相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考

本申請(qǐng)要求于2015年1月23日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/107,131的優(yōu)先權(quán)，其通過引用納入本文用于所有目的。

發(fā)明背景

印跡是用于將大分子從電泳基質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜進(jìn)行進(jìn)一步分析的過程。southern印跡用于dna分析，northern印跡用于rna分析，并且western印跡用于蛋白質(zhì)分析。

在western印跡(或免疫印跡)中，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)分離樣品中的蛋白質(zhì)，然后通過毛細(xì)管作用或電印跡轉(zhuǎn)移到膜(例如，硝酸纖維素或聚偏乙烯)上。蛋白質(zhì)固定在膜的表面之后，使蛋白質(zhì)與特異性結(jié)合靶蛋白質(zhì)的一抗接觸。然后，例如，通過使一抗與偶聯(lián)到可檢測標(biāo)記(如熒光標(biāo)記)的二抗接觸來檢測結(jié)合的一抗。然后通過光學(xué)技術(shù)(即，測量發(fā)射光的技術(shù))使可檢測標(biāo)記物顯像。

雖然免疫印跡提供了有用的信息，但是該技術(shù)是耗時(shí)的、需要高水平的技術(shù)技能，是試劑密集型，通量有限，并且不太適用于多重化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文公開了免疫印跡系統(tǒng)和使用這種系統(tǒng)的方法。

在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫印跡的方法包括將抗體溶液施加到具有轉(zhuǎn)移到其上的光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)和靶蛋白質(zhì)的膜的表面，其中抗體溶液的施加由從光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)發(fā)射的信號(hào)引導(dǎo)；并檢測靶蛋白質(zhì)。

在一些實(shí)施方式中，該方法還包括洗滌步驟，其中未結(jié)合的材料從膜上除去。在一些實(shí)施方式中，抗體溶液施加步驟與洗滌步驟同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，將抗體溶液的微流體或亞微流體體積分配到膜的表面上?？贵w溶液的施加可以用選自下組的技術(shù)進(jìn)行：流體動(dòng)力學(xué)流動(dòng)約束(hydrodynamicflowconfinement)，噴墨印刷，噴霧沉積，微點(diǎn)滴定和微接觸印刷。在一些實(shí)施方式中，用微流體探針分配抗體溶液。在一個(gè)實(shí)施方式中，微流體探針具有多個(gè)微通道。在另一個(gè)實(shí)施方式中，微流體探針是探針陣列。

在一些實(shí)施方式中，將抗體溶液分配在膜表面上的至少一個(gè)離散路徑(discreetpath)中。在一個(gè)實(shí)施方式中，路徑跨越一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)條帶的泳道的長度。在一些實(shí)施方式中，路徑為25納米至500微米寬。在某些實(shí)施方式中，將抗體溶液分配到至少一個(gè)離散斑點(diǎn)(discreetspot)中。在一些實(shí)施方式中，施加抗體溶液步驟包括分配一抗溶液和二抗溶液。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)移到膜上的光學(xué)標(biāo)記的蛋白質(zhì)用選自下組的物質(zhì)標(biāo)記：熒光染料，比色染料和鹵代烷烴。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括在施加抗體溶液之前將封閉溶液施加到膜的表面。

在一些實(shí)施方式中，用于免疫印跡的系統(tǒng)包括其上轉(zhuǎn)移有可光學(xué)檢測的蛋白質(zhì)的膜；分配器，用于分配抗體溶液；被配置為照亮所述膜的光源；檢測器，其被配置為檢測所述光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)；處理器；以及存儲(chǔ)器，其包括用于存儲(chǔ)指令的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)單元，所述指令可由所述處理器執(zhí)行，并且配置所述系統(tǒng)以根據(jù)由所述檢測器檢測到的光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)來分配所述抗體溶液。在一些實(shí)施方式中，檢測器還配置成檢測靶蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，系統(tǒng)還包括被配置為檢測靶蛋白質(zhì)的第二檢測器。

在其它實(shí)施方式中，可以使用配置來探測核酸印跡。

附圖的簡要說明

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式的免疫印跡系統(tǒng)的示意圖。

圖2顯示了具有轉(zhuǎn)移至其上的光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)和靶蛋白質(zhì)的膜的俯視圖，其中根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式使用微流體探針施加抗體溶液。

圖3a和3b顯示了現(xiàn)有技術(shù)的微流體探針。

圖4顯示了具有多個(gè)處理液體微通道的微流體探針，其可以連接到單個(gè)抗體溶液或根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式的多個(gè)抗體溶液。

圖5顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式平行連接到單個(gè)或多個(gè)抗體溶液的多個(gè)微流體探針。

圖6是顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式的使用圖1的系統(tǒng)將抗體溶液施加到具有光學(xué)可檢測轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的膜的表面的方法的流程圖。

圖7是顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式的將核酸探針溶液施加到具有熒光標(biāo)記的核酸片段的膜的表面的方法的流程圖。

圖8顯示了可用于根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式的系統(tǒng)和方法的示例性計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的框圖。

圖9a-9c顯示了使用微流體探針和模型靶抗原(例如，人血清抗原，hsa)的免疫印跡結(jié)果。圖9a顯示了在施加一抗之前疊加在印跡照片上的微流體探針的路徑。對(duì)于hsa條帶的通過微流體探針進(jìn)行的一抗(例如，抗hsa)的施加由與含有hsa的泳道相鄰的泳道中預(yù)染色分子量標(biāo)記物引導(dǎo)。圖9b顯示了將抗hsa施加到hsa條帶后的印跡圖像。圖9c是在微流體探針的路徑上的信號(hào)強(qiáng)度分布。

圖10a和10b顯示了使用微流體探針和模型靶抗原(例如，hsa)的更多的免疫印跡結(jié)果。圖10a顯示了在施加抗-hsa之后疊加在印跡圖像上的微流體探針的路徑。對(duì)于hsa條帶的通過微流體探針進(jìn)行的抗-hsa的施加由與hsa相同的泳道中的預(yù)染分子量標(biāo)記物引導(dǎo)。圖10b是在微流體探針的路徑上的信號(hào)強(qiáng)度分布。

定義

術(shù)語“可光學(xué)檢測的蛋白質(zhì)”是指用發(fā)光(例如，熒光，比色，磷光或化學(xué)發(fā)光)物質(zhì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)，當(dāng)用光照射時(shí)，其發(fā)射光信號(hào)。

發(fā)明詳述

本文描述了用于免疫印跡的系統(tǒng)和方法。系統(tǒng)和方法有助于免疫印跡的自動(dòng)化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)免疫印跡的自動(dòng)化高通量系統(tǒng)和方法可以一次測試多個(gè)樣品，使用較少量的試劑，并且可以提供快速的測試結(jié)果。

本文描述的系統(tǒng)和方法的優(yōu)點(diǎn)包括但不限于：(1)提供自動(dòng)化或“免手動(dòng)(hands-free)”的系統(tǒng)；(2)提供使反應(yīng)化學(xué)局部化從而減少反應(yīng)時(shí)間的系統(tǒng)；(3)提供能夠進(jìn)行多重化測試的系統(tǒng)(例如，一次測試多個(gè)蛋白質(zhì)樣品或測試多個(gè)靶蛋白的單個(gè)蛋白質(zhì)樣品)；(4)提供能夠?qū)崟r(shí)檢測靶蛋白質(zhì)的系統(tǒng)；(5)提供能夠沉積較小體積的試劑(例如，抗體溶液)的系統(tǒng)；(6)提供能夠使用轉(zhuǎn)移到膜表面上的光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)引導(dǎo)向膜表面施加抗體溶液的系統(tǒng)，和/或(7)提供其中抗體溶液的施加和未結(jié)合的抗體的去除可同時(shí)進(jìn)行的系統(tǒng)。

在本說明書和權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括多個(gè)指示物，除非上下文中有明顯的表示。因此，例如，參考包含“抗體溶液”的系統(tǒng)包括包含一種或多種抗體溶液的系統(tǒng)。類似地，參考“光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)”包括一種或多種光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)。

