相關(guān)申請本申請要求于2015年2月20日提交的序列號為62/118,832的美國臨時專利申請的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。本公開大體上涉及允許補償樣品和試劑中固有的背景信號的均相免疫測定法。在特定實施方式中，本公開涉及均相免疫測定法用于檢測對稱二甲基精氨酸(sdma)在生物樣品中的存在或量的用途。
背景技術(shù)：
：均相免疫測定法已被實施用于測定各種分析物，最主要是用于藥物濫用的分析物。sdma已被鑒定為在生物樣品中用作用于評估例如腎功能、心血管功能和sle的標志物。與用于藥物濫用的分析物相比，sdma通常以相對低的濃度存在于生物樣品中。因此，發(fā)明人已確認了在本領(lǐng)域?qū)τ诟_和靈敏的均相免疫測定法的需要，特別是對于在生物樣品中具有低濃度的分析物，諸如sdma。技術(shù)實現(xiàn)要素：在一個方面，本公開涉及對稱二甲基精氨酸(sdma)的軛合物(conjugates)，例如sdma和酶的軛合物。在本公開的一個實例中，軛合物是與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(g6pdh)軛合的sdma。在多個實施方式中，sdma通過5至15個原子的連接子與酶軛合。類似地，sdma可以是通過長度為約5-15埃連接子的酶。本公開的實例軛合物包括以下：在另一方面，本公開涉及包括本公開的軛合物和對游離sdma具有特異性的抗體的組合物。在多個實施方式中，對游離sdma具有特異性的抗體對于不對稱二甲基精氨酸(adma)的反應(yīng)性低于其對游離sdma的反應(yīng)性的25％。類似地，抗體可以與一種或多種選自不對稱二甲基精氨酸(adma)、l-精氨酸和n-甲基精氨酸的化合物沒有或基本上沒有交叉反應(yīng)性。在另一方面，本公開涉及包括本公開的軛合物和對sdma具有特異性的抗體的試劑盒。在多個方面，本公開的試劑盒包括用于在含有分析物的樣品上進行測定的試劑。所述試劑盒可以包括以下組分：(a)用于進行第一次測定的第一組試劑，包括：i.包括抗分析物抗體和酶的信號產(chǎn)生底物的第一試劑，和ii.包括分析物和所述酶的軛合物的第二試劑，和(b)用于進行第二次測定的第二組試劑，包括i.包括所述底物的第三試劑。在所述試劑盒中，第二組試劑可進一步包括包含稀釋劑和緩沖劑中的至少一種的第四試劑。所述第四試劑還可以包括所述軛合物或所述酶。此外，所述試劑盒中的至少一種試劑包括除所述軛合物的酶以外的酶的抑制劑。在一個實施方式中，第一試劑中軛合物的濃度比第四試劑中軛合物濃度高約5至約150倍。所述試劑盒還包括含有在已被去除所述分析物的樣品溶液中稀釋的已知量分析物的標準品。例如，已被去除分析物的樣品溶液可以是經(jīng)分離的血清(strippedserum)、經(jīng)分離的血漿(strippedplasma)或預(yù)處理的樣品。第一試劑和/或第二試劑還可以包括電子介體和染料，第三試劑和/或第四試劑可以進一步包括所述介體和所述染料，其中所述介體從所述底物接受電子并將其轉(zhuǎn)移到所述染料。此外，本公開涉及包括本公開試劑盒的組分和疑似含有sdma的樣品的反應(yīng)混合物。在另一個實施方式中，本公開涉及用于確定游離sdma在樣品中的存在或量的方法。該方法包括使樣品與對游離sdma具有特異性的抗sdma抗體、權(quán)利要求1的軛合物和包含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的底物相接觸，測量nad至nadh的轉(zhuǎn)化，并基于nad至nadh的轉(zhuǎn)化來確定sdma在樣品中的存在或量。在本公開方法的多個實施方式中，測量nad至nadh的轉(zhuǎn)化(conversion)可包括測量nad至nadh的轉(zhuǎn)化率(rateofconversion)。