本實(shí)用新型涉及一種降鈣素原定量檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光微流控盤片，屬于醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域，能夠在很短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品中降鈣素原的定量檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，低成本的特點(diǎn)。

背景技術(shù)：

降鈣素原 (PCT) 是一種含 116 個(gè)氨基酸的無激素活性糖蛋白， 分子量約為13 kDa，在生理情況下由甲狀腺-C細(xì)胞產(chǎn)生，在健康人群的血清中幾乎不能被檢出。在細(xì)菌、真菌、寄生蟲等感染性疾病并有全身或/和中樞神經(jīng)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)時(shí)，病菌的內(nèi)毒素可促使甲狀腺-C細(xì)胞、肝臟巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞、肺和腸道組織的淋巴細(xì)胞以及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞等甲狀腺以外的組織大量產(chǎn)生 PCT，而導(dǎo)致其血清中的含量升高或持續(xù)性升高。新生兒的 PCT 水平于出生后1~2天內(nèi)和少數(shù)大型外科手術(shù)患者術(shù)后1～4天內(nèi)的 PCT 可有輕度短暫升高，但均呈逐日下降趨勢(shì)且于三天后即可達(dá)到成人正常值。為此 PCT 檢查可為上述病情提供確切的鑒別診斷。

PCT 水平反映了全身細(xì)菌性炎癥反應(yīng)的活躍程度，并提示與被感染器官的大小和類型、細(xì)菌的種類、以及炎癥程度和免疫反應(yīng)狀況相關(guān)。PCT 水平的升高雖可出現(xiàn)在嚴(yán)重休克、全身性炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能紊亂綜合征患者，如無細(xì)菌感染或細(xì)菌感染性病灶存在，其水平通常低于那些有細(xì)菌感染性病灶的患者。PCT 檢測(cè)的臨床價(jià)值是多方面的。對(duì)細(xì)菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒血癥性感染的病因診斷、抗生素的臨床應(yīng)用、病情和預(yù)后的評(píng)估均具有明顯的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)自身免疫、過敏、病毒感染和無菌性炎癥等具有明確的鑒別診斷價(jià)值。

目前，檢測(cè)降鈣素原的方法主要有放射免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、膠體金比色法。放射免疫分析法檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，而且有放射性元素的污染使用受到限制；膠體金比色法具有快速簡(jiǎn)便、容易觀察等特點(diǎn)，是一種快速的半定量使用方法；化學(xué)發(fā)光免疫分析法操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，目前得到廣泛的應(yīng)用。

磁微粒免疫檢測(cè)技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親和力的的抗體或抗原等各種免疫活性物質(zhì)，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、不影響被分離細(xì)胞或其他生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點(diǎn)，在外加磁場(chǎng)作用下可定向運(yùn)動(dòng)，使某些特殊成分得以分離、濃集或純化。

微流控芯片作為一種新型的分析檢測(cè)平臺(tái)，具有高通量、集成化、便攜式、易操作、低成本等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在眾多領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在免疫分析領(lǐng)域已嶄露頭角。

免疫磁珠的生物微流控芯片是將磁顆粒技術(shù)，免疫分析集成到微流控芯片上的一種分析使用方法，目前這種綜合性的使用方法的主要難點(diǎn)表現(xiàn)為：1) 液體在芯片內(nèi)部微流動(dòng)的智能控制，目前常采用的方法是在芯片內(nèi)部設(shè)置多個(gè)微泵和微閥，使得微流控體系變得更加復(fù)雜化；2) 反應(yīng)體系的混合不充分，導(dǎo)致反應(yīng)不充分；3) 集成化程度不高，導(dǎo)致非特異性背景高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本實(shí)用新型目的在于提供了一種降鈣素原定量檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光微流控盤片；本實(shí)用新型能實(shí)現(xiàn)全血分離 (樣本前處理)、血漿定量、培育混合、清洗的功能，能快速實(shí)現(xiàn)樣品中 PCT 濃度的定量檢測(cè)，具有檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好的特點(diǎn)。

