本實用新型涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種RNA pulldown試劑盒。

背景技術(shù)：

RNA結(jié)合蛋白(RBPs)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達起著重要的作用，具體的作用包括mRNA前體的剪接、多腺苷化和穩(wěn)定性的維持，mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的運輸，mRNA的定位和翻譯等。RBPs在這些過程中的調(diào)節(jié)作用是通過結(jié)合新合成的或者成熟后的轉(zhuǎn)錄物的特定序列實現(xiàn)的。于此同時，有很多RBPs能夠識別RNA中的特定核苷酸序列。為了研究RNA與蛋白的相互作用建立了很多方法，這些方法包括EMSA、SELEX技術(shù)、RNA footprinting、RNA免疫沉淀(RIP)和RNA pulldown技術(shù)。

RNA pulldown技術(shù)利用脫末端標(biāo)記的RNA高效富集及鑒定RNA結(jié)合蛋白(RBPs)。此方法避免了抗體的使用，大大延伸了使用范圍。隨著RNA pulldown技術(shù)的不斷完善，其在生命科學(xué)研究及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中扮演的角色愈加重要。

Hirofumi等通過RNA pulldown技術(shù)從線蟲的極少量的感覺神經(jīng)元中分離出mRNA，隨后通過芯片分析鑒定出了感覺神經(jīng)元的基因表達譜。(KUNITOMO H,UESUGI H,KOHARA Y,et al.2005.Identification of ciliated sensory neuron-expressed genes in Caenorhabditis elegans using targeted pull-down of poly(A)tails.Genome Biol[J],6:R17.)

現(xiàn)如今的研究中，RNA pulldown研究的探針主要是合成生物素標(biāo)記的單鏈探針，拓展了RNA的研究范圍。Tsai等通過改進的RNA pulldown技術(shù)分析了長鏈非編碼RNA(lincRNA)調(diào)節(jié)染色體狀態(tài)和表觀遺傳。他們發(fā)現(xiàn)lincRNA HOTAIR作為至少兩個組蛋白修飾復(fù)合體的腳手架。HOTAIR的5’端結(jié)合多梳抑制復(fù)合體2(PRC2)，3’端結(jié)合LSD1/CoREST/REST復(fù)合體，完成RNA介導(dǎo)的RPC2和LSD1復(fù)合體的組裝從而完成H3K27和H3K4兩個位點的甲基化。 (TSAI M C,MANOR O,WAN Y,et al.2010.Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.Science[J],329:689-693.)

上述RNA pulldown方法具有較明顯的缺點：(1)實驗中使用到的珠子(瓊脂糖珠子或磁珠)與蛋白的非特異結(jié)合，容易造成實驗結(jié)果的假陽性；(2)RNA探針與蛋白結(jié)合的特異性不高；(3)實驗過程還會受到核酸酶污染的影響。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，有必要針對現(xiàn)有技術(shù)中RNA pulldown的不足，提供一種RNA pulldown試劑盒。

一種RNA pulldown試劑盒，包含盒體和位于盒體內(nèi)的海綿墊，海綿墊上開設(shè)有多個容器孔，所述容器孔內(nèi)放置EP管和試劑瓶，所述試劑瓶包含TES溶液試劑瓶、NT2Buffer試劑瓶和RIP Buffer試劑瓶，所述EP管包含RNA structure buffer管、Urea CHAPS Buffer管、protease inhibitor cocktail管、DTT溶液管、RNase inhibitor管、PMSF溶液管、鏈霉親和素標(biāo)記磁珠管、DNase管、DNase Buffer管、寡核苷酸隨機引物管和poly(dI·dC)管。

優(yōu)選地，所述容器孔分為三組，第一組容器孔有2個，用于放置50mL試劑瓶，第二組容器孔有2個，用于放置4mL試劑瓶；第三組容器孔有12個，用于放置1mL EP管。

優(yōu)選地，所述TES溶液試劑瓶和NT2Buffer試劑瓶均為50mL試劑瓶，所述RIP Buffer試劑瓶為4mL試劑瓶；所述EP管均為1mL EP管。

優(yōu)選地，第一組容器孔位于海綿墊的左部，第二組容器孔和第三組容器孔位于海綿墊的右部和前部。

優(yōu)選地，每個容器孔旁標(biāo)有編號，其內(nèi)EP管和試劑瓶上標(biāo)有相同的編號。

優(yōu)選地，所述海綿墊為黑色海綿墊。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型具有如下有益效果：

①本實用新型包含寡核苷酸隨機引物，通過預(yù)先使用寡核苷酸隨機引物封閉磁珠，降低了磁珠與基因組RNA的非特異性結(jié)合。寡核苷酸隨機引物的大小為20bp以下，既能封閉磁珠增強實驗的特異性，又不會過大而影響探針與蛋 白的結(jié)合。

