本實(shí)用新型屬于核酸分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置。本實(shí)用新型實(shí)現(xiàn)了核酸檢測(cè)前處理全自動(dòng)，即自動(dòng)實(shí)現(xiàn)核酸提取、擴(kuò)增、純化等前處理，處理完畢樣本可經(jīng)外部配套測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，本實(shí)用新型簡(jiǎn)化了試驗(yàn)流程，減少了出錯(cuò)機(jī)會(huì)，提高了整體檢測(cè)的穩(wěn)定性。

背景技術(shù)：

高通量測(cè)序技術(shù)是最近十年開始發(fā)展的新型分子檢測(cè)技術(shù)。市場(chǎng)上主流的高通量測(cè)序儀主要由Illumina、ThermoFisher等提供，任何一種高通量測(cè)序平臺(tái)在進(jìn)行檢測(cè)前都會(huì)首先要求從生物樣本中抽提DNA或RNA，然后把待測(cè)DNA樣本構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，即在待測(cè)DNA兩端連接上測(cè)序儀通用的接頭DNA序列，在整個(gè)構(gòu)建文庫(kù)的過程中添加了不少工具酶和緩沖體系，不利于后期的反應(yīng)，所以需要進(jìn)行一次DNA純化操作去除各種酶和緩沖液，從而讓該待測(cè)片段DNA可以在測(cè)序儀不同的芯片上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。

常規(guī)的高通量測(cè)序檢測(cè)前處理包括核酸提取，文庫(kù)構(gòu)建、純化三個(gè)步驟。

核酸提取。核酸檢測(cè)首先要進(jìn)行樣本核酸提取。常見的方法有乙醇沉淀法、硅膠柱結(jié)合法、玻璃珠法、磁性顆粒結(jié)合分離法。所有方法的基本原理就是裂解樣本——結(jié)合——清洗——洗脫等四個(gè)步驟。單一樣本整個(gè)過程約需40分鐘。

文庫(kù)構(gòu)建。文庫(kù)構(gòu)建的基本概念是在待測(cè)DNA加上和后續(xù)測(cè)序儀器配套的DNA接頭?；玖鞒淌牵?. 末端補(bǔ)平；2. 堿基最后增加一個(gè)A； 3. 連接接頭；4. PCR擴(kuò)增。由于每一步都有獨(dú)立的酶和緩沖體系，所以在常規(guī)的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建過程中，每一次反應(yīng)中間都需要進(jìn)行基于硅膠柱或磁性顆粒的DNA純化。也就說常規(guī)的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建流程有：1. 末端補(bǔ)平；2. 純化；3.堿基最后增加一個(gè)A； 4. 純化；5. 連接接頭；6.純化； 7. PCR擴(kuò)增等7個(gè)步驟。

純化。文庫(kù)構(gòu)建過程中加入了各種工具酶，DNA溶液和磁性顆粒、硅膠膜、玻璃珠等介質(zhì)結(jié)合，清洗液清洗兩次去除各種雜質(zhì)，最終用洗脫液洗脫DNA。

自此完成一個(gè)從原始樣本到最終測(cè)序文庫(kù)的所有試驗(yàn)環(huán)節(jié)。整個(gè)試驗(yàn)流程需要5~8個(gè)小時(shí)，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)都需要標(biāo)記試管以免弄錯(cuò)樣本，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