系統(tǒng)

參考圖1，顯示了用于免疫印跡的系統(tǒng)100。在一個(gè)實(shí)施方式中，系統(tǒng)100用于將抗體溶液施用于轉(zhuǎn)移有光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)和靶蛋白質(zhì)的免疫印跡膜。系統(tǒng)100包括膜102、分配器104、光源106和檢測器108。

如圖2所示，膜102包括從聚丙烯酰胺電泳凝膠轉(zhuǎn)移的一種或多種可光學(xué)檢測的蛋白質(zhì)120和靶蛋白質(zhì)122。在一些實(shí)施方式中，膜102安裝在可在x-y和/或z方向上移動(dòng)的平臺(tái)上。在一些實(shí)施方式中，膜102是濕的。需要濕或潮濕的膜以在檢測靶蛋白質(zhì)122期間降低背景。用于水合膜102的示例性流體包括但不限于緩沖液，封閉溶液，水和/或鹽水。示例性膜材料包括聚偏二氟乙烯、尼龍、聚砜和硝酸纖維素。

在一些實(shí)施方式中，可光學(xué)檢測的蛋白質(zhì)120可以是用熒光染料、比色染料或鹵代烷烴(即，鹵素取代的有機(jī)化合物)標(biāo)記的蛋白質(zhì)。一些實(shí)施方式使用如美國專利號(hào)8,007,646中所述的鹵代烷烴，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。示例性熒光染料包括但不限于，表雄酮，2-甲氧基-2，4-二苯基-3(2h)-呋喃酮，釕基染料(例如，紅寶石蛋白凝膠染色劑)、花青類染料、基于香豆素的花青染料(例如bio-radflamingo^tm)和bio-radoriole^tm。示例性比色染料包括考馬斯亮藍(lán)和硝酸銀。在一些實(shí)施方式中，光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)120在sds-page之前或期間被標(biāo)記。在其它實(shí)施方式中，可光學(xué)檢測的蛋白質(zhì)120在轉(zhuǎn)移到印跡膜102上之后進(jìn)行標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方式中，在聚丙烯酰胺凝膠中包含鹵代烷烴，并且在暴露于uv光時(shí)，在sds-page期間鹵代烷烴與蛋白質(zhì)中的色氨酸殘基共價(jià)鍵合。然后可將得到的含“無染料”鹵代烷基化色氨酸蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜進(jìn)行免疫染色。

靶蛋白質(zhì)122可以是任何感興趣的蛋白質(zhì)。靶蛋白質(zhì)122可以包括整個(gè)類別的蛋白質(zhì)，例如酶、激素和/或抗體。

再次參考圖1，分配器104被配置為分配一個(gè)或多個(gè)抗體溶液的微流體或亞微流體體積，每個(gè)體積分散在膜102的表面上的離散路徑124中。在一些實(shí)施方式中，路徑跨越在膜102的表面上的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)條帶的泳道的長度。在一個(gè)實(shí)施方式中，路徑的寬度為約25納米至約500微米寬。在某些實(shí)施方式中，路徑的寬度為約25微米至約200微米寬。在一些實(shí)施方式中，路徑是連續(xù)的。在一些實(shí)施方式中，路徑是不連續(xù)的。在一些實(shí)施方式中，1-50抗體溶液在蛋白質(zhì)條帶上的平行路徑中分配。在其他實(shí)施方式中，1-20抗體溶液在蛋白質(zhì)條帶上的平行路徑中分配。在一些實(shí)施方式中，1-10抗體溶液在蛋白質(zhì)條帶上的平行路徑中分配。在一些實(shí)施方式中，以斑點(diǎn)和/或點(diǎn)的圖案分配一種或多種抗體溶液。在一個(gè)實(shí)施方式中，斑點(diǎn)/點(diǎn)的直徑為約25納米至約500微米。在某些實(shí)施方式中，斑點(diǎn)/點(diǎn)的直徑為約25納米至約200微米。在一個(gè)實(shí)施例中，斑點(diǎn)和/或點(diǎn)陣列覆蓋基材的表面。

在一些實(shí)施例中，分配器104可在x-y和/或z方向上移動(dòng)。分配器104的移動(dòng)和功能可以是計(jì)算機(jī)控制的。

示例性的分配器包括流體動(dòng)力學(xué)流動(dòng)約束分配器，噴墨打印機(jī)，噴霧沉積分配器，微型點(diǎn)陣器和/或微接觸式打印機(jī)。在一個(gè)實(shí)施方式中，分配器104是在膜102的表面上沉積一種或多種抗體溶液(例如，一抗和/或二抗溶液)的微流體探針200。在一個(gè)實(shí)施方式中，流體動(dòng)力學(xué)流動(dòng)約束分配器是微流體探針(或垂直mfp)，如美國專利申請(qǐng)13/881,989中所述，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。在圖3a和3b所示的實(shí)施方式中，微流體探針200可以包括基層220，其中處理液體微通道223，224與浸沒液體微通道323，324一起提供。每個(gè)通道與孔221，222，321，322流體連通，每個(gè)孔位于基層的表面(不一定是相同的面)上，并且優(yōu)選緊鄰。通道223，224，323，324還提供電動(dòng)泵與孔221，222，321，322之間的連接。當(dāng)在表面附近移動(dòng)微流體探針200時(shí)，通過孔221提供的處理液體將與浸沒液體合并并且優(yōu)選地插入通過孔321和322提供的浸沒液體，如圖3b的彎曲(厚)箭頭所象征的。后者是為了理解而提供的；他們的維度被刻意夸大。在這方面，在一些實(shí)施方式中，該裝置被配置為獲得層流。在一些實(shí)施方式中，孔尺寸可以是幾十微米(例如，10-50微米)。在一些實(shí)施方式中，孔尺寸可以為1-50微米?？淄ǔｉg隔幾百微米(例如，200-500微米)。由于這里使用成對(duì)的處理通道/孔，所以處理液體可以與一些浸沒液體一起在孔222處被再吸出。注意，孔221和222之間的流動(dòng)路徑可以反轉(zhuǎn)，即處理液體可以從孔222注入，而孔221可以吸出液體。處理液體可以基本上位于孔221和222附近，并被基本上存在于頭部200附近的浸沒液體包圍。覆蓋層210封閉開在基層的上表面上的通道開口，如描述。

此外，在一些實(shí)施方式中，處理液體微通道的一部分以基層220的層厚度中的凹槽223′，224′提供，在其上表面上有開口。不管橫向尺寸(可能很小，例如幾十微米)，這樣很容易實(shí)現(xiàn)形成微通道。在組裝后，凹槽被覆蓋層210的一部分封閉。凹槽可以由工具直接雕刻在基層220的上表面上。其可以具有任意合適的截面形狀，例如，圓形、正方形、u或v截面?？梢愿鶕?jù)基層220的材料來選擇該工具。在一個(gè)變體中，可以考慮激光燒蝕。最有利的是，深反應(yīng)離子蝕刻(drie)用于制造微通道。

如圖3b所示，凹槽223′，224′延伸到相應(yīng)的孔221，222。類似地，浸沒通道223，224到達(dá)相應(yīng)的孔321，324。在該示例中，通道和孔圍繞頭部的上表面的主軸對(duì)稱排列。在基層220的前表面320的邊緣310的水平處，在凹槽的端部處直接形成孔，這在此易于再次加工。所述前端320通常是尖銳的，這允許感興趣的表面上的緊密的液體沉積，并且留下便于光學(xué)監(jiān)測的空間。

參考圖3a，通孔211，212設(shè)置在覆蓋層210上。附加通孔311被示出，其允許將流體連通中繼到浸沒通道323，324(在這里僅提供一個(gè)通孔，其向兩個(gè)浸沒通道進(jìn)料)。可以提供連接到通孔的相應(yīng)管道端口(未顯示)。通道具有布置成例如面向通孔的端部。