為了達(dá)到上述目的，本實(shí)用新型的技術(shù)方案是：

一種降鈣素原定量檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光微流控盤片，包括微流控盤片，所述的微流控盤片上安裝有微流檢測(cè)單元，所述的微流檢測(cè)單元包括全血注入槽，所述的全血注入槽通過全血分離信道與血球儲(chǔ)存槽相連，所述血球儲(chǔ)存槽與血漿傳送流道連通；所述的血漿傳送流道與混合/偵測(cè)槽頂部相連；所述的混合/偵測(cè)槽頂部通過管路與降鈣素原單克隆抗體包被的磁微粒溶液注入槽連通；所述的混合/偵測(cè)槽頂部還通過管路與清洗液注入槽連通；所述的混合/偵測(cè)槽一側(cè)安裝有內(nèi)含磁鐵的外部磁鐵區(qū)域；所述的混合/偵測(cè)槽底部通過管路與廢液槽連通，且所述的混合/偵測(cè)槽底部與廢液槽之間的管路上安裝有閥門；所述的降鈣素原單克隆抗體包被的磁微粒溶液注入槽頂部通過管路與堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液注入槽的底部連通；所述的清洗液注入槽頂部通過管路與發(fā)光底物液注入槽的底部連通。

所述的微流控盤片上安裝6個(gè)以上且為6的倍數(shù)的微流檢測(cè)單元。

所述的微流控盤片上優(yōu)選安裝12個(gè)微流檢測(cè)單元。

本實(shí)用新型的有益效果是：本實(shí)用新型能實(shí)現(xiàn)全血分離 (樣本前處理)、血漿定量、培育混合、清洗的功能，能快速實(shí)現(xiàn)樣品中 PCT 濃度的定量檢測(cè)，具有檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1是本實(shí)用新型一種降鈣素原定量檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光微流控盤片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是圖1中微流控盤片上單個(gè)微流檢測(cè)單元的放大示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：降鈣素原的定量檢測(cè)

本實(shí)施例的一種降鈣素原定量檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光微流控盤片，如圖1、2所示，包括微流控盤片13，所述的微流控盤片13上安裝有12個(gè)微流檢測(cè)單元，所述的每個(gè)微流檢測(cè)單元包括全血注入槽1，所述的全血注入槽1通過全血分離信道2與血球儲(chǔ)存槽3相連，所述血球儲(chǔ)存槽3與血漿傳送流道4連通；所述的血漿傳送流道4與混合/偵測(cè)槽7頂部相連；所述的混合/偵測(cè)槽7頂部通過管路與降鈣素原單克隆抗體包被的磁微粒溶液注入槽9連通；所述的混合/偵測(cè)槽7頂部還通過管路與清洗液注入槽10連通；所述的混合/偵測(cè)槽7一側(cè)安裝有內(nèi)含磁鐵的外部磁鐵區(qū)域8；所述的混合/偵測(cè)槽7底部通過管路與廢液槽6連通，且所述的混合/偵測(cè)槽7底部與廢液槽6之間的管路上安裝有閥門5；所述的降鈣素原單克隆抗體包被的磁微粒溶液注入槽9頂部通過管路與堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液注入槽11的底部連通；所述的清洗液注入槽10頂部通過管路與發(fā)光底物液注入槽12的底部連通。

1. 降鈣素原溶液配制

1）降鈣素原系列校準(zhǔn)品的制備：用胎牛血清將降鈣素原純品（海肽生物科技（上海）有限公司）稀釋為系列校準(zhǔn)品，其校準(zhǔn)品濃度范圍為 0～50 ng/mL。

2）降鈣素原單克隆抗體包被的磁微粒溶液的制備：

將降鈣素原單克隆抗體（海肽生物科技（上海）有限公司）置于透析袋中，在PBS緩沖液中過夜透析；用PBS緩沖液配制BNHS溶液，每mg抗體中加入15μL BNHS（生物素-N-羥基琥珀亞胺酯（上海勵(lì)瑞生物科技有限公司）溶液，混合均勻，室溫反應(yīng)30min；將標(biāo)記好的抗體置于透析袋中，在PBS緩沖液中過夜透析。將2.0 μm 的鏈霉親和素磁微粒（廣州達(dá)于成貿(mào)易有限公司）加磁場(chǎng)，靜置5min，倒出上清液，用PBS緩沖液清洗3次，并用該緩沖液進(jìn)行懸??；倒出上清液；每mL磁微粒懸浮液中加入1mg標(biāo)記好的抗體，混合均勻，室溫反應(yīng)20min；用含有5%的牛血清白蛋白的Tris-HCl緩沖液清洗3次；用含有0.5%牛血清白蛋白和0.02% Proclin300（防腐劑，上海勵(lì)瑞生物科技有限公司）的PBS緩沖液重懸，得到降鈣素原單克隆抗體包被的磁微粒溶液。