針對(duì)上述的復(fù)雜試驗(yàn)步驟，市場(chǎng)上有一些儀器代替人工操作。由于高通量測(cè)序?yàn)槟壳笆袌?chǎng)上全新的技術(shù)，有針對(duì)每個(gè)步驟的單一設(shè)備，比如核酸提取可以有多種類型的核酸提取儀，文庫(kù)構(gòu)建可以通過自動(dòng)移液工作站完成，文庫(kù)的純化可以由手工完成，也可以通過自動(dòng)移液工作站完成。核酸提取儀，一次可實(shí)現(xiàn)12-96個(gè)不等的核酸提取。操作者需要把樣本放入儀器中，40分鐘后，取出提取完的樣本，標(biāo)記后以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。核酸前處理，反應(yīng)配置、溫控、混勻可由移液工作站實(shí)現(xiàn)，開始前操作者把需要的配套試劑放置在工作站臺(tái)面上，設(shè)置好程序，標(biāo)記好投入產(chǎn)出的試驗(yàn)管位置，開始運(yùn)行。由于移液工作站為開放平臺(tái)，在整個(gè)多步試驗(yàn)操作過程中，操作者需要不定期進(jìn)行96孔板封膜、開膜，或者不定期進(jìn)行大量的管蓋開閉工作，雖然一部分工作由工作站來完成，但整體仍然需要人工大量介入，無法實(shí)現(xiàn)整個(gè)過程的無人值守，多個(gè)步驟需要人工來標(biāo)記、排序、設(shè)置。同時(shí)由于試驗(yàn)一旦開始，無法再臨時(shí)增加或改變?cè)囼?yàn)流程，一旦臨時(shí)有樣本需要處理，或者改變?cè)囼?yàn)流程，將對(duì)整體參與試驗(yàn)的樣本產(chǎn)生影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本實(shí)用新型的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置，可實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)前處理的全自動(dòng)，包括提取、文庫(kù)構(gòu)建、產(chǎn)物純化，最終產(chǎn)物可直接用于高通量測(cè)序，全程無人值守。

一種核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置，其特征在于，包括

用于放置樣本和前處理試劑的試劑盤；

用于放置試劑盤的底座，底座上設(shè)有溫控模塊和混勻模塊；

用于實(shí)現(xiàn)磁性顆粒分離、清洗和洗脫的磁力分選模塊；

用于轉(zhuǎn)移試劑盤內(nèi)試劑的移液裝置，移液裝置設(shè)有移液模塊和移液槍頭；

用于支撐移液裝置的移動(dòng)導(dǎo)軌平臺(tái)；和

用于控制溫控模塊、旋轉(zhuǎn)模塊、混勻模塊、磁力分選模塊和移液模塊運(yùn)行的主機(jī)。

本實(shí)用新型的核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置，在一個(gè)獨(dú)立試劑盤內(nèi)全自動(dòng)運(yùn)行核酸提取、建庫(kù)、純化等處理，每臺(tái)裝置作為一個(gè)單元獨(dú)立封閉運(yùn)行，可通過串聯(lián)方式無限擴(kuò)展數(shù)量，實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)。

進(jìn)一步地，鋁箔封膜上設(shè)置管道支架，管道支架和蓋板之間設(shè)有硅膠層。在進(jìn)行核酸檢測(cè)自動(dòng)化前處理的時(shí)候，先移除試劑盤的蓋板，裝置的移液裝置（例如移液槍頭）可直接戳破硅膠和鋁箔封膜，進(jìn)入腔室進(jìn)行移液操作，操作結(jié)束后，移液裝置退出鋁箔和硅膠。鋁箔封膜會(huì)留有穿透孔，而硅膠回彈后，使試劑孔仍然處于密封狀態(tài)，試劑孔內(nèi)試劑不會(huì)揮發(fā)影響整體試驗(yàn)。

所述試劑盤為圓形、方形或長(zhǎng)方形，也可以是其他不規(guī)則形狀。試劑孔可根據(jù)試劑盤的形狀作優(yōu)化排布。多孔試劑盤優(yōu)選采用一次性獨(dú)立試劑盤，待檢測(cè)樣本加入試劑盤后在該試劑盤內(nèi)完成從初始樣本、核酸提取、核酸檢測(cè)前處理的全部流程。

所述核酸測(cè)序前處理試劑包括核酸提取試劑、文庫(kù)構(gòu)建試劑和DNA純化試劑，包括但不限于核酸末端補(bǔ)平、加A、連接、純化等步驟試劑。

所述試劑孔包括裂解孔、磁珠孔、提取孔、文庫(kù)構(gòu)建孔、PCR反應(yīng)孔、純化孔、最終樣本孔和廢液孔。

所述底座上設(shè)有旋轉(zhuǎn)模塊。試劑盤可通過底座上的旋轉(zhuǎn)模塊進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)、移動(dòng)。