如圖3a和3b所示，微流體探針200包括兩個(gè)處理液體微通道。在一些實(shí)施方式中，微流體探針200包括兩個(gè)以上的處理液體微通道。在一些實(shí)施方式中，微流體探針400包括2-50個(gè)處理液體微通道(參見圖4)。在一些實(shí)施方式中，微流體探針200可以在至少一個(gè)處理液體微通道中包括加熱元件。加熱樣品可能會(huì)增加抗原和抗體反應(yīng)的速度，從而可減少測試時(shí)間。

在圖5所示的實(shí)施方式中，微流體探針是平行連接的探針陣列(即，探針陣列500)，其可以連接到相同或不同的處理液體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，探針陣列500中的每個(gè)探針包括多個(gè)微通道。

微流體探針可以由與流過通道的流體相容的材料形成。示例性的相容材料包括但不限于硅、二氧化硅、聚二甲基硅氧烷(pdms)、砷化鎵、玻璃、陶瓷、石英、聚合物如氯丁橡膠、teflon^tm、聚乙烯彈性體、聚丁二烯/sbr、亞硝酸鹽、尼龍和/或金屬。通道的內(nèi)表面也可以用合適的材料涂覆以降低流體組分和通道本身之間的親和性。

示例性的處理液體包括抗體溶液、緩沖液、封閉溶液、油(例如，礦物油)和/或空氣。示例性浸沒液體包括緩沖液、封閉溶液和油。

處理和浸沒液體被配置成以有效和可重復(fù)的方式填充微通道。因此，將液體配制成具有適當(dāng)?shù)恼扯?、親水性或疏水性。在一些實(shí)施方式中，液體可以包括一種或多種表面活性劑、洗滌劑、乳化劑、增溶劑，以便以快速和可重復(fù)的方式提供微通道的可接受/最佳填充。在一些實(shí)施方式中，液體包括以下中的一種或多種：月桂基硫酸銨、月桂基硫酸鈉(sds，十二烷基硫酸鈉)、月桂醇聚醚硫酸鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉、全氟辛烷磺酸鹽(pfos)、全氟丁烷磺酸鹽、直鏈烷基苯磺酸鹽(lab)、硬脂酸鈉、月桂酰肌氨酸鈉、全氟壬酸鹽、全氟辛酸鹽、烷基三甲基銨鹽(例如，十六烷基三甲基溴化銨)、氯化十六烷基吡啶(cpc)、苯扎氯銨(bac)、芐索氯銨(bzt)、5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷、二甲基雙十八烷基氯化銨、十六烷基三甲基溴化銨、雙十八烷二甲基基溴化銨(dodab)、chaps、椰油酰胺丙基羥基磺基甜菜堿、卵磷脂、聚氧乙烯二醇烷基醚、聚氧丙烯二醇烷基醚、葡萄糖苷烷基醚、聚氧乙烯二醇辛基酚醚(如曲通x-100)、聚氧乙烯乙二醇烷基酚醚、甘油烷基酯、聚氧乙烯二醇脫水山梨糖醇烷基酯(例如，聚山梨醇酯)、脫水山梨糖醇烷基酯、椰油酰胺mea、椰油酰胺dea、十二烷基二甲基氧化胺、聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物和/或聚乙氧基化牛脂胺(poea)。

在一些實(shí)施方式中，液體包含調(diào)整濃度的吐溫(例如，吐溫-20)和牛血清白蛋白(bsa)。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)吐溫(例如，吐溫-20)和bsa的濃度以提供溶液在微通道長度上的高效流動(dòng)。在一些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)吐溫(例如，吐溫-20)和bsa的濃度以提供通過微流體通道的膜的活化/潤濕。在一些實(shí)施方式中，液體包含0.01％至5％的bsa。在一些實(shí)施方式中，液體包含0.01％至5％的吐溫。

抗體溶液中的抗體可以是多克隆和/或單克隆抗體或具有不同抗原特異性或其功能片段的單克隆抗體的混合物?？贵w也可以是一種或多種一抗和/或二抗。

再次參考圖1，光源106被配置為照射膜102的表面。根據(jù)待檢測的信號(hào)，光源106可以提供從紫外范圍到遠(yuǎn)紅外范圍的光。示例性光源包括激光器和發(fā)光二極管。在一些實(shí)施方式中，光源106可以提供多個(gè)波長范圍的光。在一些實(shí)施方式中，光源106被配置為通過透射照射膜102。在其他實(shí)施方式中，光源106被配置為通過落射照射膜102。

檢測器108被配置為通過光學(xué)可檢測的蛋白質(zhì)120和/或標(biāo)記的靶蛋白質(zhì)122來檢測從膜102的表面發(fā)射的光。在一些實(shí)施方式中，通過比色、熒光、磷光或化學(xué)發(fā)光檢測來實(shí)現(xiàn)檢測。在一些實(shí)施方式中，通過諸如通過攝影或電子檢測器的成像來實(shí)現(xiàn)檢測。示例性電子檢測器包括光電二極管、電荷耦合器件(ccd)檢測器或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(cmos)檢測器。

來自檢測器108的模擬信號(hào)由模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器110數(shù)字化。數(shù)字化信號(hào)由微處理器112處理以獲得存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器114中和/或顯示在可選顯示器116上的檢測光的至少一個(gè)值或強(qiáng)度。

通過使用適當(dāng)?shù)碾娮釉蛙浖到y(tǒng)100可被編程為知曉膜102表面上的光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)120和靶蛋白質(zhì)122的種類和位置。

方法

參考圖6，現(xiàn)在將描述使用上述系統(tǒng)100的用于免疫印跡的方法600。

在示例性步驟610中，將抗體溶液施加到具有轉(zhuǎn)移到其上的光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)和靶蛋白質(zhì)的濕膜102的表面，其中抗體溶液的施加由從光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)發(fā)射的信號(hào)引導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)產(chǎn)生所轉(zhuǎn)移的光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)的圖譜(例如，熒光蛋白質(zhì)條帶和泳道的圖譜)，并疊加在膜102上以引導(dǎo)將一種或多種含一抗和/或二抗溶液的線或斑點(diǎn)施加到整個(gè)泳道或泳道的部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，跨越包含靶蛋白質(zhì)的分子量區(qū)域的兩個(gè)熒光蛋白條帶可用于引導(dǎo)一抗和/或二抗溶液的施加。在一些實(shí)施方式中，可以使用30千道爾頓和50千道爾頓熒光蛋白條帶來引導(dǎo)抗體溶液施加于分子量為40千道爾頓的靶蛋白質(zhì)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)120是鹵代烷基化蛋白質(zhì)，并且鹵代烷基化色氨酸熒光用于控制一種或多種抗體溶液施加于膜102的表面。在一些實(shí)施方式中，含鹵代烷基化色氨酸的蛋白質(zhì)具有已知含量(或數(shù)目)的鹵代烷基化色氨酸殘基，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被紫外線照射時(shí)，其產(chǎn)生可測量的熒光。在一些實(shí)施方式中，含有鹵代烷基化色氨酸的轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)是靶蛋白質(zhì)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，光學(xué)可檢測的蛋白質(zhì)120可以是如前所述用熒光染料或比色染色劑標(biāo)記的蛋白質(zhì)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)抗體溶液用一個(gè)或多個(gè)微流體探針200施加到膜102的表面。在另一個(gè)實(shí)施方式中，具有多于一個(gè)微通道的微流體探針400(圖4)用于將一種或多種抗體溶液施加于膜102的表面。在另一個(gè)實(shí)施方式中，探針陣列500(圖5)用于將一種或多種抗體溶液施加于膜102的表面。在一些實(shí)施方式中，施加后，抗體溶液可與膜102的表面上的材料孵育約5分鐘至60分鐘。

方法600還可以包括在施加抗體溶液以除去未結(jié)合的抗體之后的洗滌步驟。在一些實(shí)施方式中，洗滌步驟與抗體施加步驟同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，在施加抗體溶液之前將封閉溶液施加到膜102的表面。

