qiáng)和最有效安全的祛痰藥。國內(nèi)外已有包括片劑、膠囊、口服溶液及注射劑等多種劑型產(chǎn)品上市，是最常用的祛痰藥物之一。本品目前主要研究的雜質(zhì)為反式-4-[[[(e)-2-氨基3,5-二溴苯基]亞甲基]氨基]環(huán)已醇、順式-4-[(2-氨基3,5-二溴芐基)氨基]環(huán)已醇鹽酸鹽。檢驗(yàn)條件主要是選擇0.01mol/l磷酸氫二銨溶液(用磷酸調(diào)節(jié)ph值至7.0)-乙腈(50：50)作為流動(dòng)相等等度洗脫方法。此類方法雖然能檢測鹽酸氨溴索的有關(guān)物質(zhì)，但對(duì)鹽酸氨溴索產(chǎn)品在制備、研究、檢驗(yàn)過程中會(huì)產(chǎn)生工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)等復(fù)雜成分難以達(dá)到良好的分離。鹽酸氨溴索控制的雜質(zhì)主要有五個(gè)(雜質(zhì)a、b、c、d、e)，結(jié)構(gòu)式分別為：對(duì)于工藝中和降解中產(chǎn)生的有關(guān)物質(zhì)，在制劑中需要進(jìn)行質(zhì)量控制，因此，實(shí)現(xiàn)鹽酸氨溴索與其有關(guān)物質(zhì)的分離與分析，對(duì)于氨酸氨溴索注射劑的質(zhì)量控制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前對(duì)鹽酸氨溴索注射劑有關(guān)物質(zhì)的檢測方法中，大部分都只檢測一或兩個(gè)雜質(zhì)，用得都是等梯度洗脫，不能同時(shí)檢測多個(gè)雜質(zhì)，而且，換成常規(guī)的梯度洗脫時(shí)，容易引起基線飄移。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種鹽酸氨溴索注射劑有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，其可簡便，高效、全面的檢測鹽酸氨溴索注射劑中的雜質(zhì)，各雜質(zhì)之間的分離度均達(dá)到2.0以上，有效檢測控制鹽酸氨溴索注射劑在制備、研究、檢測及存放過程中產(chǎn)生的五種雜質(zhì)，可用于鹽酸氨溴索注射劑的質(zhì)量控制；并且該方法能控制基線比較平穩(wěn)。本發(fā)明所述的一種鹽酸氨溴索注射劑有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，所述檢測方法具體步驟如下：1)色譜柱：采用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，規(guī)格4.6*250mm，填料粒徑5um；2)流動(dòng)相a：磷酸鹽緩沖液，即取磷酸氫二銨2g溶于800ml水中，用磷酸調(diào)節(jié)ph值至4.0，再加水稀釋成1000ml；流動(dòng)相b：乙腈；3)檢測波長：248nm；柱溫：常溫；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：20ul；4)梯度洗脫條件：如表1表1洗脫梯度時(shí)間(min)磷酸鹽緩沖溶液(％)乙腈(％)06040155545255050405050506040本發(fā)明所述的一種鹽酸氨溴索注射劑有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，所述磷酸鹽緩沖液中含質(zhì)量濃度為0.02％的丁二酸。本發(fā)明所述的一種鹽酸氨溴索注射劑有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，所述檢測方法中對(duì)照品溶液配制步驟具體如下：稱取鹽酸氨溴索對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成15mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。本發(fā)明所述的一種鹽酸氨溴索注射劑有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，所述檢測方法中雜質(zhì)對(duì)照品溶液配制步驟具體如下：分別稱取鹽酸氨溴索雜質(zhì)a、b、c、d和e適量，各加甲醇溶解并稀釋制成1.5ug/ml的溶液，作為雜質(zhì)a、b、c、d和e對(duì)照品溶液。本發(fā)明所述的一種鹽酸氨溴索注射劑有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，所述檢測方法中供試品溶液配制步驟具體如下：量取鹽酸氨溴索注射液適量，加甲醇稀釋成0.75mg/ml的溶液，作為供試品溶液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述鹽酸氨溴索注射劑有關(guān)物質(zhì)的檢測方法可簡便，高效、全面的檢測鹽酸氨溴索注射劑中的雜質(zhì)，各雜質(zhì)之間的分離度均達(dá)到2.0以上，有效檢測控制鹽酸氨溴索注射劑在制備、研究、檢測及存放過程中產(chǎn)生的五種雜質(zhì)，可用于鹽酸氨溴索注射劑的質(zhì)量控制。附圖說明圖1為鹽酸氨溴索線性試驗(yàn)圖；圖2為鹽酸氨溴索中雜質(zhì)a線性試驗(yàn)圖；圖3為雜質(zhì)b線性試驗(yàn)圖；圖4為雜質(zhì)d線性試驗(yàn)圖；圖5為雜質(zhì)c線性試驗(yàn)圖；圖6為雜質(zhì)e線性試驗(yàn)圖；圖7為調(diào)整基線前的色譜圖；圖8為甲酸調(diào)整基線色譜圖；圖9為丁二酸調(diào)整基線色譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述鹽酸氨溴索注射劑有關(guān)物質(zhì)的檢測方法作進(jìn)一步說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。