本發(fā)明涉及葉酸定量檢測，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測人血清中葉酸及其代謝物的方法，血清葉酸檢測成品試劑盒。
背景技術(shù)：
葉酸(FA)又名維生素M，維生素B9，屬于維生素B族中的重要一種，其化學(xué)名為蝶酰谷氨酸，由對氨基苯甲酸，蝶啶，谷氨酸殘基結(jié)合而成，天然葉酸主要以聚谷氨酸形式存在。人體自身不能直接合成葉酸，主要通過食物攝取，吸收的葉酸主要以四氫葉酸的形式儲存在肝臟，也存在于腸壁、骨髓等其他組織中。葉酸通過還原型輔酶II(NADPH)，葉酸還原酶以及維生素C的作用下，還原成具有生理活性的四氫葉酸，隨之代謝為其活性成分5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)和5-甲酰四氫葉酸(5-FTHF)等，通過血液被帶到紅細胞或其他細胞中參與DNA的合成。葉酸是人體細胞生長和分裂的必須物質(zhì)，主要體現(xiàn)在其作為體內(nèi)最主要的甲基供體，與其他輔酶協(xié)同參與DNA的合成和代謝，以及體內(nèi)氨基酸、蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)等的再甲基化。葉酸是機體細胞生長和繁殖所必需的物質(zhì)，是進行DNA合成不可或缺的，是正常紅細胞發(fā)育成熟所必需的，如果缺乏會導(dǎo)致骨髓中幼紅細胞發(fā)育異常，會引發(fā)巨紅細胞性貧血；也是神經(jīng)管缺陷的其中一個重要影響因素；還與心血管疾病、癡呆癥、認知缺陷等發(fā)生有關(guān)。
血清葉酸測定可以提供體內(nèi)葉酸狀態(tài)的早期指標，結(jié)合葉酸及其代謝物的檢測可及時反應(yīng)當(dāng)前人體葉酸代謝情況。在人血清中，5-甲基四氫葉酸作為葉酸最主要的活性代謝物，其可占葉酸類物質(zhì)的90％，同時檢測血清中葉酸，5-甲基四氫葉酸和5-甲酰四氫葉酸能較全面的反應(yīng)當(dāng)前人體葉酸狀態(tài)。
葉酸類物質(zhì)傳統(tǒng)的臨床檢測主要有微生物測定法，同位素放射免疫法，離子捕獲法，時間分辨熒光法、化學(xué)發(fā)光法等傳統(tǒng)方法及相關(guān)試劑盒，但其問題主要如下：一、這些方法都為間接檢測法，因此都不能排除基質(zhì)效應(yīng)和忽略了化合物不穩(wěn)定性，且不同平臺間的差異較大，容易造成不同平臺結(jié)果的不一；二、該類方法沒有分別準確檢測多個指標，考察葉酸及具有活性的葉酸代謝物成分，從而不能更好去詮釋葉酸在人體內(nèi)的代謝情況，以及與身體健康狀況之間的關(guān)系。另外，目前還有能夠檢測葉酸代謝相關(guān)基因的技術(shù)方法，但是該方法所檢測的是相關(guān)基因位點，可以用作葉酸代謝能力的病因分析，但是不能用作臨床鑒定病人葉酸是否缺乏。
因此，臨床檢測亟需一種不僅具備高靈敏度，高特異性，高準確度檢測結(jié)果，還可同時檢測葉酸及其代謝物質(zhì)，并擁有操作簡單方便，容易推廣的葉酸直接檢測方法及試劑盒，以祛除基質(zhì)效應(yīng)和化合物不穩(wěn)定性對實驗結(jié)果的影響，從而提高臨床檢測質(zhì)量。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明所要解決的問題是提供一種可以全面檢測人體血清葉酸狀態(tài)的試劑盒，并且能夠有效祛除基質(zhì)干擾，提高檢測準確性，操作簡便，可同時檢測葉酸及其代謝物。
為解決上述問題，本發(fā)明公開了一種人體血清葉酸及其代謝物串聯(lián)質(zhì)譜檢測試劑盒及其應(yīng)用方法，其中：
一、試劑盒組成和配制方法如下：
1、校準品：使用2％～8％BSA稀釋液，優(yōu)選4％BSA稀釋液(DTT、抗壞血酸和檸檬酸一水合物含量均為0.01％)，同時加入適量的葉酸(FA)、5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)和5-甲酰四氫葉酸(5-FTHF)原料，配制成包括6個濃度劑量點的校準品，凍干后使用。優(yōu)選的6個濃度劑量點校準品均按照(0ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、1.8ng/mL、5.4ng/mL、27.0ng/mL)設(shè)置，并且可溯源至WHO International Standard Vitamin B12，Serum Folate and Holo TC。
2、質(zhì)控品：使用2％～8％BSA稀釋液，優(yōu)選4％BSA稀釋液(DTT、抗壞血酸和檸檬酸一水合物含量均為0.01％)，同時加入適量葉酸(FA)、5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)和5-甲酰四氫葉酸(5-FTHF)原料，配制成包括高、低2個濃度的質(zhì)控品，凍干后使用。優(yōu)選的2個濃度的質(zhì)控品分別按照2.0ng/mL、10.0ng/mL設(shè)置。