在示例性步驟620中，通過例如二次標(biāo)記檢測來檢測靶蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，通過使用可檢測的部分和/或標(biāo)記來使與靶蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體顯像和/或檢測與靶蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體?？蓹z測的部分可以由檢測器108或不同的檢測器檢測。通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)技術(shù)檢測合適的標(biāo)記和/或部分。在一些實(shí)施方式中，一抗和/或二抗與可通過分光光度法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、免疫化學(xué)法、電學(xué)法、光學(xué)法或化學(xué)技術(shù)檢測的檢測部分連接。在一些實(shí)施方式中，使用，例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶酶促進(jìn)行檢測。在一些實(shí)施方式中，檢測部分是熒光團(tuán)，包括但不限于alexa染料(例如alexa350，alexa430等)、amca、bodipy630/650、bodipy650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、bodipy-tmr、bodipy-trx、級(jí)聯(lián)藍(lán)、cy2、cy3、cy5、6-fam、熒光素、hex、，6-joe、俄勒岡綠488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514，太平洋藍(lán)、reg、羅丹明綠、羅丹明紅、rox、tamra、tet、四甲基羅丹明和/或德克薩斯紅。在一些實(shí)施方式中，檢測部分是紅外光吸收染料，包括但不限于irdye800cw、irdye680lt、irdye、700dx和/或irdye680。

參考圖7，現(xiàn)在將描述使用上述系統(tǒng)100的用于印跡(即，southern或northern印跡)的方法700。

在示例性步驟700中，將核酸探針溶液施加到具有熒光標(biāo)記的(例如，溴化乙錠標(biāo)記的)核酸片段和轉(zhuǎn)移到其上的靶核酸片段的濕膜的表面上，其中所述核酸探針溶液的施加由熒光標(biāo)記的核酸片段發(fā)出的信號(hào)引導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)產(chǎn)生轉(zhuǎn)移的熒光標(biāo)記的核酸片段(例如，熒光標(biāo)記的核酸片段條帶和泳道的圖譜)的圖，并疊加在膜102上以引導(dǎo)一種或多種核酸探針溶液的線或斑點(diǎn)施加至整個(gè)泳道或泳道的部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，跨越包含靶核酸片段的分子量區(qū)域的兩個(gè)熒光標(biāo)記的核酸片段可用于引導(dǎo)核酸探針溶液的施加。在一些實(shí)施方式中，可以使用0.2千堿基和1.2千堿基熒光標(biāo)記的核酸片段條帶來引導(dǎo)核酸探針溶液施加于分子量為0.8千堿基的靶核酸片段。

在一個(gè)實(shí)施方式中，一種或多種核酸探針溶液用一個(gè)或多個(gè)微流體探針200施加到膜702的表面。在另一個(gè)實(shí)施方式中，具有多于一個(gè)微通道的微流體探針400(圖4)用于將一個(gè)或多個(gè)核酸探針溶液施加于膜102的表面。在另一個(gè)實(shí)施方式中，探針陣列500(圖5)用于將一種或多種核酸探針溶液施加于膜102的表面。在一些實(shí)施方式中，在施加后，可以使核酸探針溶液與膜102的表面上的材料孵育約1分鐘至60分鐘。

方法700還可包括在施加核酸探針溶液以除去未結(jié)合的材料之后的洗滌步驟。在一些實(shí)施方式中，洗滌步驟與核酸探針溶液施加步驟同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，在施加核酸探針溶液之前將封閉溶液施加到膜102的表面。

在示例性步驟720中，通過例如二次標(biāo)記檢測來檢測靶核酸。在一些實(shí)施方式中，通過使用可檢測的部分和/或標(biāo)記顯現(xiàn)和/或檢測與靶核酸結(jié)合的核酸探針?？蓹z測的部分可以由檢測器108或不同的檢測器檢測。通過同位素、光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)技術(shù)檢測合適的標(biāo)記和/或部分。在一些實(shí)施方式中，核酸探針與可通過同位素、分光光度法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、電學(xué)法、光學(xué)法或化學(xué)技術(shù)檢測的檢測部分連接。在一些實(shí)施方式中，使用，例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶酶促進(jìn)行檢測。在一些實(shí)施方式中，檢測部分是熒光團(tuán)，包括但不限于，生物素、熒光素、dnp、巖藻糖和/或德克薩斯紅。

計(jì)算機(jī)執(zhí)行的方法和系統(tǒng)

本文所述任何方法均可全部或部分地使用包括一個(gè)或多個(gè)處理器的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行，可對(duì)其進(jìn)行配置以完成所述方法的步驟。因此，實(shí)施方式可指向被配置以執(zhí)行本文所述任意方法的步驟的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，潛在地具有執(zhí)行相應(yīng)步驟或相應(yīng)步驟組合的不同組分。雖然以編號(hào)或有序步驟呈現(xiàn)，但本文所述方法的步驟可在同一時(shí)間或以不同順序執(zhí)行。此外，這些步驟的部分可與來自其他方法的其他步驟的部分聯(lián)用。同樣，步驟的全部或部分可以是任選的。此外，任何方法的任何步驟都可使用模塊、循環(huán)或用于執(zhí)行這些步驟的其他方法執(zhí)行。

在一些實(shí)施方式中，所述計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)執(zhí)行，該系統(tǒng)與能夠檢測膜中或膜的圖像中的光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)(例如，蛋白質(zhì)條帶)的圖像掃描儀電子通訊。計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法可以檢測標(biāo)記的蛋白質(zhì)條帶，并且可以使用檢測到的蛋白質(zhì)條帶來引導(dǎo)分配器的運(yùn)動(dòng)，因?yàn)橐环N或多種抗體溶液被施加到膜的表面。

本公開還提供了一種能夠執(zhí)行本文所述的方法的任何一個(gè)或所有步驟的計(jì)算機(jī)產(chǎn)品。因此在一些實(shí)施方式中，所述計(jì)算機(jī)產(chǎn)品包括非瞬時(shí)計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其儲(chǔ)存用于控制處理器執(zhí)行本發(fā)明所述的一個(gè)或多個(gè)方法步驟操作的多項(xiàng)指令。

圖8顯示示例性計(jì)算機(jī)系統(tǒng)800的框圖，其可用于本公開實(shí)施方式的系統(tǒng)和方法。

本發(fā)明提及的任何計(jì)算機(jī)系統(tǒng)都可利用任何適當(dāng)數(shù)目的子系統(tǒng)。這類子系統(tǒng)的示例如圖8中計(jì)算機(jī)設(shè)備800所示。在一些實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包括單個(gè)計(jì)算機(jī)設(shè)備，其中子系統(tǒng)可以是該計(jì)算機(jī)設(shè)備的組件。在其他實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可包括多個(gè)計(jì)算機(jī)設(shè)備，其各是子系統(tǒng)，具有內(nèi)部組件。

圖8所示的子系統(tǒng)經(jīng)由系統(tǒng)總線875互聯(lián)。顯示了其他子系統(tǒng)，如打印機(jī)874、鍵盤878、儲(chǔ)存裝置879、與顯示適配器882偶聯(lián)的監(jiān)視器876等。與輸入/輸出(i/o)控制器871偶聯(lián)的周邊和i/o裝置可通過任何數(shù)量的本領(lǐng)域已知方式(如串行端口877)連接至計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。例如，串行端口877或外部接口881(例如以太網(wǎng)、wi-fi等)可用于將計(jì)算機(jī)系統(tǒng)800連接至廣域網(wǎng)(如因特網(wǎng))、鼠標(biāo)輸入裝置或掃描儀。經(jīng)由系統(tǒng)總線875的互聯(lián)允許中央處理器873與各子系統(tǒng)連通并控制來自系統(tǒng)內(nèi)存872或儲(chǔ)存裝置879(例如固定磁盤，如硬盤或光盤)指令的執(zhí)行以及子系統(tǒng)間信息的交換。系統(tǒng)存儲(chǔ)器872和/或儲(chǔ)存裝置879可包含計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。本文所述的任何數(shù)據(jù)都可從一種組件輸出至另一種組件并可輸出至用戶。