②本實用新型采用脫氧核糖核酸酶預(yù)處理蛋白樣品，采用未預(yù)處理的磁珠對蛋白樣品進行預(yù)洗滌，除去蛋白樣品內(nèi)的體內(nèi)DNA，防止其纏繞磁珠從而影響耦連在磁珠上的RNA探針與蛋白質(zhì)的結(jié)合。

③本實用新型中磁珠首先與探針孵育，去除多余探針后再與蛋白孵育，較傳統(tǒng)探針先與蛋白孵育再與磁珠孵育或探針、蛋白和珠子同時孵育極大的節(jié)約了磁珠的使用量，節(jié)約實驗成本。

附圖說明

圖1為實施例1中RNA pulldown試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為實施例2中RNA pulldown試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。

附圖標(biāo)記如下：

盒體1，海綿墊2，容器孔3，蓋子4，EP管5，試劑瓶6。

具體實施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實施例作進一步說明。

實施例1

一種RNA pulldown試劑盒，包含盒體1、蓋子4和位于盒體1內(nèi)的海綿墊2，所述蓋子4可開合的蓋在所述盒體1上，海綿墊2上開設(shè)有多個容器孔3，所述容器孔內(nèi)放置EP管5和試劑瓶6，容器孔的大小和其內(nèi)放置的EP管或試劑瓶的大小相匹配。

所述容器孔分為三組，第一組容器孔有2個，用于放置50mL試劑瓶，第二組容器孔有2個，用于放置4mL試劑瓶；第三組容器孔有12個，用于放置1mL的EP管。優(yōu)選地，第一組容器孔位于海綿墊的左部，第二組容器孔和第三組容器孔位于海綿墊的右部和前部。

所述試劑瓶包含TES溶液試劑瓶、NT2Buffer試劑瓶和RIP Buffer試劑瓶各一個，其中，所述TES溶液試劑瓶和NT2Buffer試劑瓶的容積均為50mL，所述RIP Buffer試劑瓶的容積為4mL。所述TES溶液為2×TES溶液，稀釋后 可作為1×TES溶液使用。

所述EP管包含RNA structure buffer管、Urea CHAPS Buffer管、protease inhibitor cocktail管、DTT溶液管、RNase inhibitor管、PMSF溶液管、鏈霉親和素標(biāo)記磁珠管、DNase管、DNase Buffer管、寡核苷酸隨機引物管和poly(dI·dC)管各一個，每個EP管的容積均為1mL。優(yōu)選地，所述寡核苷酸隨機引物的濃度為10-20μmol/L，所述DTT溶液的濃度為100mM，所述PMSF溶液的濃度為10mg/mL。

以lincRNA HOTAIR探針對LSD1蛋白的pulldown為例來說明本本實用新型試劑盒的使用方法。lincRNA HOTAIR探針經(jīng)過脫硫生物素8-oxoG標(biāo)記。探針的設(shè)計和標(biāo)記方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，在此不再贅述。鏈霉親和素偶聯(lián)在磁珠(BeaverBeads^TMStreptavidin，海貍生物科技有限公司)上，并和脫硫生物素親和結(jié)合；細(xì)胞全蛋白與磁珠-RNA 探針孵育，作用蛋白分子可以和探針特異性結(jié)合；經(jīng)過洗滌可以將非特異性結(jié)合蛋白分子去除；最后，再用洗脫液(針對鏈霉親和素)進行洗脫，得到目的探針-蛋白復(fù)合物，再經(jīng)過Western Blot鑒定蛋白質(zhì)類型。具體步驟如下：

S1、磁珠預(yù)處理

①取80μL含鏈霉親和素的磁珠置于無RNase EP管中，加入1mL 1×TES洗滌磁珠；

②置于磁力架上去除TES洗滌液，向磁珠加入1mL含0.5％BSA和10μmol/L寡核苷酸隨機引物的1×TES，室溫孵育30min后置于磁力架上去除TES溶液。所述寡核苷酸隨機引物為20bp以內(nèi)的DNA序列。

S2、制備探針-磁珠復(fù)合物

①將2-5μg大小300-1000bp的DNA探針用30μL DEPC水溶解，在90℃放置2min，立即置于冰上2min，加入50μL RNA structure buffer和20μL DEPC水，室溫放置20min制備得到二級結(jié)構(gòu)的RNA探針；

②將二級結(jié)構(gòu)的RNA探針加入預(yù)處理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃旋轉(zhuǎn)溫和混合30min，置于磁力架上去上清；

③加入0.35mL 1×TES，25℃溫和旋轉(zhuǎn)洗滌磁珠5min，置于磁力架上去除 洗滌液；

④重復(fù)步驟③一次。

S3、提取并預(yù)處理細(xì)胞全蛋白

S31、提取細(xì)胞全蛋白

①用PBS洗滌1.5×10⁷個Hela細(xì)胞一次；

加入975μL RIP Buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail和5μL DTT溶液，勻漿器勻漿15-20次；4℃、1500g離心15min，收集上清即為細(xì)胞全蛋白提取物；所述DTT溶液的濃度為100mM，所述PMSF溶液的濃度為10mg/mL；