實(shí)施例1一、波長的選擇對(duì)鹽酸氨溴索及其各已知雜質(zhì)的紫外光譜圖進(jìn)行了測定，又通過對(duì)鹽酸氨溴索強(qiáng)制降解，以二極管檢測器對(duì)各雜質(zhì)峰在200-400nm范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果表明鹽酸氨溴索、各已知雜質(zhì)以及各主要降解的未知雜質(zhì)均在248nm波長處有較大吸收。二、專屬性試驗(yàn)(一)強(qiáng)制降解試驗(yàn)(1)熱破壞取本品約50ml，置具塞試管中，密封，置80℃烘箱中加熱72小時(shí)，放冷，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取空白輔料同法操作，進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。(2)堿破壞精密量取本品5ml，置具塞試管中，加1mol/l氫氧化鈉溶液3.0ml，搖勻，密封，置80℃烘箱中加熱72小時(shí)，放冷，加1mol/l鹽酸溶液約3.0ml中和并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另取空白輔料同法操作，進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。(3)酸破壞精密量取本品5ml，置具塞試管中，加1mol/l鹽酸溶液3.0ml，搖勻，密封，置80℃烘箱中加熱72小時(shí)，放冷；加1mol/l氫氧化鈉溶液約3.0ml中和并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另取空白輔料同法操作，進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。(4)氧化破壞精密量取本品5ml，置具塞試管中，加30％雙氧水溶液0.5ml，搖勻，密封，置60℃烘箱中加熱24小時(shí)，放冷，加流動(dòng)相轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另取空白輔料同法操作，進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。(5)光照破壞精密量取本品5ml，置50ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，置于照度為4500lx的條件下放置3天，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另取空白輔料同法操作，進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。(6)物料平衡計(jì)算：取鹽酸氨溴索對(duì)照品適量加流動(dòng)相溶解并稀釋制成，搖勻作為對(duì)照品溶液，采用外標(biāo)法計(jì)算上述各破壞溶液中主藥的剩余含量xj％，同時(shí)對(duì)比破壞前主藥的含量x0％，按百分之百主藥剩余含量校正后，與以面積歸一化法計(jì)算的雜質(zhì)降解后主藥百分比含量xz％進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)行物料平衡m的計(jì)算(m＝(xj/x0)/xz*100％，結(jié)果見表2。表2強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果由降解試驗(yàn)結(jié)果可知本品與降解產(chǎn)物能夠良好分離，采用二極管陣列檢測器檢驗(yàn)上述各試驗(yàn)項(xiàng)下的主峰純度，結(jié)果顯示主峰中未檢出不純物。具體結(jié)果見以上圖譜中純度報(bào)告。通過對(duì)降解前后含量的測定，計(jì)算供試品含量下降的數(shù)值，與降解產(chǎn)物增加的數(shù)值，判定物料基本平衡。通過對(duì)自制樣品與市售樣品破壞試驗(yàn)圖譜的觀察，雜質(zhì)種類、個(gè)數(shù)及大小基本相同。(二)分離度實(shí)驗(yàn)(1)輔料空白溶液：按處方比例配制輔料溶液分別照上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，由圖1可知本品輔料對(duì)主峰的測定無干擾。(2)對(duì)照品溶液：精密稱取鹽酸氨溴索對(duì)照品約15mg，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸氨溴索對(duì)照品貯備液(1.5mg/ml)；另精密稱取鹽酸氨溴索雜質(zhì)a、b、c、d、e對(duì)照品各約15mg，分別置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸氨溴索雜質(zhì)a、b、c、d、e對(duì)照品貯備液(150μg/ml)。取鹽酸氨溴索對(duì)照品貯備液和鹽酸氨溴索雜質(zhì)a、b、c、d、e對(duì)照品貯備液各1ml，分別置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為各對(duì)照品溶液；再分別取鹽酸氨溴索對(duì)照品貯備液和鹽酸氨溴索雜質(zhì)a、b、c、d、e對(duì)照品貯備液各1ml，同置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液(每1ml含鹽酸氨溴索約15μg，含雜質(zhì)a、b、c、d、e1.5μg)。按上述色譜條件試驗(yàn)。與已知雜質(zhì)的分離：由圖2可知，本品主峰與雜質(zhì)a、b、c、d、e均能夠良好的分離。通過以上試驗(yàn)可證明本方法具有專屬性。出峰順序?yàn)殡s質(zhì)b、雜質(zhì)a、鹽酸氨溴索、雜質(zhì)d、雜質(zhì)e、雜質(zhì)c。