計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可包括多種相同的組件或子系統(tǒng)，例如通過外部接口881或通過內(nèi)部接口連接在一起。在一些實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、子系統(tǒng)或設(shè)備可通過網(wǎng)絡(luò)連通。在這種情況下，可將一臺(tái)計(jì)算機(jī)作為客戶端并將另一臺(tái)計(jì)算機(jī)作為服務(wù)器，其中各計(jì)算機(jī)都可以是同一計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的部分?？蛻舳撕头?wù)器可各包括多個(gè)系統(tǒng)、子系統(tǒng)或組件。

應(yīng)理解，上述實(shí)施方式可使用硬件(例如專用集成電路或現(xiàn)場可編程門陣列)以控制邏輯的形式和/或采用一般可編程的處理器使用計(jì)算機(jī)軟件以模塊化或集成化的方式來實(shí)施。本文中，處理器包括同一集成芯片上的多核處理器或者單個(gè)電路板上或網(wǎng)絡(luò)連接的多個(gè)處理單元。基于本發(fā)明的公開和教導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)知曉并理解使用硬件以及硬件和軟件的組合來實(shí)施本文所述的實(shí)施方式的其他方式和/或方法。

本申請(qǐng)中描述的任何軟件組件或函數(shù)都可作為軟件代碼使用，以由處理器使用任何適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)語言(如java、c++或perl)、使用例如常規(guī)或面向?qū)ο蟮募夹g(shù)來執(zhí)行。軟件代碼可作為一系列指令或命令儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上用于儲(chǔ)存和/或傳輸，合適的介質(zhì)包括隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(ram)、只讀存儲(chǔ)器(rom)、磁性介質(zhì)(如硬盤或軟盤)、光學(xué)介質(zhì)(如光盤(cd)或dvd(數(shù)字多功能光盤)、閃速存儲(chǔ)器等)。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可以是這里儲(chǔ)存或傳輸裝置的任意組合。

也可使用適用于傳輸?shù)妮d波信號(hào)經(jīng)由遵循多種協(xié)議的有線、光纖和/或無線網(wǎng)絡(luò)(包括因特網(wǎng))編碼和傳輸這類程序。同樣地，可使用這類程序編碼的數(shù)據(jù)信號(hào)來建立本公開的一個(gè)實(shí)施方式所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。程序代碼編碼的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可與兼容性裝置打包或由其他裝置單獨(dú)提供(例如通過因特網(wǎng)下載)。任何這類計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可存在于單個(gè)計(jì)算機(jī)產(chǎn)品(例如硬盤、cd或整個(gè)計(jì)算機(jī)系統(tǒng))之上或之內(nèi)，且可存在于系統(tǒng)或網(wǎng)絡(luò)中不同計(jì)算機(jī)產(chǎn)品之上或之內(nèi)。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可包括監(jiān)視器、打印機(jī)或?qū)⒈景l(fā)明所述任何結(jié)果提供給用戶的其他合適顯示裝置。

其他公開和可要求的主題

第1項(xiàng).一種免疫印跡的方法，包括：

將抗體溶液施加到具有轉(zhuǎn)移到其上的光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)和靶蛋白質(zhì)的膜的表面，其中所述抗體溶液的施加由從光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)發(fā)射的信號(hào)引導(dǎo)；并且

檢測所述靶蛋白質(zhì)。

第2項(xiàng).如第1項(xiàng)所述的方法，還包括洗滌步驟，其中未結(jié)合的材料從膜上除去。

第3項(xiàng).如第2項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體溶液的施加步驟與所述洗滌步驟同時(shí)進(jìn)行。

第4項(xiàng).如第1-3項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗體溶液的施加步驟包括分配所述抗體溶液的微流體體積。

第5項(xiàng).如第1-3項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗體溶液的施加步驟包括分配所述抗體溶液的亞微流體體積。

第6項(xiàng).如第1-3項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗體溶液的施加步驟包括用選自下組的技術(shù)分配所述抗體溶液：流體動(dòng)力學(xué)流動(dòng)約束、噴墨印刷、噴霧沉積、微點(diǎn)滴定和微接觸印刷。

第7項(xiàng).如第6項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗體溶液的施加步驟包括用微流體探針分配所述抗體溶液。

第8項(xiàng).如第7項(xiàng)所述的方法，其中，所述微流體探針包括多個(gè)微通道。

第9項(xiàng).如第7項(xiàng)或第8項(xiàng)所述的方法，其中所述微流體探針是微流體探針的陣列。

第10項(xiàng).如前述第1-9項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體溶液的施加步驟包括將抗體溶液分配到所述膜的表面上的至少一個(gè)離散路徑中。

第11項(xiàng).如第10項(xiàng)所述的方法，其中所述路徑跨越一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)條帶的泳道的長度。

第12項(xiàng).如第10項(xiàng)所述的方法，其中所述路徑為25納米至500微米寬。

第13項(xiàng).如前述第1-9項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體溶液的施加步驟包括將2種抗體溶液各自分配到所述膜的表面上的泳道上至少一個(gè)離散路徑中。

第14項(xiàng).如前述第1-9項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體溶液的施加步驟包括將抗體溶液分配到至少一個(gè)離散斑點(diǎn)中。

第15項(xiàng).如前述第1-9項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體溶液的施加步驟包括分配一抗溶液和二抗溶液。

第16項(xiàng).如前述第1-9項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述膜包含選自下組的材料：聚偏二氟乙烯、硝酸纖維素、尼龍和聚砜。

第17項(xiàng).如前述第1-16項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中轉(zhuǎn)移到膜上的光學(xué)標(biāo)記的蛋白質(zhì)用選自下組的物質(zhì)標(biāo)記：熒光染料，比色染料和鹵代烷烴。

第18項(xiàng).如前述第1-17項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在施加抗體溶液之前將封閉溶液施加到膜的表面。

第19項(xiàng).一種免疫印跡系統(tǒng)，其包括：

具有轉(zhuǎn)移到其上的光學(xué)可檢測的蛋白質(zhì)的膜；

配置為分配抗體溶液的分配器；

配置為檢測所述光學(xué)可檢測的蛋白質(zhì)的檢測器；

處理器；和

存儲(chǔ)器，其包括用于存儲(chǔ)指令的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)單元，所述指令可由所述處理器執(zhí)行，并且配置所述系統(tǒng)以根據(jù)由所述檢測器檢測到的光學(xué)可檢測蛋白質(zhì)來分配所述抗體溶液。

第20項(xiàng).如第19項(xiàng)所述的免疫印跡系統(tǒng)，其中所述檢測器還配置成檢測靶蛋白質(zhì)。

第21項(xiàng).如第19項(xiàng)或第20項(xiàng)所述的免疫印跡系統(tǒng)，還包括配置成檢測靶蛋白質(zhì)的第二檢測器。

第22項(xiàng).如第19-21項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的免疫印跡系統(tǒng)，其中所述分配器選自下組：流體動(dòng)力學(xué)流動(dòng)約束分配器、噴墨打印機(jī)、噴霧沉積分配器、微型點(diǎn)陣器和微接觸式打印機(jī)。

第23項(xiàng).如第19-22項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的免疫印跡系統(tǒng)，其中所述分配器是微流體探針。

第24項(xiàng).如第23項(xiàng)所述的免疫印跡系統(tǒng)，其中，所述微流體探針包括多個(gè)微通道。

第25項(xiàng).如第23項(xiàng)所述的免疫印跡系統(tǒng)，其中所述微流體探針是微流體探針的陣列。

第26項(xiàng).一種免疫印跡的方法，包括：

將抗體溶液施加到具有轉(zhuǎn)移到其上的含鹵代烷基化色氨酸的蛋白質(zhì)和靶蛋白質(zhì)的膜的表面，其中所述抗體溶液的施加由所述含鹵代烷基化色氨酸的蛋白質(zhì)的熒光引導(dǎo)；并且