3）堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液的制備：用PB緩沖液配制Sulfo-SMCC溶液，每mg堿性磷酸酶中加入0.1mL Sulfo-SMCC（4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽，上海勵(lì)瑞生物科技有限公司）溶液，混合均勻，室溫反應(yīng)30min，在PB緩沖液中透析；用PB緩沖液配制2-亞氨基硫羥烷鹽酸鹽溶液，每mg抗體中加入0.1mL 2-亞氨基硫羥烷鹽酸鹽溶液，混合均勻，室溫反應(yīng)30min，在p PB緩沖液中透析；將上述透析后的堿性磷酸酶和抗體混合均勻，室溫反應(yīng)120min；通過蛋白純化系統(tǒng)（AKTA purifier100）收集蛋白，加入50%的甘油，得到堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原抗體溶液。

4）堿性磷酸酶催化的化學(xué)發(fā)光底物液的制備：向Tris-HCl緩沖液中加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇、AMPPD（1，2-二氧環(huán)已烷衍生物，廣州達(dá)于成貿(mào)易有限公司）和發(fā)光增強(qiáng)劑（AP底物增強(qiáng)劑，上海勵(lì)瑞生物科技有限公司）。

5）清洗液的制備：向Tris-HCl緩沖液中加入0.02%的吐溫20和15%的氯化鈉。

2. 本實(shí)施例的一種降鈣素原定量檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光微流控盤片的使用方法，包括如下步驟：

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取 30 μL PCT系列標(biāo)準(zhǔn)品 (濃度為0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL) 加入本實(shí)施例中的微流控盤片的降鈣素原單克隆抗體包被的磁微粒溶液注入槽9，將微流控盤片13置于配套檢測(cè)儀器中。每個(gè)樣本分別重復(fù)測(cè)定五次。配套儀器根據(jù) RLU 和 PCT 濃度間的比例關(guān)系，自動(dòng)擬合計(jì)算出 PCT 濃度，取五次測(cè)定平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）將微流控盤片13放入配套儀器中，開啟自動(dòng)加樣裝置，可將全血 150 μL 、降鈣素原單克隆抗體包被的磁微粒溶液 30 μL、堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液 20 μL 注入至全血注入槽1、降鈣素原單克隆抗體包被的磁微粒溶液注入槽9、堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液注入槽 11中。

3）以 4,500 RPM (加速度a=1,500 RPM/s) 操控盤片旋轉(zhuǎn) 50 秒，能在全血分離信道2分離血漿及血球，并將降鈣素原單克隆抗體包被的磁微粒溶液及堿性磷酸酶標(biāo)記的降鈣素原單克隆抗體溶液傳送至混合/偵測(cè)槽7，降鈣素原單克隆抗體包被的磁微粒溶液可藉外部磁鐵區(qū)域8中的磁鐵的吸引保留于混合/偵測(cè)槽7中(可避免被沖刷至廢液槽)。

4）以 1,500 RPM (加速度a=500 RPM/s) 操控盤片旋轉(zhuǎn) 20 秒，能將血漿經(jīng)由血漿傳送流道4傳送至混合/偵測(cè)槽7，血球則被保留于血球儲(chǔ)存槽3。

5）以 1,300 RPM (加速度a=2,500 RPM/s) 操控盤片旋轉(zhuǎn) 40 秒，藉由外部磁鐵區(qū)域8中的磁鐵操控，可操縱降鈣素原單克隆抗體包被的磁微粒于混合/偵測(cè)槽7內(nèi)移動(dòng)，進(jìn)而達(dá)到良好的混合/培育效果。