所述移液模塊包括移液泵。

所述磁力分選模塊包括設(shè)于底座和試劑盤旁邊的活動(dòng)磁鐵。

本實(shí)用新型裝置具有溫控模塊、移液模塊、混勻模塊和磁力分選模塊，可實(shí)現(xiàn)溫控、移液、混勻、磁力分選功能。混勻模塊使裝置內(nèi)部可實(shí)現(xiàn)水平渦旋、上下垂直混勻樣本。溫控模塊可以在一個(gè)或多個(gè)步驟，對(duì)試劑盤內(nèi)試劑進(jìn)行加熱、低溫、升變溫處理。移液模塊看實(shí)現(xiàn)在試劑盤不同試劑孔之間液體的轉(zhuǎn)移，可由儀器內(nèi)置或試劑盤內(nèi)含一個(gè)或多個(gè)移液槍頭實(shí)現(xiàn)。磁力分選模塊可通過設(shè)置電磁鐵或永磁鐵實(shí)現(xiàn)磁性顆粒分離、清洗、洗脫。

在一個(gè)具體實(shí)施中，核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置采用一次性丟棄的試劑盤，試劑盤內(nèi)含有提取試劑、文庫(kù)構(gòu)建試劑、DNA純化試劑。樣本加入試劑盤樣本孔以后，儀器內(nèi)部移液加入裂解液；利用儀器進(jìn)行混勻10分鐘；移液加入結(jié)合液和磁珠，混勻10分鐘；利用磁力分選模塊吸附磁珠，移液模塊去除上清，加入500ul清洗液，混勻磁珠2分鐘，磁力分選去除清洗液，重復(fù)三次；加入30ul 洗脫液和磁珠混合，60度加熱5分鐘；移液模塊移液上清去文庫(kù)構(gòu)建孔；移液加入末端補(bǔ)平酶，37度30分鐘，75度滅活20分鐘；移液加入DNA接頭，DNA連接酶，20度30分鐘，75度20分鐘滅活；移液去純化孔，加入磁珠和純化結(jié)合液，混勻10分鐘；加磁力分選，去除上清，500ul清洗液清洗兩次磁珠；50ul 洗脫液加入磁珠，60度加熱5分鐘，移液DNA到最終樣本室，樣本核酸前處理結(jié)束。

本實(shí)用新型實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)封閉的獨(dú)立試劑盤，全自動(dòng)無人值守的核酸檢測(cè)前處理的自動(dòng)化，操作者把樣本放入試劑盤后就可讓儀器自動(dòng)運(yùn)行，產(chǎn)物可直接用于后期測(cè)序分析。大大簡(jiǎn)化了試驗(yàn)流程，避免了常規(guī)手工操作的繁瑣，也避免了利用核酸提取儀、移液工作站等儀器配套使用時(shí)候，需要多次標(biāo)記試管，人工來移動(dòng)試管等環(huán)節(jié)，從試驗(yàn)流程上杜絕了樣本混淆的可能。

本實(shí)用新型的核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）全自動(dòng)。儀器全自動(dòng)實(shí)現(xiàn)了核酸檢測(cè)前處理全自動(dòng)，包括核酸提取、末端補(bǔ)平、加A、連接接頭、產(chǎn)物純化等步驟。全自動(dòng)無人值守，整個(gè)過程手工操作不超過5分鐘，把樣本放入試劑盤，試劑盤放入儀器內(nèi)即可全自動(dòng)運(yùn)行。

（2）封閉。試劑盤在一個(gè)封閉體系內(nèi)運(yùn)行，保證了樣本不會(huì)混淆，也保證了樣本之間不會(huì)互相污染。

（3）快速。由于通過儀器實(shí)現(xiàn)的不同試驗(yàn)步驟之間的直接連接，減少了多個(gè)環(huán)節(jié)需要的樣本標(biāo)記工作，大大加快了整體試驗(yàn)速度。

（4）可編程。由于儀器具有混勻、移液、溫控、磁力分選等模塊，因此設(shè)備可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行再次開發(fā)，擴(kuò)展性大。