3、內(nèi)標準品：使用2％～8％BSA稀釋液作為稀釋液，優(yōu)選2％BSA稀釋液(DTT、抗壞血酸和檸檬酸一水合物含量均為0.01％)，同時將13C5葉酸和d3 5-甲基四氫葉酸稀釋至終濃度為300ng/mL～600ng/mL，優(yōu)選400ng/mL。
4、解離劑：1M DTT水溶液。
5、解離劑稀釋液：0.1MPBS緩沖液。
6、流動相A：由甲酸與水配制而成，甲酸的含量為0.05％～0.2％，優(yōu)選0.1％。
7、流動相B：由甲酸與乙腈配制而成，甲酸的含量為0.05％～0.2％，優(yōu)選0.1％。
8、復(fù)溶液：由乙腈與水配制而成，乙腈的含量為0.5％～2％，優(yōu)選1％。
9、96孔微孔板：使用耐腐蝕的聚丙乙烯材料的96孔微孔板；優(yōu)選U型底的無包被的96 孔深孔微孔板作為反應(yīng)板；V型底的無包被的96孔微孔板作為進樣板。
10、操作說明書；
11、分隔并集中包裝上述1～10的包裝盒。
二、試劑盒使用方法如下：
1、準備工作液：通過以一定的比例稀釋試劑盒中的校準品、質(zhì)控品、內(nèi)標準品、解離劑和解離稀釋液，以滿足樣品處理所需；其中，將凍干的校準品和質(zhì)控品用純化水溶解成工作液；優(yōu)選的，按照解離劑∶解離劑稀釋液＝1∶4的比例配制成解離工作液，按照按內(nèi)標準品∶乙腈＝1∶199配制成內(nèi)標工作液。
2、樣品前處理：優(yōu)選的，取200μL的血清樣品與50μL解離工作液于96孔深孔微孔板中混合，37℃溫育5min；加入600μL內(nèi)標準品工作液，離心分離上清700μL氮氣室溫徹底吹干，加入70μL復(fù)溶液至溶解完全。
3、移液：從每個板孔中將適量的溶液轉(zhuǎn)移到96孔微孔板進樣板孔內(nèi)，優(yōu)選50μL/孔。
4、色譜條件準備(設(shè)置)：優(yōu)選的，Poroshell 120EC-C18(4.6*50mm)色譜柱，0.6mL/min(0.0～2min：流動相A：99％；3～4.5min：流動相A：99％→90％；4.5.5～6.0min：流動相A：90％→85％；6.0～6.1min：流動相A：85％→10％；6.1～8.5min：流動相A：10％；8.5～12min：流動相A：10％→99％)，40℃柱溫。
5、質(zhì)譜條件準備(設(shè)置)：優(yōu)選的，ESI正離子MRM掃描模式，Q1/Q3離子通道分別選擇為FA：442.2→295.2amu，F(xiàn)A-13C5：447.2→295.2amu；5-MTHF：460.3→313.3amu；5-MTHF-13C，d3：464.3→317.3amu和5-FTHF：474.3→327.3amu。
6、上機檢測：將適量液體進入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測分析，優(yōu)選20μL，并記錄色譜圖與檢測樣品中葉酸(FA)、5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)和5-甲酰四氫葉酸(5-FTHF)的峰面積與內(nèi)標峰面積。
7、結(jié)果分析：以6個校準品的標示濃度為橫坐標(x)，實際檢測峰面積與各自內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標(y)，繪制標準曲線和計算曲線回歸方程，將血清樣品中相應(yīng)物質(zhì)的實際檢測峰面積與內(nèi)標峰面積的比值代入標準曲線回歸方程，即可計算出樣品中葉酸(FA)、5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)和5-甲酰四氫葉酸(5-FTHF)的濃度。
本發(fā)明具有以下特點：
1.本試劑盒已經(jīng)含有人體血清葉酸及其代謝物檢測串聯(lián)質(zhì)譜法所需的主要配套試劑和耗材，并且簡化了實驗操作步驟，從而能使臨床檢測更加簡便快捷，大大減少試劑耗材的單獨購買和自行配制試劑帶來的操作誤差。
2.本試劑盒使用的檢測方法為液相質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜法，根據(jù)分析物固有的理化性質(zhì)進行直接檢測血清中的葉酸及其代謝物，能夠消除臨床血樣的基質(zhì)效應(yīng)，并且能夠準確的定量出各個分析物質(zhì)在體內(nèi)的情況。
3.本試劑盒使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測，與背景技術(shù)介紹的傳統(tǒng)檢測方法相比，本試劑盒可同時分別準確定量檢測出人體血清中葉酸，5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)和5-甲酰四氫葉酸(5-FTHF)三種葉酸類物質(zhì)，從而更加清楚的反映體內(nèi)葉酸狀態(tài)。