6）將清洗液 60 μL注入至清洗液注入槽10內(nèi)，以 3,600 RPM (加速度a=3,600 RPM/s) 操控微流控盤片13旋轉(zhuǎn) 22 秒，可將清洗液傳送至混合/偵測(cè)槽7，清洗液可置換混合/偵測(cè)槽7內(nèi)的液體，此液體會(huì)被傳送至廢液槽6，降鈣素原單克隆抗體包被的磁微?？山逵赏獠看盆F區(qū)域8中的磁鐵的吸引保留于混合/偵測(cè)槽內(nèi)7。

7）將發(fā)光底物液 40 μL注入至發(fā)光底物液注入槽12內(nèi)，以 2,700 RPM (加速度a=1,150 RPM/s) 操控盤片旋轉(zhuǎn) 16 秒，可將發(fā)光底物傳送至混合/偵測(cè)槽7，發(fā)光底物可置換混合/偵測(cè)槽7內(nèi)的液體，此液體會(huì)被傳送至廢液槽，降鈣素原單克隆抗體包被的磁微?？山逵赏獠看盆F區(qū)域8中的磁鐵的吸引保留于混合/偵測(cè)槽7內(nèi)。最終，已反應(yīng)的液體會(huì)在混合/偵測(cè)槽7進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度 (RLU) 與降鈣素原抗原濃度間的比例關(guān)系，檢測(cè)系統(tǒng)可自動(dòng)換算，可快速報(bào)告測(cè)試結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)降鈣素原的定量檢測(cè)。

8）結(jié)果表明：采用本實(shí)用新型所述方法檢測(cè)靈敏度為0.05 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.05～100ng/mL，批間變異系數(shù)小于10%，批內(nèi)變異系數(shù)小于10%。

本實(shí)施例能實(shí)現(xiàn)全血分離 (樣本前處理)、血漿定量、培育混合、清洗的功能，能快速實(shí)現(xiàn)樣品中 PCT 濃度的定量檢測(cè)，具有檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好的特點(diǎn)。

實(shí)施例2：磁微粒顆粒尺寸篩選

磁性微球的粒徑小，比表面積大，表面含有活性基團(tuán)，故偶聯(lián)容量大，但磁性微球尺寸過小不利于磁鐵收集，尺寸過大在盤片中不利于混合反應(yīng)，故進(jìn)行磁微粒尺寸篩選。

其他的實(shí)驗(yàn)條件參見實(shí)施例1，磁微粒顆粒的尺寸按照以下方案進(jìn)行。

選擇顆粒尺寸分別為 0.1 μm、0.5 μm、1.0 μm、1.5 μm、2.0 μm、3.0 μm、5.0 μm 磁顆粒標(biāo)記降鈣素原單克隆抗體抗體。檢測(cè)時(shí)采用磁性大小經(jīng)過優(yōu)選的永久磁鐵，固定磁鐵高度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下 ：

磁微粒粒徑尺寸從 0.1 μm、0.5 μm、1.0 μm、1.5 μm、2.0 μm、3.0 μm 依次增強(qiáng)，3.0 μm 干擾加大，5.0 μm 開始減小，信號(hào)值最低，綜合各因素 2.0 μm 信號(hào)最強(qiáng)，干擾最小。

結(jié)果分析 ：磁微粒尺寸較小時(shí)，比表面積較大，表面所負(fù)載的生物分子量大，同時(shí)能夠很好地分散在溶液中，但要保證磁性微球充分被收集所需的磁場(chǎng)強(qiáng)度大。在本實(shí)施例中由于磁珠所受的磁場(chǎng)力不能保證其充分被收集，導(dǎo)致部分有效磁珠在清洗過程中流失，從而導(dǎo)致最終檢測(cè)信號(hào)值不高。當(dāng)磁顆粒粒徑較大時(shí)，比表面積小，表面生物分子的標(biāo)記率相對(duì)較低，相同條件下，磁性粒子所受磁場(chǎng)力大，分散的磁珠能夠得到充分的收集，但其由于極易發(fā)生沉降，導(dǎo)致生物分子間反應(yīng)不充分，從而減弱發(fā)光信號(hào)。綜合考慮，粒徑為 1.0 μm 至 3.0 μm 磁性微球效果較好，因此本實(shí)用新型的實(shí)施例中 2.0 μm 的磁性微球效果最好。