（5）通量高。儀器為單一樣本一個(gè)操作單元，但可通過串聯(lián)形式無限放大，從而靈活實(shí)現(xiàn)高通量操作。

附圖說明

圖1是核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是試劑盤示意圖。

圖3是試劑盤局部剖視圖。

圖4是多個(gè)核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置實(shí)現(xiàn)串聯(lián)擴(kuò)展示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

如圖1所示的核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置，由移動(dòng)導(dǎo)軌平臺(tái)1、底座2、活動(dòng)磁鐵3、移液泵4和移液槍頭5構(gòu)成。移液槍頭5設(shè)于移液泵4上，移液泵可沿移動(dòng)導(dǎo)軌平臺(tái)1移動(dòng)，并通過旋轉(zhuǎn)模塊轉(zhuǎn)動(dòng)。移動(dòng)導(dǎo)軌平臺(tái)1通過移液泵和移液槍頭在試劑盤上部移動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)移液。底座2對(duì)應(yīng)試劑盤位置具有溫控模塊。底座2和試劑盤貼合，提供溫度控制。試劑盤可通過底座2上的旋轉(zhuǎn)模塊進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)、移動(dòng)。

如圖2-3所示的試劑盤，包括蓋板6和試劑托盤7，試劑托盤7上設(shè)有若干試劑孔8，試劑孔8內(nèi)分裝有核酸測(cè)序前處理試劑，試劑孔開口處設(shè)置鋁箔封膜9。鋁箔封膜9上設(shè)置管道支架10，管道支架和蓋板之間設(shè)有硅膠層11。試劑孔包括：1’—裂解孔（6M 鹽酸胍、20%異丙醇）； 2’—磁珠孔（40ul 硅烷化磁珠）； 3’—清洗液（80% 乙醇）； 4’—結(jié)合液（60% 異丙醇）； 5’—洗脫液（純水 pH8.0）； 6’—提取孔； 7’—文庫(kù)構(gòu)建孔； 8’—末端補(bǔ)平酶混合孔（Klenow DNA聚合酶I，T4多聚核苷酸激酶）； 9’—連接反應(yīng)混合孔（T4 DNA連接酶）； 10’—純化孔（40ul 硅烷化磁珠）； 11’—預(yù)留孔； 12’—最終樣本孔； 13’—廢液孔； 14’—預(yù)留孔； 15’—預(yù)留孔。

如圖4所示是4個(gè)核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置串聯(lián)示意圖，可根據(jù)需要任意串聯(lián)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)。

實(shí)施例2

血漿游離DNA為小片段、碎片化DNA，片段長(zhǎng)度100~300bp之間，峰值在160bp左右。1997年，盧煜明教授發(fā)現(xiàn)在孕婦外周血漿中含有胎兒的游離DNA，從而開創(chuàng)以游離DNA為檢測(cè)來源，分析孕婦所懷胎兒是否有染色體異常。血漿中也存在來源于腫瘤細(xì)胞的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA），ctDNA被廣泛用來做腫瘤液態(tài)活檢，可以無創(chuàng)傷性的早期診斷、伴隨診斷、預(yù)后隨訪等。

常規(guī)的檢測(cè)方法是首先由臨床樣本包括血漿中抽提DNA，進(jìn)行核酸檢測(cè)處理、檢測(cè)三個(gè)步驟。完成整個(gè)樣本檢測(cè)需要6~13個(gè)小時(shí)。其中樣本核酸提取和檢測(cè)前處理環(huán)節(jié)工作繁瑣。

采用本實(shí)用新型的核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置可實(shí)現(xiàn)在一個(gè)封閉的獨(dú)立試劑盤，全自動(dòng)無人值守的核酸檢測(cè)前處理的自動(dòng)化，操作者把樣本放入試劑盤后就可讓儀器自動(dòng)運(yùn)行，產(chǎn)物可直接用于后期測(cè)序分析。具體操作方法如下：

600ul血漿樣本，放入核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置進(jìn)行全自動(dòng)高通量文庫(kù)構(gòu)建。