附圖說明
圖1.樣品處理操作流程。
具體實施方式
本發(fā)明為一種人體血清葉酸及其代謝物串聯(lián)質(zhì)譜檢測試劑盒，為臨床檢測提供了配套成熟的試劑盒以及所包含對應(yīng)的操作方法。為了使本發(fā)明實施的上述目的、特征和有點能夠更加清晰易懂，具體包括試劑盒組分和操作方法，具體如下：
實施例1：試劑盒組分
實施例2、試劑盒配套操作方法
1.試劑組分配制：
(1)校準品(A、B、C、D、E、F)和質(zhì)控品(C1、C2)：室溫條件下，準確量取1000μL純化水至每瓶校準品或質(zhì)控品中，至凍干粉完全溶解(不少于15分鐘)，備用。
(2)內(nèi)標準品：室溫條件下，準確量取1000μL純化水至1瓶內(nèi)標中，至凍干粉完全溶解(不小于15分鐘)，備用。本發(fā)明實施例中內(nèi)標準品已包含13C5葉酸和d3 5-甲基四氫葉酸，為混合內(nèi)標，無需單獨配制。
(3)工作液
a)內(nèi)標準品工作液：按內(nèi)標準品∶流動相B液＝1∶199把內(nèi)標儲液稀釋200倍；
b)解離工作液：按照解離液(5×)∶解離稀釋液＝1∶4的比例配制。
2.檢測樣品處理：參見圖1
a)樣品解離：分別精密吸取200μL校準品、質(zhì)控品、血清樣品溶液于對應(yīng)的1.5mL離心管中，然后準確各加入50μL解離工作液，渦旋2分鐘后置于37℃溫育5min；
b)混合內(nèi)標：在步驟①各混合液中分別加入600μL內(nèi)標準品工作液，充分渦旋2分鐘，然后13000rpm離心15min；
c)氮氣吹干：離心后各吸取700μL上清液至96孔深孔板，氮氣室溫徹底吹干；
d)復(fù)溶：然后各加入70μL樣品復(fù)溶液，用封片封好，振蕩孵育5分鐘；
e)轉(zhuǎn)移：復(fù)溶后各孔轉(zhuǎn)移50μL至96孔錐型板，用封片封好上樣板準備上機進樣分析。
3.色譜條件：
a)色譜柱：Poroshell 120EC-C18(4.6*50mm)或相當(dāng)者；
b)流動相：流動相A液，流動相B液；
c)流速：0.6mL/min；
d)梯度洗脫條件：
e)柱溫：40℃；
f)進樣量：20μL。
4.質(zhì)譜條件：
a)離子源：電噴霧電離(ESI)；
b)掃描模式：正離子MRM掃描分析，Q1/Q3離子通道分別選擇為FA：442.2→295.2amu，F(xiàn)A-13C5：447.2→295.2amu；5-MTHF：460.3→313.3amu；5-MTHF-13C，d3：464.3→317.3amu和5-FTHF：474.3→327.3amu。
c)本發(fā)明實施例的一個優(yōu)選示例中，離子源參數(shù)如下：
離子源參數(shù)可根據(jù)實際儀器型號不同而有所不同。
a)本發(fā)明實施例的一個優(yōu)選示例中，質(zhì)譜參數(shù)如下：
質(zhì)譜電壓參數(shù)可根據(jù)實際儀器型號不同而有所不同。
5.樣品檢測：
選取處理好的校準品、質(zhì)控品和血清樣品各20μL注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測分析，并記錄色譜圖與檢測樣品中FA、5-MTHF和5-FTHF的峰面積與內(nèi)標峰面積。
6.檢測結(jié)果的計算：
(1)標準曲線的繪制方法：以6個校準品的標示濃度(FA：0ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、1.8ng/mL、5.4ng/mL、27ng/mL；5-MTHF：0ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、1.8ng/mL、5.4ng/mL、27ng/mL；5-FTHF：0ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、1.8ng/mL、5.4ng/mL、27ng/mL)為橫坐標(x)，以6個校準品的實際檢測峰面積與各自內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標(y)，繪制標準曲線。
(2)標準曲線方程的擬合：以6個校準品的峰面積比值(y)對標示濃度(x)進行線性回歸?？色@得回歸方程：y＝a+bx，其中y為縱坐標，x為橫坐標，a為截距，b為斜率，并計算相關(guān)系數(shù)(r)，要求r不小于0.9900。
(3)血清樣品結(jié)果的計算：將血清樣品中葉酸的實際檢測峰面積與內(nèi)標峰面積的比值代入標準曲線方程，計算血清樣品中葉酸及其代謝物的濃度。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的人和附圖標記視為限制所涉及的權(quán)利要求。