檢測所述靶蛋白質(zhì)。

第27項(xiàng).一種免疫印跡系統(tǒng)，其包括：

具有轉(zhuǎn)移的含鹵代烷基化色氨酸的蛋白質(zhì)的膜；

配置為分配抗體溶液的分配器；

配置為檢測所述含鹵代烷基化色氨酸的蛋白質(zhì)的檢測器；

處理器；和

存儲(chǔ)器，其包括用于存儲(chǔ)指令的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)單元，所述指令可由所述處理器執(zhí)行，并且配置所述系統(tǒng)以根據(jù)由所述檢測器檢測到的含鹵代烷基化色氨酸的蛋白質(zhì)來分配所述抗體溶液。

第28項(xiàng).一種印跡方法，包括：

將核酸探針施加到具有轉(zhuǎn)移至其上的熒光標(biāo)記的核酸片段和靶核酸片段的膜的表面，其中所述核酸探針的施加由從所述熒光標(biāo)記的核酸片段發(fā)出的信號(hào)引導(dǎo)；并且

檢測所述靶核酸片段。

第29項(xiàng).如第28項(xiàng)所述的方法，還包括洗滌步驟，其中未結(jié)合的材料從膜上除去。

第30項(xiàng).如第29項(xiàng)所述的方法，其中所述探針的施加步驟與所述洗滌步驟同時(shí)進(jìn)行。

第31項(xiàng).如第28-30項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述核酸探針的施加步驟包括分配所述探針的微流體體積。

第32項(xiàng).如第28-30項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述核酸探針的施加步驟包括分配所述探針的亞微流體體積。

第33項(xiàng).如第28-32項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述核酸探針的施加步驟包括用選自下組的技術(shù)分配所述核酸探針：流體動(dòng)力學(xué)流動(dòng)約束、噴墨印刷、噴霧沉積、微點(diǎn)滴定和微接觸印刷。

第34項(xiàng).如第28-33項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述核酸探針的施加步驟包括用微流體探針分配所述核酸探針。

第35項(xiàng).如第34項(xiàng)所述的方法，其中，所述微流體探針包括多個(gè)微通道。

第36項(xiàng).如第34項(xiàng)所述的方法，其中所述微流體探針是微流體探針的陣列。

第37項(xiàng).如前述第28-36項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸探針的施加步驟包括將所述核酸探針分配到所述膜的表面上的至少一個(gè)離散路徑中。

第38項(xiàng).如第37項(xiàng)所述的方法，其中所述路徑跨越一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)條帶的泳道的長度。

第39項(xiàng).如第37項(xiàng)所述的方法，其中所述路徑為25納米至500微米寬。

第40項(xiàng).如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述核酸探針的施加步驟包括將2種核酸探針各自分配到所述膜的表面上的泳道上的離散路徑中。

第41項(xiàng).如第28-36項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述核酸探針的施加步驟包括將所述核酸探針分配到至少一個(gè)離散斑點(diǎn)中。

第42項(xiàng).如前述第28-41項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述膜包含選自下組的材料：聚偏二氟乙烯、硝酸纖維素、尼龍和聚砜。

第43項(xiàng).如前述第28-42項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，其中轉(zhuǎn)移到所述膜上的熒光標(biāo)記的核酸片段用溴化乙錠標(biāo)記。

第44項(xiàng).如前述第28-43項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在施加所述核酸探針之前將封閉溶液施加到所述膜的表面。

第45項(xiàng).一種印跡系統(tǒng)，其包括：

具有轉(zhuǎn)移到其上的熒光標(biāo)記的核酸片段的膜；

配置為分配核酸探針的分配器；

配置為檢測所述熒光標(biāo)記的核酸片段的檢測器；

處理器；和

存儲(chǔ)器，其包括用于存儲(chǔ)指令的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)單元，所述指令可由所述處理器執(zhí)行，并且配置所述系統(tǒng)以根據(jù)由所述檢測器檢測到的所述熒光標(biāo)記的核酸片段來分配所述核酸探針。

第46項(xiàng).如第45項(xiàng)所述的印跡系統(tǒng)，其中所述檢測器還配置成檢測靶核酸片段。

第47項(xiàng).如第45項(xiàng)或第46項(xiàng)所述的印跡系統(tǒng)，還包括配置成檢測靶核酸片段的第二檢測器。

第48項(xiàng).如第45-47項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的印跡系統(tǒng)，其中所述分配器選自下組：流體動(dòng)力學(xué)流動(dòng)約束分配器、噴墨打印機(jī)、噴霧沉積分配器、微型點(diǎn)陣器和微接觸式打印機(jī)。

第49項(xiàng).如第45-48項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的印跡系統(tǒng)，其中所述分配器是微流體探針。

第50項(xiàng).如第49項(xiàng)所述的印跡系統(tǒng)，其中，所述微流體探針包括多個(gè)微通道。

第51項(xiàng).如第49項(xiàng)或第50項(xiàng)所述的印跡系統(tǒng)，其中所述微流體探針是微流體探針的陣列。

實(shí)施例

實(shí)施例1：使用微流體探針的免疫印跡

以下描述了使用微流體探針檢測單一印跡上腦組織中的四種不同蛋白質(zhì)的多重western印跡的一種提出的方法。

該方法的第一步涉及使用裂解緩沖液(50mmtris-hclph8.0，150mmnacl，1％np-40，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％sds，補(bǔ)充有磷酸酶和蛋白酶抑制劑)從12只年齡相匹配的正常或阿爾茨海默氏病小鼠的腦組織進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。取20μg的各樣品，加入等體積的2×利姆里樣品緩沖液(4％sds，10％2-巰基乙醇，20％甘油，0.004％溴酚藍(lán)，125mmtris-hcl，ph6.8)。將樣品緩沖液中的各細(xì)胞裂解物在95℃下加熱5分鐘。將蛋白質(zhì)樣品和適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)標(biāo)記物加載到4-15％bio-radtgx免染critrion^tm凝膠12+2孔中。使用tris-甘氨酸運(yùn)行緩沖液(25mmtris，190mm甘氨酸，0.1％sds，ph8.3)在100v下運(yùn)行凝膠約60分鐘。

當(dāng)電泳步驟完成時(shí)，從criterion^tm池中取出凝膠盒，并從盒中取出凝膠。將凝膠放在bio-radchemidoc^tmtouch成像儀的uv樣品盤上。打開uv光以激活凝膠中的鹵代烷基化蛋白質(zhì)1分鐘，以便在電印跡后可以熒光檢測蛋白條帶。從托盤中取出凝膠，并用低熒光pvdf膜組裝轉(zhuǎn)移夾心物。將夾心置于bio-radtrans-blotturbo系統(tǒng)中，并在25v下轉(zhuǎn)移7分鐘。

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移完成后，將低熒光pvdf膜印跡置于容器中的封閉緩沖液(3％牛血清白蛋白，20mmtrisph7.5，150mmnacl，0.1％吐溫20)中，并固定于微流體探針免疫印跡系統(tǒng)中的x-y-z平臺(tái)。拍攝印跡的熒光圖像以定位蛋白質(zhì)泳道和條帶。計(jì)算機(jī)使用蛋白質(zhì)泳道和條帶的熒光圖像產(chǎn)生疊加在膜上的圖，以自動(dòng)驅(qū)動(dòng)微流體探針將4種不同的抗體溶液(每種使用不同的微流體探針)分配到各樣品通道上。將各抗體溶液分配在25納米-200微米寬的線上。通過以下方式制備抗體溶液：1)在一體式緩沖液(condor生物科學(xué)公司(condorbioscience))中以1∶50稀釋tau(tau46)小鼠單克隆抗體#4019(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司(cellsignalingtechnology))；2)在一體式緩沖液中以1∶50稀釋phospho-tau(ser396)(phf13)小鼠單克隆抗體#9632(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司)；3)在一體式緩沖液中以1∶50稀釋?duì)?突觸核蛋白(syn204)小鼠mab#2647(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司)；4)在readytector一體式緩沖液中以1∶50稀釋app/β-淀粉樣蛋白(nab228)小鼠mab#2450(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司)。一體式緩沖液含有hrp偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體。當(dāng)四種抗體溶液中的每一種都分配在凝膠的12條通道中時(shí)，使用微探針通過分配tbs緩沖液(20mmtrisph7.5，150mmnacl)來洗滌印跡。

