本發(fā)明涉及流式細胞監(jiān)測裝置技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種流式細胞儀的流動室、組件及其三維視頻監(jiān)測裝置。

背景技術(shù)：

流式細胞儀(Flow Cytometer，簡稱FCM)是現(xiàn)在顯微鏡技術(shù)、化學(xué)熒光染色、電子學(xué)技術(shù)和計算機等領(lǐng)域的綜合進步的結(jié)合下得以發(fā)展起來的對于快速直線流動中的單細胞的特性及其成分，或其他各種微小顆粒(如細菌)及其負載物進行多參數(shù)分析和分選的高新儀器，它不僅可測量細胞大小、內(nèi)部顆粒的形狀，還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內(nèi)DNA以及RNA含量等，可對群體細胞在單細胞水平上進行分析。商業(yè)流式細胞儀主要包括光學(xué)系統(tǒng)、電子檢測系統(tǒng)與流動室。

其中流動室是整個儀器最核心的檢測載體，一般為方形或者圓形的長而直的毛細管道。在該管道中，所有被檢測的顆粒及其所在樣品液，均要在二維流體聚焦力(hydrodynamic focusing)的作用下，緊密的束縛在管道中間形成單個顆粒依次通過的柱狀超細層流，其截面直徑或長(寬)通常在10μm左右。細胞、微球等顆粒因此與樣品液一同被束縛在該柱狀流中，并被激光器(其光斑大小通常為20μm-80μm)在固定的位置所激發(fā)，進而被散射光和熒光檢測系統(tǒng)所檢測和識別。

由于二維流體聚焦所形成的柱狀樣品流很細小，常規(guī)機械加工與制備工藝會引入一定的誤差(>50μm)，這些誤差導(dǎo)致不同批次生產(chǎn)、不同人員安裝出來的流動室中聚焦樣品流的位置、穩(wěn)定程度存在一致性差異，并無法在毛細管道內(nèi)呈現(xiàn)均勻、清晰的流體分布，為儀器其他系統(tǒng)的裝配與調(diào)試過程提出了一定的考驗。當(dāng)前圖像采集裝置為單軸，并導(dǎo)致監(jiān)測信息利用不充分，且識別效果差等技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明目的在于提供一種流式細胞儀的流動室、組件及其三維視頻監(jiān)測裝置，解決現(xiàn)有技術(shù)其流動室樣品流存在不穩(wěn)定聚焦并無法在毛細管道內(nèi)呈現(xiàn)均勻、清晰的流體分布，其圖像采集裝置為單軸無法提供柱狀流的三維空間位置等技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一套雙軸正交的視頻監(jiān)測系統(tǒng)，從兩個空間方向上對樣品流聚焦情況進行拍攝，并通過軟件自動判斷其相對位置、寬度和長期穩(wěn)定性，本文也提出了一套相應(yīng)的流動室聚焦效果的測試與調(diào)試方法，以達到所有流動室中樣品流均穩(wěn)定地聚焦在毛細管道軸心的目的。

為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種用于流式細胞儀的流動室，包括毛細管道和具有倒錐體結(jié)構(gòu)的聚焦腔室，聚焦腔室的錐部連接毛細管道，連接處作為樣品液的毛細管道注入口；所述聚焦腔室還通有鞘液，鞘液通過所述聚焦腔室的內(nèi)壁在所述毛細管道注入口處與樣品液聚焦、包裹形成柱狀流。

上述方案中，所述聚焦腔室的側(cè)部或頂部平面設(shè)置有鞘液導(dǎo)入口和樣品液導(dǎo)入口。

上述方案中，所述鞘液導(dǎo)入口,其數(shù)量至少包括兩個；所述樣品液導(dǎo)入口，設(shè)置在聚焦腔室的倒錐體中軸線上，并設(shè)置一位置可調(diào)整的樣品針通過所述樣品液導(dǎo)入口導(dǎo)入所述樣品液。

一種用于流式細胞儀的監(jiān)測裝置，包括

毛細管道，通有一包含樣品液的柱狀流；

第一光源，照射毛細管道，并致使柱狀流散射光線；

第一圖像采集裝置，接收毛細管道內(nèi)柱狀流的后向散射光或側(cè)向散射光；

第二圖像采集裝置，對應(yīng)第一圖像采集裝置所接收的后向散射光或側(cè)向散射光，接收剩余的側(cè)向散射光或后向散射光。

上述方案中，所述的第二圖像采集裝置，或者接收前向散射光。

上述方案中，還包括第二光源，與所述的第一光源、第一圖像采集裝置和第二圖像采集裝置在相對于毛細管道內(nèi)柱狀流流向所垂直的平面上對應(yīng)光發(fā)射所致散射和散射光接收關(guān)系異面地或共面地呈十字形安裝結(jié)構(gòu)或X字母形安裝結(jié)構(gòu)，十字形安裝結(jié)構(gòu)或X字母形安裝結(jié)構(gòu)的中心在毛細管道中軸線上。