例如，基于nad至nadh的轉(zhuǎn)化來確定sdma在樣品中的存在或量可以包括將nad至nadh的轉(zhuǎn)化率與標準曲線比較，或者測量nad至nadh的轉(zhuǎn)化可包括測量nad至nadh的轉(zhuǎn)化量?；趎ad至nadh的轉(zhuǎn)化來確定sdma在樣品中的存在或量可以還包括將nad至nadh的轉(zhuǎn)化量與標準曲線比較。在本公開方法的另一方面，所述方法包括以下步驟：(a)進行樣品第一反應(yīng)序列，包括：i.通過使樣品與抗分析物抗體、包括分析物和酶的軛合物以及當與所述酶接觸時產(chǎn)生信號的底物相接觸來形成樣品第一反應(yīng)混合物；以及ii.測量來自樣品第一反應(yīng)混合物的信號；(b)進行樣品第二反應(yīng)序列，包括：i.通過使樣品與所述底物相接觸而形成樣品第二反應(yīng)混合物，ii.測量來自樣品第二反應(yīng)混合物的信號；(c)從來自步驟(a)的信號量減去來自步驟(b)的信號量，以提供凈信號，(d)使用凈信號來確定樣品中分析物的量。本公開方法還可以包括以下步驟：(a)進行校準品第一反應(yīng)序列，包括：i.通過將包括已知量分析物的一組校準品中的每個校準品與抗分析物抗體、包括分析物和酶的軛合物以及當與所述酶接觸時產(chǎn)生信號的底物單獨接觸來形成校準品第一反應(yīng)混合物，和ii.測量每個校準品第一反應(yīng)混合物的信號；(b)進行校準品第二反應(yīng)序列，包括：i.通過將一組校準品中的每個校準品與所述底物相接觸來形成校準品第二反應(yīng)混合物，和ii.測量校準品第二反應(yīng)混合物的信號；(c)從來自步驟(b)的信號量減去來自步驟(a)的信號量，以提供每個校準品的凈信號，(d)使用來自兩個或更多個校準品的凈信號來產(chǎn)生標準曲線，(e)通過將來自樣品的凈信號與標準曲線進行比較來確定樣品中分析物的量。在本公開方法的其它實施方式中，所述方法可以包括以下步驟：(a)進行樣品第一反應(yīng)序列，包括：i.通過使樣品與抗分析物抗體、包括分析物和酶的軛合物以及當與所述酶接觸時產(chǎn)生信號的底物相接觸來形成樣品第一反應(yīng)混合物；和ii.測量來自樣品第一反應(yīng)混合物的信號；iii.通過核算(accountingfor)與樣品第一反應(yīng)混合物相關(guān)的背景，來使樣品第一反應(yīng)混合物的反應(yīng)速率標準化(normalizing)，(b)進行樣品第二反應(yīng)序列，包括：i.通過使樣品與所述底物相接觸而形成樣品第二反應(yīng)混合物，ii.測量來自樣品第二反應(yīng)混合物的信號；iii.通過核算與樣品第二反應(yīng)混合物相關(guān)的背景，來使樣品第二樣品反應(yīng)混合物的反應(yīng)速率標準化，(c)從步驟(a)(iii)的標準化速率減去步驟(b)(iii)的標準化速率，以提供含有分析物的樣品的最終反應(yīng)速率，(d)使用最終反應(yīng)速率來確定樣品中分析物的量。本公開方法還可以包括以下步驟：(a)進行校準品第一反應(yīng)序列，包括：i.通過使包括已知量分析物的一組校準品中的每個校準品與抗分析物抗體、包括分析物和酶的軛合物以及當與所述酶接觸時產(chǎn)生信號的底物單獨接觸來形成校準品第一反應(yīng)混合物，和ii.測量來自每個校準品第一反應(yīng)混合物的信號；iii.通過核算與每個校準品第一反應(yīng)混合物相關(guān)的背景，來使每個校準品第一反應(yīng)混合物的反應(yīng)速率標準化，(b)進行校準品第二反應(yīng)序列，包括i.通過使一組校準品中的每個校準品與所述底物相接觸形成校準品第二反應(yīng)混合物，ii.