S32、預(yù)處理細(xì)胞全蛋白

①向上述制備的細(xì)胞全蛋白提取物中加入10μL DNase、3.2μL DNase Buffer，室溫25℃溫和孵育1h；

②向蛋白樣品中加入40μL未預(yù)處理的磁珠，4℃溫和旋轉(zhuǎn)30min；

③磁力架上收集磁珠，將上清液預(yù)處理的細(xì)胞全蛋白轉(zhuǎn)移到新的EP管中。

S4、pulldown

①將制備的細(xì)胞全蛋白加入到探針-磁珠復(fù)合物中，并加入472.5μL NT2buffer、5μL RNase inhibitor、15μg poly(dI·dC)、5μL 0.5M EDTA和2.5μL 0.5M EGTA；

②室溫溫和旋轉(zhuǎn)孵育2h；

③磁力架上收集磁珠，去除上清液；

④加入974μL NT2buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail、5μL DTT溶液和1μL RNase inhibitor，洗滌磁珠，去除非特異性結(jié)合的蛋白，再重復(fù)洗滌四次，得到蛋白-探針-磁珠復(fù)合物；所述DTT溶液的濃度為100mM，所述PMSF溶液的濃度為10mg/mL；

S5、RNP收集

①向蛋白-探針-磁珠復(fù)合物中加入40μL Urea CHAPS buffer，4℃孵育5-10h。

②磁力架上收集磁珠，上清即為探針-蛋白復(fù)合物，將上清RNP轉(zhuǎn)移到新的EP管中。

③產(chǎn)物置于-80℃保存，供進一步Western Blot分析。

使用本實用新型試劑盒進行RNA pulldown實驗，靈敏度和特異性好，蛋白富集效率高，Western Blot的條帶拖尾現(xiàn)象更少，條帶更亮。

實施例2

本實施例與實施例1基本相同。為了簡便描述，僅就試劑盒的主要結(jié)構(gòu)及與實施例1不同之處進行說明。本實施例未說明之處，與實施例1相同。

一種RNA pulldown試劑盒，包含盒體1、蓋子4和位于盒體1內(nèi)的黑色海綿墊2，所述蓋子4可開合的蓋在所述盒體1上，海綿墊2上開設(shè)有多個容器孔3，所述容器孔內(nèi)放置EP管5和試劑瓶6，容器孔的大小和其內(nèi)放置的EP管或試劑瓶的大小相匹配。

所述試劑瓶包含TES溶液試劑瓶、NT2Buffer試劑瓶和RIP Buffer試劑瓶各一個，其中，所述TES溶液試劑瓶和NT2Buffer試劑瓶的容積均為50mL，所述RIP Buffer試劑瓶的容積為4mL。所述TES溶液為2×TES溶液，稀釋后可作為1×TES溶液使用。

所述EP管包含RNA structure buffer管、Urea CHAPS Buffer管、protease inhibitor cocktail管、DTT溶液管、RNase inhibitor管、PMSF溶液管、鏈霉親和素標(biāo)記磁珠管、DNase管、DNase Buffer管、寡核苷酸隨機引物管和poly(dI·dC)管各一個，每個EP管的容積均為1mL。優(yōu)選地，所述寡核苷酸隨機引物的濃度為10-20μmol/L，所述DTT溶液的濃度為100mM，所述PMSF溶液的濃度為10mg/mL。

每個容器孔旁標(biāo)有編號，其內(nèi)EP管上標(biāo)有相同的編號。通過編號的形式，可以直接根據(jù)編號確認(rèn)EP管和試劑瓶內(nèi)所裝成分，也可避免放錯位置，便于實驗操作。如TES溶液試劑瓶及其容器孔編號為01，NT2Buffer試劑瓶及其容器孔編號為02，RIP Buffer試劑瓶及其容器孔編號為03，RNA structure buffer管及其容器孔編號為04，Urea CHAPS Buffer管及其容器孔編號為05，protease inhibitor cocktail管及其容器孔編號為06，DTT溶液管及其容器孔編號為07，RNase inhibitor管及其容器孔編號為08，PMSF溶液管及其容器孔編號為09，鏈霉親和素標(biāo)記磁珠管及其容器孔編號為10，DNase管及其容器孔編號為11， DNase Buffer管及其容器孔編號為12，寡核苷酸隨機引物管及其容器孔編號為13，poly(dI·dC)管及其容器孔編號為14。

以上所述實施例僅表達了本實用新型的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本實用新型專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本實用新型構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本實用新型的保護范圍。因此，本實用新型專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。