上述方案中，所述第二光源，通過第一光源反射、折射或分束設(shè)置得到，或者選用互補頻譜或有重疊頻譜的光源。

一種流式細胞儀組件，包括

流動室，包括毛細管道和具有倒錐體結(jié)構(gòu)的聚焦腔室，向其導(dǎo)入樣品液和至少兩處導(dǎo)入鞘液并通過聚焦腔室內(nèi)壁將鞘液在毛細管道注入口處與樣品液聚焦、包裹形成柱狀流；

監(jiān)測裝置，包括第一光源、第二光源、第一圖像采集裝置和第二圖像采集裝置；

所述的第一光源、第二光源、第一圖像采集裝置和第二圖像采集裝置，在相對于毛細管道內(nèi)柱狀流流向所垂直的平面上對應(yīng)光發(fā)射所致毛細管道散射和散射光接收的位置關(guān)系異面地或共面地呈十字形安裝結(jié)構(gòu)或X字母形安裝結(jié)構(gòu)，十字形安裝結(jié)構(gòu)或X字母形安裝結(jié)構(gòu)的中心在毛細管道中軸線上。

上述方案中，所述的毛細管道選用高透明、無自發(fā)熒光、耐酸堿的材料；所述毛細管道的形狀為筆直長管道，其內(nèi)截面為方形或者長方形，外截面對應(yīng)內(nèi)截面為方形或者長方形。

上述方案中，所述的第一圖像采集裝置和第二圖像采集裝置，均包括拍攝相機、與拍攝相機匹配的收集鏡頭，拍攝相機裝配收集鏡頭并分別安裝于一個三維調(diào)整架；所述的第一光源與第一圖像采集裝置對準并構(gòu)成第一軸監(jiān)測結(jié)構(gòu)，所述的第二光源與第二圖像采集裝置對準并構(gòu)成第二軸監(jiān)測結(jié)構(gòu)，第一軸監(jiān)測結(jié)構(gòu)和第二軸監(jiān)測結(jié)構(gòu)的中軸位置關(guān)系為正交。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

1.兩個鞘液從腔室頂部或者側(cè)壁直接導(dǎo)入，在樣品針周圍形成環(huán)繞，并在出射的樣品流周圍形成二維流體聚焦動力，在聚焦腔室錐部壁內(nèi)，像劍鞘一樣將其樣品流包裹成柱狀流，柱狀流平滑進入毛細管管道，并保持其原有的聚焦結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了毛線管道內(nèi)穩(wěn)定的細胞流體并且在沿毛線管道內(nèi)柱狀流流向的縱向截面上形成了清晰、容易區(qū)分的鞘流-樣品流-鞘流的流體分布；

2.每組光源和聚光鏡、收集鏡頭和拍攝相機共軸相對放置，光源和聚光鏡發(fā)出的光源穿過毛細管，照亮其核心區(qū)域，并穿過收集鏡頭匯聚到拍攝相機成像面，兩組照明和拍攝系統(tǒng)高度處于同一水平面上，并以90°正交的方式占據(jù)四個方位，形成對毛細管道的雙視角立體觀察；

3.本發(fā)明通過雙視角立體監(jiān)測結(jié)構(gòu)，還能實現(xiàn)檢測效果互相補償，90°正交位置關(guān)系的監(jiān)測結(jié)構(gòu)能恰好互相符合側(cè)向散射接收要求，即第一光源對毛細管道的后向散射由第一圖像采集裝置接收并且其側(cè)向散射將補償?shù)诙D像采集裝置的采集結(jié)果，第二光源對毛細管道的后向散射由第二圖像采集裝置接收并且其側(cè)向散射將補償?shù)谝粓D像采集裝置的采集結(jié)果，巧妙地實現(xiàn)了額外的效果增強；