三、檢出限(1)鹽酸氨溴索精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下的鹽酸氨溴索對(duì)照品溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取3ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可看出，此時(shí)信噪比(s/n)約為3，即在該色譜條件下，鹽酸氨溴索的最小量為0.9ng，相對(duì)供試品溶液(0.75mg/ml)的最小檢出限為0.006％(2)雜質(zhì)a精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下雜質(zhì)a對(duì)照品貯備溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可看出，此時(shí)信噪比(s/n)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)a的最小量為1.2ng，相對(duì)供試品溶液(0.75mg/ml)的最小檢出限為0.008％。(3)雜質(zhì)b精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下雜質(zhì)b對(duì)照品貯備溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置200ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可看出，此時(shí)信噪比(s/n)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)b的最小量為0.75ng，相對(duì)供試品溶液(0.75mg/ml)的最小檢出限為0.005％。(4)雜質(zhì)c精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下雜質(zhì)c對(duì)照品貯備溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可看出，此時(shí)信噪比(s/n)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)c的最小量為3ng，相對(duì)供試品溶液(0.75mg/ml)的最小檢出限為0.02％。(5)雜質(zhì)d精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下雜質(zhì)d對(duì)照品貯備溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可看出，此時(shí)信噪比(s/n)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)d的最小量為0.6ng，相對(duì)供試品溶液(0.75mg/ml)的最小檢出限為0.004％。(6)雜質(zhì)e精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下雜質(zhì)e對(duì)照品貯備溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可看出，此時(shí)信噪比(s/n)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)e的最小量為1.5ng，相對(duì)供試品溶液(0.75mg/ml)的最小檢出限為0.001％。四、定量限(1)鹽酸氨溴索精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下的鹽酸氨溴索對(duì)照品溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可看出，此時(shí)信噪比(s/n)約為10，即在該色譜條件下，鹽酸氨溴索的定量限濃度為0.15μg/ml，相對(duì)于供試品溶液中鹽酸氨溴索的定量限為0.02％，6次試驗(yàn)結(jié)果的rsd為1.89％。(2)雜質(zhì)a精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下雜質(zhì)a對(duì)照品貯備溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可看出，此時(shí)信噪比(s/n)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)a的定量限濃度為0.15μg/ml，相對(duì)供試品溶液(0.75mg/ml)的定量限為0.02％，6次試驗(yàn)結(jié)果的rsd為1.76％。(3)雜質(zhì)b精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下雜質(zhì)b對(duì)照品貯備溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可看出，此時(shí)信噪比(s/n)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)b的定量限濃度為0.15μg/ml，相對(duì)供試品溶液(0.75mg/ml)的定量限為0.02％，6次試驗(yàn)結(jié)果的rsd為2.37％。(4)雜質(zhì)c精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下雜質(zhì)c對(duì)照品貯備溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置20ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可看出，此時(shí)信噪比(s/n)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)c的定量限濃度為0.38μg/ml，相對(duì)供試品溶液(0.75mg/ml)的定量限為0.05％，6次試驗(yàn)結(jié)果的rsd為2.19％。