1.600ul血漿加入試劑盤裂解孔，裂解孔含有1.2ml血漿裂解液（6M鹽酸胍、20%異丙醇）；

2.混勻模塊進(jìn)行混勻5分鐘，移液模塊，依次移液600ul至提取孔和磁珠（40ul 硅烷化磁珠）結(jié)合；

3.活動(dòng)磁鐵實(shí)現(xiàn)磁力分選，上清移至廢液孔；

4.500ul清洗液（80%乙醇）清洗磁珠三次，上清移至廢液孔；

5.60ul洗脫液移至提取孔，56度10分鐘洗脫DNA；

6.DNA移至建庫(kù)孔，加入補(bǔ)平酶（DNA聚合酶I、T4多聚核苷酸激酶）混合10ul；

7.37度30分鐘，75度20分鐘滅活；

8.加入DNA接頭5ul，加入DNA連接酶（T4核苷酸連接酶）混合物20ul；

9.16度20分鐘，75度20分鐘滅活；

10.移液模塊，移取所有的產(chǎn)物至純化試劑孔，純化孔含有純化反應(yīng)所需要的磁珠；

11.利用移液模塊上下混勻樣本和磁珠，靜置5分鐘，上活動(dòng)磁鐵靜置5分鐘，移液模塊移上清至廢液孔；

12.500ul清洗液清洗磁珠兩次，上活動(dòng)磁鐵，上清移至廢液孔；

13.40ul洗脫液去純化孔，洗脫DNA，利用移液模塊移液至最終樣本孔；

14.產(chǎn)物可直接用于后續(xù)的高通量測(cè)序檢測(cè)。

實(shí)施例3

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究對(duì)象為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括 mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)，通過新一代高通量測(cè)序，能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。

常規(guī)的檢測(cè)方法是首先由臨床樣本包括全血、血漿中抽提RNA，進(jìn)行核酸檢測(cè)處理、檢測(cè)三個(gè)步驟。完成整個(gè)樣本檢測(cè)需要6~30個(gè)小時(shí)。其中樣本核酸提取和檢測(cè)前處理環(huán)節(jié)工作繁瑣。

采用本實(shí)用新型的核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置可實(shí)現(xiàn)在一個(gè)封閉的獨(dú)立試劑盤，全自動(dòng)無人值守的核酸檢測(cè)前處理的自動(dòng)化，操作者把樣本放入試劑盤后就可讓儀器自動(dòng)運(yùn)行，產(chǎn)物可直接用于后期測(cè)序分析。具體操作方法如下：

200ul全血樣本，放入核酸檢測(cè)前處理自動(dòng)化裝置實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)全自動(dòng)處理。

1.200ul樣本加入試劑盤樣本孔以后，移液加入300ul裂解液；

2.混勻模塊進(jìn)行混勻10分鐘；

3.移液加入200ul結(jié)合液和10ul磁珠，混勻10分鐘；

4.利用磁力分選模塊吸附磁珠，移液模塊去除上清；

5.加入500ul清洗液，混勻磁珠2分鐘，磁力分選去除清洗液，重復(fù)三次；

6.加入30ul洗脫液和磁珠混合，60度加熱5分鐘；

7.移液模塊移液上清至提取孔；

8.提取孔含有30ul oligo dT的磁珠，65度30分鐘；

9.磁力分選，去除上清，500ul清洗液清洗，磁力分選去除上清；

10.30ul洗脫液加入提取孔，60度加熱5分鐘，移液上清cDNA去文庫(kù)構(gòu)建孔；

11.移液加入末端補(bǔ)平酶和dATP，37度30分鐘，65度滅火5分鐘；

12.移液加入DNA接頭，連接酶，20度30分鐘，65度5分鐘滅活；

13.加入10ul磁珠和200ul純化結(jié)合液，混勻10分鐘；

14.加磁力分選，去除上清，500ul清洗液清洗兩次磁珠；

15.50ul洗脫液加入磁珠，60度加熱5分鐘；

16.移液DNA到最終樣本孔，本自動(dòng)化處理裝置試驗(yàn)結(jié)束；

17.最終DNA可以直接用于后續(xù)高通量測(cè)序檢測(cè)。