4.本發(fā)明在安裝時可以反饋地為對準位置作出微小調(diào)整以確保實現(xiàn)雙向偏心距最小，即保持流動室安裝后各樣品流位置的一致性，對毛細管道中聚焦所成一條圓柱狀的液流柱寬度、相對位置的進行了自動檢測，也能對流動室二維流體動力聚焦效果作出判斷、監(jiān)測評價，提高生產(chǎn)流動室的良品率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的流式細胞儀示意圖，1為流動室的聚焦腔室，2L、2R為位于聚焦腔室側(cè)面的鞘液導(dǎo)入口，3為樣品液導(dǎo)入口，4為毛細管道；

圖2為本發(fā)明(左)流動室安裝關(guān)系、(中)聚焦樣品流與毛細管道的位置關(guān)系、(右)毛細管道橫截面的示意圖；

圖3為本發(fā)明三維視頻監(jiān)測結(jié)構(gòu)俯視圖；

圖4為本發(fā)明三維視頻監(jiān)測軟件分析系統(tǒng)示例圖，(左上)為第一圖像采集裝置所得圖像的識別結(jié)果、(右上)為第二圖像采集裝置所得圖像的識別結(jié)果、 (左下)為聚焦空間位置的識別結(jié)果、(右下)為各參數(shù)計算數(shù)值；

圖5為本發(fā)明視頻分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計示例圖；

圖6為流動室安裝調(diào)配流程圖。

具體實施方式

本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步說明：

實施例

本發(fā)明提供了一種用于流動室裝配的三維視頻監(jiān)測裝置及其識別方法，可完成對毛細管道中聚焦成一條圓柱狀的液流柱寬度、相對位置的自動檢測，該裝置主要用于流式細胞儀核心組件，即流動室的二維流體動力聚焦效果的判斷、監(jiān)測評價，并為其安裝時位置的微小調(diào)整提供參考依據(jù)。

整個監(jiān)測系統(tǒng)包括兩套光源、聚焦鏡、收集鏡頭、拍攝相機和三維調(diào)整架，其中光源和聚光鏡組合配套使用，用于形成直徑略大于毛細管道外徑的準直光斑，并照亮其管道中央部分；收集鏡頭和拍攝相機配套使用，用于對毛細管的管道中的液流情況進行成像記錄，其視場略大于毛細管道的內(nèi)徑；收集鏡頭和拍攝相機擰緊裝配后安裝在三維調(diào)整架上，用于視頻檢測的空間位置調(diào)整。

如圖3，每組光源和聚光鏡、收集鏡頭和拍攝相機共軸相對放置，光源和聚光鏡發(fā)出的光源穿過毛細管，照亮其核心區(qū)域，并穿過收集鏡頭匯聚到拍攝相機成像面。兩組照明和拍攝系統(tǒng)高度處于同一水平面上，并以90°正交的方式占據(jù)四個方位，形成對毛細管道的雙視角立體觀察。三維調(diào)整架用于實施照明光路和收集光路的對準，并提供上下調(diào)節(jié)的自由度，用于實現(xiàn)對毛細管道不同高度位置的追蹤監(jiān)測。

如圖2，本發(fā)明中核心觀察與檢測對象為毛細管內(nèi)管道及其流體，更具體為在毛細管道中聚焦成一條細柱狀流的樣品流，以及其相對于毛細管道內(nèi)壁的空間位置。該毛細管道優(yōu)先由玻璃、石英等高透明、無自發(fā)熒光、耐酸耐堿等材料構(gòu)成，毛細管道為筆直長管道，其內(nèi)截面可以為方形或者長方形，外截面可以為相應(yīng)的方形或者長方形。

如圖1，該毛細管道入口安裝到聚焦腔室出口上，上下整體構(gòu)成流動室。聚焦腔室為倒錐體結(jié)構(gòu)，除了在錐頂?shù)脑摮隹谕?，在頂部平面還有三個入口，包括兩個鞘液入口、一個樣品液入口。其中樣品液由樣品針導(dǎo)入，其針尖伸出延長到聚焦腔室中間位置，該樣品針應(yīng)位于聚焦腔室的軸心。兩個鞘液從腔室頂部平面或者側(cè)壁直接導(dǎo)入，在樣品針周圍形成環(huán)繞，并在出射的樣品流周圍形成二維流體聚焦動力。在聚焦腔室錐部出口，像劍鞘一樣將其樣品流包裹成柱狀流。最后，這些流體平滑進入毛細管管道，并保持其原有的聚焦結(jié)構(gòu)。