接下來從微流體探針免疫染色系統(tǒng)中除去印跡，并在tbs緩沖液中再漂洗一次以除去封閉緩沖液中的過量抗體和牛血清白蛋白。然后將印跡用預(yù)混合的bio-radclarityecl底物孵育5分鐘。將得到的印跡放置在chemidoc^tmtouch系統(tǒng)的chemi托盤上以獲得化學(xué)發(fā)光圖像。使用bio-radimagelab軟件測量靶蛋白質(zhì)條帶的強(qiáng)度，并對(duì)免染印跡圖像上測量的總加載對(duì)照進(jìn)行歸一化。

實(shí)施例2：使用常規(guī)方法的免疫印跡

以下描述了檢測單一印跡上的腦組織中的四種不同蛋白質(zhì)的典型常規(guī)western印跡方法。

常規(guī)western印跡方法的第一步涉及使用裂解緩沖液(50mmtris-hclph8.0，150mmnacl，1％np-40，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％sds，補(bǔ)充有磷酸酶和蛋白酶抑制劑)從12只年齡相匹配的正?；虬柎暮Ｄ喜⌒∈蟮哪X組織進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。取20μg的各樣品，加入等體積的2×利姆里樣品緩沖液(4％sds，10％2-巰基乙醇，20％甘油，0.004％溴酚藍(lán)，125mmtris-hcl，ph6.8)。將樣品緩沖液中的各細(xì)胞裂解物在95℃下加熱5分鐘。將蛋白質(zhì)樣品和適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)標(biāo)記物加載到4-15％bio-radtgxcritrion^tm凝膠12+2孔中。使用tris-甘氨酸運(yùn)行緩沖液(25mmtris，190mm甘氨酸，0.1％sds，ph8.3)在100v下運(yùn)行凝膠約60分鐘。

電泳完成后，將凝膠置于1×轉(zhuǎn)移緩沖液(25mmtris，190mm甘氨酸，20％甲醇)中10-15分鐘。使用常規(guī)pvdf膜組裝轉(zhuǎn)移夾心物，確保夾心物中沒有圈留氣泡。印跡應(yīng)在陽極上并且凝膠應(yīng)在陰極上。將夾心盒放入轉(zhuǎn)移罐中，并將冰塊放在罐中。在冷室中以10ma的恒定電流轉(zhuǎn)移過夜。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)移完成時(shí)，將pvdf膜印跡置于tbst(20mmtrisph7.5，150mmnacl，0.1％吐溫20)中的3％bsa中，在室溫下放置1小時(shí)。在4℃下，在10mltau(tau46)小鼠單克隆抗體溶液中將印跡孵育過夜。抗體在封閉緩沖液中以1∶1000稀釋。在施加hrp偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體溶液1小時(shí)之前，在室溫下，用tbst沖洗印跡5次持續(xù)5分鐘。用tbst再次沖洗印跡5次持續(xù)5分鐘。

當(dāng)抗體孵育步驟完成時(shí)，將化學(xué)發(fā)光底物施加于印跡。使用bio-radchemidoc^tmtouch系統(tǒng)捕獲化學(xué)發(fā)光信號(hào)。使用圖像分析軟件讀取靶蛋白質(zhì)的條帶強(qiáng)度。

為了檢測膜上的第二蛋白質(zhì)靶標(biāo)，在50℃下在攪拌下在剝離緩沖液(20ml10％sds，12.5ml0.5mtrishcl，67.5ml超純水，0.8mlβ-巰基乙醇)中剝離印跡，持續(xù)至多45分鐘。然后將膜在水中沖洗1小時(shí)。重復(fù)上述的抗體孵育和成像步驟以施加phospho-tau(ser396)(phf13)小鼠單克隆抗體以檢測磷酸化tau蛋白。

剝離并再探測印跡三次以檢測以下靶標(biāo)：使用小鼠mab#2647(1∶1000，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司)針對(duì)α-突觸核蛋白，使用小鼠mab#2450(1∶1000，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司)針對(duì)app/β-淀粉樣蛋白，和使用小鼠mab#3700(1∶1000，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司)針對(duì)管家加載對(duì)照蛋白β-肌動(dòng)蛋白。使用bio-radimagelab軟件從化學(xué)發(fā)光印跡圖像上測量感興趣的蛋白質(zhì)的強(qiáng)度，并針對(duì)管家蛋白質(zhì)加載對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。

實(shí)施例3：常規(guī)和基于微流體探針的免疫印跡的比較

基于微流體探針的免疫印跡與常規(guī)的western印跡相比具有以下主要益處/差異：

1)自動(dòng)抗體探測步驟：微流體探針免疫印跡系統(tǒng)自動(dòng)分配抗體溶液至各樣品泳道，并代替常規(guī)方法中超過10個(gè)步驟的手動(dòng)更換緩沖液的步驟。免手動(dòng)程序使科學(xué)家從漫長操作方案中釋放出來，使他們能夠?qū)Ｗ⒂谄渌?xiàng)目。它提高了實(shí)驗(yàn)室的生產(chǎn)力。

2)重現(xiàn)性：自動(dòng)抗體探測程序提供了抗體分配中的空間、時(shí)間和濃度的精確度，從而更好地控制抗體-抗原相互作用的動(dòng)力學(xué)。與傳統(tǒng)操作方案相比，這轉(zhuǎn)化為重現(xiàn)性更高的數(shù)據(jù)。

3)無剝離和再探測的多重化：微流體探針在各樣品通道上的離散路徑中提供不同的抗體。針對(duì)不同靶標(biāo)的抗體不相互混合，消除了與常規(guī)多重免疫測定相關(guān)的交叉反應(yīng)性問題，以及剝離和再探測的需要。

4)節(jié)約抗體：微流體探針在各樣品泳道上25納米至200微米寬的路徑中分配抗體，而不是整個(gè)膜印跡。這可能會(huì)降低每次實(shí)驗(yàn)的抗體消耗。

實(shí)施例4：使用微流體探針和模型靶抗原的免疫印跡

該實(shí)施例說明使用轉(zhuǎn)移到western印跡膜上的光學(xué)可檢測的蛋白質(zhì)以引導(dǎo)將一抗溶液施加于其上轉(zhuǎn)移有模型靶抗原(例如，靶蛋白質(zhì))的印跡膜的表面。通過微流體探針施加一抗在與靶抗原相鄰的泳道中由光學(xué)可檢測的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物引導(dǎo)。

對(duì)于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)，使用具有10孔的bio-rad4-20％tgx蛋白凝膠(目錄號(hào)4561094)。使用人血清白蛋白(hsa)蛋白質(zhì)(10mg/mlrockland，目錄號(hào)009-0133)的儲(chǔ)備溶液作為模型靶抗原。hsa在緩沖液中稀釋7500倍。緩沖液包括具有355mm2-巰基乙醇(bio-rad目錄號(hào)161-0710)和磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)的標(biāo)準(zhǔn)利姆里樣品緩沖液(bio-rad目錄號(hào)161-0747)。將稀釋的hsa樣品通過加熱至95℃預(yù)處理10分鐘。對(duì)于凝膠，將15ul加熱的hsa樣品加載到偶數(shù)泳道(總量為20ng的hsa)中，而奇數(shù)泳道加載分子量梯標(biāo)(precisionplusprotein^tmdualcolorstandards，bio-rad目錄號(hào)1610394)。使用tris-甘氨酸運(yùn)行緩沖液(25mmtris，109mm甘氨酸，0.1％sds，ph8.3)，使用bio-radtetracell在200v下進(jìn)行電泳分離約40分鐘。電泳分離后，用蒸餾水洗滌凝膠。