(5)雜質(zhì)d精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下雜質(zhì)a對(duì)照品貯備溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可看出，此時(shí)信噪比(s/n)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)d的定量限濃度為0.15μg/ml，相對(duì)供試品溶液(0.75mg/ml)的定量限為0.02％，6次試驗(yàn)結(jié)果的rsd為2.85％。(6)雜質(zhì)e精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下雜質(zhì)e對(duì)照品貯備溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可看出，此時(shí)信噪比(s/n)約為3，即在該色譜條件下，雜質(zhì)e的定量限濃度為0.30μg/ml，相對(duì)供試品溶液(0.75mg/ml)的定量限為0.04％，6次試驗(yàn)結(jié)果的rsd為2.28％。五、線性與范圍(1)鹽酸氨溴索：精密量取上述分離度試驗(yàn)項(xiàng)下的鹽酸氨溴索對(duì)照品溶液1、2、5、10、15ml，分別置100ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，依次精密量取5種溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。測定結(jié)果見表3。表3鹽酸氨溴索線性關(guān)系測定結(jié)果以色譜圖峰面積(a)對(duì)其濃度(c)作線性回歸,得下圖1。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸氨溴索濃度在0.15～2.25μg/ml，鹽酸氨溴索峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。(2)雜質(zhì)a、b、d：取鹽酸氨溴索雜質(zhì)a、b、d對(duì)照品貯備液各1、2、5、10、15ml，分別置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再各精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，依次精密量取5種溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。測定結(jié)果見表4。表3雜質(zhì)a、b、d線性關(guān)系測定結(jié)果以色譜圖峰面積(a)對(duì)其濃度(c)作線性回歸,得下圖2-4。試驗(yàn)結(jié)果表明，雜質(zhì)a、b、d濃度在0.15～2.25μg/ml，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。(2)雜質(zhì)c、e：取鹽酸氨溴索雜質(zhì)c、e對(duì)照品貯備液各2、5、8、10、15ml，分別置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再各精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，依次精密量取5種溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。測定結(jié)果見表5。表5雜質(zhì)c、e線性關(guān)系測定結(jié)果以色譜圖峰面積(a)對(duì)其濃度(c)作線性回歸,得下圖5-6。試驗(yàn)結(jié)果表明，雜質(zhì)c、e濃度在0.30～2.25μg/ml，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。六、已知雜質(zhì)校正因子對(duì)雜質(zhì)a、雜質(zhì)b、雜質(zhì)c、雜質(zhì)d、雜質(zhì)e的校正因子采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算。計(jì)算公式：校正因子＝主成分斜率/雜質(zhì)斜率。各雜質(zhì)的計(jì)算結(jié)果見表6。表6已知雜質(zhì)的校正因子計(jì)算結(jié)果七、校正因子耐用性考察分別采用三臺(tái)不同的液相色譜儀，三根不同的色譜柱，在相同條件下，取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，測定并繪制吡拉西坦及各雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)斜率計(jì)算各雜質(zhì)的校正因子，結(jié)果見表。表6校正因子耐用性考察由于測定校正因子過程中涉及到儀器、色譜柱誤差等綜合因素，校正因子誤差在儀器誤差范圍內(nèi)。由表可知，雜質(zhì)a、雜質(zhì)b、雜質(zhì)c、雜質(zhì)d、雜質(zhì)e的校正因子較為穩(wěn)定，均在1.10～1.53范圍內(nèi)，所以可采用加校正因子的自身對(duì)照法對(duì)這五個(gè)已知雜質(zhì)進(jìn)行定量。八、基線調(diào)平采用本方法進(jìn)行測定時(shí)，基線往上飄，當(dāng)進(jìn)校量小或濃度低時(shí)，容易將量小的雜質(zhì)峰給重合，積出的峰面積有較大的誤差，為了改善這種情況，通過嘗試在磷酸緩沖鹽中加入不同的有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、丙二酸以及丁二酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有加入丁二酸時(shí)，基線才趨于平直，質(zhì)量百分濃度為0.02％時(shí)，效果最好。結(jié)果見色譜圖見圖7和圖8。當(dāng)前第1頁12