在所述特征中，樣品柱狀流相對毛細管道壁的位置，取決于樣品針的安裝角度和位置，本視頻監(jiān)測的結(jié)果可為其微小調(diào)整提供依據(jù)。

所述視頻監(jiān)測是指雙軸相機拍攝到毛細管管道內(nèi)流體的狀態(tài)，并由軟件識別系統(tǒng)自動識別出對應(yīng)信息，實時定量給出判讀結(jié)果、并記錄的過程。對每一套成像系統(tǒng)而言，所述軟件識別包括：成像質(zhì)量是否清晰，毛細管管道是否在視頻中，毛細管內(nèi)壁左右邊界的識別，樣品流左右邊界的識別。通過這四條邊界的識別和位置記錄，可計算得到樣品流寬度、聚焦液流柱的中心位置距離毛細管左右內(nèi)壁的距離，樣品流中心線和毛細管內(nèi)壁中心的偏心距等信息。將正交的雙視頻匯總，得到橫向多參數(shù)，側(cè)向多參數(shù)的信息，畫出聚焦樣品流在毛細管道橫截面上的二維坐標測繪圖，如圖4所示。用于評價流動室的工作狀態(tài)是否正常，并通過調(diào)整樣品針的位置，得到雙向偏心距最小的目的。

這些數(shù)據(jù)還可進行最大值、最小值、平均值、標準偏差，變異系數(shù)等單參數(shù)的統(tǒng)計學(xué)分析，也可以進行前向與側(cè)向比例的關(guān)聯(lián)性分析。通過該視頻監(jiān)測裝置，還可長時間記錄流動聚焦的相對位置、寬度等參數(shù)信息，進行鞘流穩(wěn)定時間、寬度變化幅度、位置變化幅度等指標的評價，如圖5所示。對各個裝配好的流式室進行穩(wěn)定性評價，幫助提高出廠產(chǎn)品的良品率。

所示特征中，收集鏡頭，包括多個凸透鏡，且用于將毛細管內(nèi)壁邊緣和內(nèi)壁中運動流體在產(chǎn)生的像放大為適合拍攝相機感光面大小的實像。所述收集鏡頭包括可以包括第一凸鏡、第二凸鏡和第三凸鏡，第二凸鏡位于第一凸鏡和第三凸鏡之間，所述凸鏡可以為石英玻璃。

本發(fā)明所述的，收集鏡頭及相機調(diào)整架具備三維調(diào)整自由度，首先可分別在水平面二維調(diào)整以使得照明和成像部分共軸，其次還可同時在高度方向上進行調(diào)整，對毛細管道不同高度進行檢測，得到不同高度位置處的二維信息測繪圖。

本發(fā)明所述的，流動室還可繞毛細管軸心進行轉(zhuǎn)動，對不同視角情況下樣品流聚焦特性的檢測。在每個角度下由正交雙檢測系統(tǒng)記錄兩組數(shù)值，通過180°旋轉(zhuǎn)加自動識別描繪，可以得到樣品流360°度的真實聚焦情況。

具體實施方式中，毛細管可采用內(nèi)徑200μm外徑8mm的方形石英玻璃，視頻采集相機可采用640*480像素的1/2英寸的CCD相機，收集鏡頭可采用17X 長焦鏡頭，整體的空間分辨率為0.925μm，采集頻率為60fps。

一種實施例中，流動室的裝配流程可以如下：

S1：對流動室部件進行預(yù)裝配，并連接上外部管路，用0.1M氫氧化鈉溶液、清洗液交替清洗兩次流動室，去除殘留雜質(zhì)；

S2：鞘液管道通入鞘液，樣品管道通入校準溶液，在測試進樣比例下，形成柱狀鞘流。在本三維監(jiān)測系統(tǒng)上進行分析；

S3：由視頻軟件分析，得到樣品流在前向與側(cè)向的偏心距；對進樣針兩軸位置進行微調(diào)，直至兩個方向偏心距為零；

S4：分析樣品流，得到前向與側(cè)向的寬度，并與標準值比對；長期連續(xù)監(jiān)測樣品流的寬度與偏心距信息，得到穩(wěn)定性評價；

所述校準溶液可以為各類高吸光、有色溶液，包含但不限于甲基藍、亞甲基藍、洋紅、羅丹明、結(jié)晶紫等溶液。

另外，需要說明的是，光源、聚焦鏡、收集鏡頭及相機的參數(shù)比較靈活，本領(lǐng)域人員可以根據(jù)實際選定，非本發(fā)明的關(guān)鍵參數(shù)。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何屬于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。