凝膠電泳后，從凝膠盒中取出凝膠，使用bio-radtrans-blotturbo系統(tǒng)和在25v下7分鐘的轉(zhuǎn)移時(shí)間，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到低熒光pvdf膜(來自bio-radturbo^tmrtaminilfpvdf轉(zhuǎn)移試劑盒，目錄號(hào)1704274)。pvdf膜先前已經(jīng)通過用99％甲醇處理該膜而被活化。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移后，將pvdf膜浸沒、脫脂干燥牛奶封閉劑(bio-rad目錄號(hào)170-6404)、5％tbs緩沖液(目錄號(hào)170-6435)和0.1％吐溫20的封閉溶液(或tbst)中緩慢搖晃1小時(shí)。

如圖9a所示，使用側(cè)接具有hsa的泳道的預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物在觀察確定用微流體探針(ibm研究公司，蘇黎世)在哪里向印跡膜施加250μg/ml一抗(用封閉溶液1∶4稀釋的兔抗-hsa多克?。籸ockland目錄號(hào)600-401-033)。在與標(biāo)記物4和標(biāo)記物5之間的區(qū)域中hsa條帶的估計(jì)位置垂直的線上施加一抗。膜上方的微流體探針的高度為80微米，并且含有稀釋的一抗的處理液的速度為0.1毫米/秒或0.05毫米/秒。根據(jù)處理液的速度，所分配的一抗線的寬度為約50納米至約200微米。在施加一抗期間將膜浸沒封閉溶液(即浸入液)中。將一抗從注射通道注入浸沒液體中和含有hsa條帶的泳道的印跡膜的表面上，與浸沒液體混合的一抗被吸回吸出通道(aspirationchannel)，從而使施加一抗和隨后的去除未結(jié)合的一抗是同時(shí)進(jìn)行的。

在用微流體探針將一抗施加于hsa條帶后，印跡在tbst中洗滌三次，每次持續(xù)5分鐘(共15分鐘)。然后將印跡浸入30μg/ml二抗(1.5mg/mlfitc偶聯(lián)的抗兔小鼠多克隆抗體，在封閉溶液中以1∶50稀釋；jackson目錄號(hào)111-095-003)的溶液中。印跡在tbst中再次洗滌3次，每次持續(xù)5分鐘。如圖9b所示，使用熒光素模式(激發(fā)-藍(lán)色落射光；發(fā)射530/28；曝光時(shí)間1秒)，用bio-radchemidoc^tmmp成像器檢測并成像hsa條帶。圖9c顯示了在圖9b中成像的帶的強(qiáng)度分布(例如，隨著掃描距離變化的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度)。使用imagej軟件(開源)測定強(qiáng)度分布。

圖9b和9c所示的結(jié)果表明，在印跡膜上與靶抗原相鄰的泳道中的光學(xué)可檢測的蛋白質(zhì)(例如，預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物)可用于引導(dǎo)將一抗溶液施加于印跡膜。一抗僅應(yīng)用于泳道的部分。

實(shí)施例5：使用微流體探針和與光學(xué)可檢測的蛋白質(zhì)混合的模型靶抗原的免疫印跡

該實(shí)施例說明了引導(dǎo)將一抗溶液施加于具有轉(zhuǎn)移到其上的光學(xué)可檢測的蛋白質(zhì)和靶抗原的印跡膜的表面。由光學(xué)可檢測的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物引導(dǎo)通過微流體探針施加一抗，所有這些蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物都在印跡膜上相同泳道中。

將具有7gmipg/制備孔的bio-rad4-20％tgx免染^tm蛋白質(zhì)凝膠(目錄號(hào)4568091)用于sds-page。使用hsa蛋白質(zhì)(10mg/mlrockland，目錄號(hào)009-0133)的儲(chǔ)備溶液作為模型靶抗原。hsa在緩沖液中稀釋7500倍。緩沖液包括具有355mm2-巰基乙醇(bio-rad目錄號(hào)161-0710)和pbs的標(biāo)準(zhǔn)利姆里樣品緩沖液(bio-rad目錄號(hào)161-0747)。將稀釋的hsa樣品通過加熱至95℃預(yù)處理10分鐘。對(duì)于凝膠，將400μl加熱的hsa樣品與30μl分子量梯標(biāo)(precisionplusprotein^tmdualcolorstandards，bio-rad目錄號(hào)1610394)混合，并將混合物加載到孔中。使用tris-甘氨酸運(yùn)行緩沖液(25mmtris，109mm甘氨酸，0.1％sds，ph8.3)，使用bio-radtetracell在200v下進(jìn)行電泳分離約40分鐘。電泳分離后，用蒸餾水洗滌凝膠。

凝膠電泳后，從凝膠盒中取出凝膠，使用bio-radtrans-blotturbo系統(tǒng)和在25v下7分鐘的轉(zhuǎn)移時(shí)間，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到低熒光pvdf膜(來自bio-radturbo^tmrtaminilfpvdf轉(zhuǎn)移試劑盒，目錄號(hào)1704274)。pvdf膜先前已經(jīng)通過用99％甲醇處理該膜而被活化。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移后，將pvdf膜浸入、脫脂干燥牛奶封閉劑(bio-rad目錄號(hào)170-6404)、5％tbs緩沖液(目錄號(hào)170-6435)和0.1％吐溫20的封閉溶液(或tbst)中緩慢搖晃1小時(shí)。

使用與hsa相同泳道中的預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物在觀察確定用微流體探針(ibm研究公司，蘇黎世)在哪里向印跡膜施加250μg/ml一抗(用封閉溶液1∶4稀釋的兔抗-hsa多克??；rockland目錄號(hào)600-401-033)。在與標(biāo)記物4和標(biāo)記物5之間的區(qū)域中hsa條帶的估計(jì)位置垂直的線上施加一抗。由于制備孔用于加載預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物和hsa的混合物，獲得標(biāo)準(zhǔn)物和hsa的7cm寬帶，使得用微流體探針多次施加一抗。在圖10a中，隨著掃描線移動(dòng)到探針的實(shí)際路徑的左側(cè)以避免隱藏信號(hào)，顯示探針的路徑。膜上方的微流體探針的高度為80微米，并且含有稀釋的一抗的處理液體的速度為0.05毫米/秒。分配的一抗的線的寬度為約200微米。在施加一抗期間將膜浸入封閉溶液(即浸沒液體)中。將一抗從注射通道注入浸沒液體中和含有hsa條帶的泳道的印跡膜的表面上，與浸沒液體混合的一抗被吸回吸出通道，從而使施加一抗和隨后的去除未結(jié)合的一抗是同時(shí)進(jìn)行的。

在用微流體探針將一抗施加于hsa條帶后，印跡在tbst中洗滌三次，每次持續(xù)5分鐘(共15分鐘)。然后將印跡浸入30μg/ml二抗(1.5mg/mlfitc偶聯(lián)的抗兔小鼠多克隆抗體，在封閉溶液中以1∶50稀釋；jackson目錄號(hào)111-095-003)的溶液中。印跡在tbst中再次洗滌3次，每次持續(xù)5分鐘。如圖10a所示，使用熒光素模式(激發(fā)-藍(lán)色落射光；發(fā)射530/28)，用bio-radchemidoc^tmmp成像器檢測并成像hsa條帶。圖10b顯示了圖10a中成像的帶的強(qiáng)度分布。使用imagej軟件(開源)測定強(qiáng)度分布。

圖10a和10b所示的結(jié)果表明，在印跡膜上與靶抗原相同的泳道中的光學(xué)可檢測的蛋白質(zhì)(例如，預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物)可用于引導(dǎo)將一抗溶液施加于印跡膜。

當(dāng)術(shù)語“包含”及其各種變體例如“包括”和“含有”位于敘述步驟或要素之前的時(shí)候，是用來表示添加其它的步驟或要素是任選的，并且是非排它性的。本說明書中引用的所有專利、專利申請(qǐng)和其它公開的參考材料都通過引用全文結(jié)合入本文中。當(dāng)本說明書的內(nèi)容與本發(fā)明引用的任何參考材料或任何現(xiàn)有技術(shù)之間存在矛盾之處的時(shí)候，以本說明書為準(zhǔn)。所述矛盾之處包括現(xiàn)有技術(shù)對(duì)詞或詞組的定義與本說明書對(duì)相同的詞或詞組明確給出的定義之間的差異。