測量來自校準品第二反應(yīng)混合物的信號；iii.通過核算與校準品第二反應(yīng)混合物相關(guān)的背景，來使校準品第二反應(yīng)混合物中的每個校準品的反應(yīng)速率標準化，(c)從來自步驟(a)(iii)的標準化速率減去步驟(b)(iii)的標準化速率，以提供每個校準品的最終反應(yīng)速率，(d)基于每個校準品的最終反應(yīng)速率生成標準化標準曲線，(e)通過將樣品的標準化反應(yīng)速率與標準化標準曲線進行比較來確定樣品中分析物的量。在本公開方法的多個方面，所述樣品和校準品第二反應(yīng)混合物可以包括稀釋劑、緩沖劑和抗分析物抗體中的任何一種或多種。此外，與樣品第一反應(yīng)混合物和/或校準品第一反應(yīng)混合物相關(guān)的背景的核算可以包括從與每個樣品和/或校準品第一反應(yīng)混合物的反應(yīng)速率的確定相關(guān)的多個信號測量中的每一個中減去背景。類似地，與樣品和/或校準品第二反應(yīng)混合物相關(guān)的背景的核算包括從與樣品第二反應(yīng)混合物和/或每個校準品第二反應(yīng)混合物的反應(yīng)速率的確定相關(guān)的多個信號測量中的每一個中減去背景。在本公開方法中，所述樣品可以是生物樣品，諸如血清、血漿、尿液或腦-脊髓液。權(quán)利要求56的方法，其中校準品包括稀釋在血漿或血清中的分析物，包括例如經(jīng)分離的血清或血漿。在另一個實施例中，校準品可以是預(yù)處理樣品。在本公開方法的又一方面，所述樣品和/或校準品第二反應(yīng)混合物還可包含所述軛合物。例如，所述樣品或校準品第一反應(yīng)混合物中的軛合物可以以高于所述樣品或校準品第二反應(yīng)混合物中軛合物濃度的約5至約150倍存在。再者，在本公開方法的其它方面，任何反應(yīng)混合物可以包括除了所述軛合物的酶之外的酶的抑制劑。此外，任何反應(yīng)混合物還可以包括電子介體和染料，其中介體從底物接收電子并將其轉(zhuǎn)移到染料。在另一方面，本公開涉及用于測定動物中的慢性腎臟疾病的方法。所述方法包括根據(jù)本公開方法測定sdma在來自動物的生物樣品中的存在或量，以及基于sdma在樣品中的存在量確定動物中的慢性腎臟疾病。附圖說明圖1示出了本公開的檢測法在來自正常群體和患有慢性腎臟疾病(ckd)的患者的人血清樣品上的結(jié)果。圖2示出了使用sia激活g6pdh以將sdma與g6pdh軛合的過程的示意圖。圖3示出了使用sbap激活g6pdh以將sdma與g6pdh軛合的過程的示意圖。圖4示出了使用smcc激活g6pdh以將sdma與g6pdh軛合的過程的示意圖。圖5是介體-染料反應(yīng)機理的示意圖，其中介體將電子轉(zhuǎn)移到染料以便還原染料并使染料的吸光度發(fā)生偏移。圖6示出了摻入人血清中并根據(jù)本公開方法分析的sdma的校準曲線。圖7示出了摻入人血清中并根據(jù)本公開的固定計算方法和速率計算方法分析的sdma的校準曲線。圖8示出了根據(jù)本公開進行但不減去背景信號的已知濃度sdma的測定結(jié)果。圖9、10和11示出了根據(jù)本公開使用犬科動物(圖9)、貓科動物(圖10)和馬科動物(圖11)的經(jīng)分離的血清校準品的sdma測定的結(jié)果。圖12示出了根據(jù)本公開使用緩沖劑基校準品的sdma測定的結(jié)果。具體實施方式在詳細描述本發(fā)明之前，將定義若干術(shù)語。如本文所使用的，單數(shù)形式“一/一個/一種(a)”、“一/一個/一種(an)”和“所述/該(the)”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另有明確規(guī)定。sdma是對稱二甲基精氨酸。sdma的結(jié)構(gòu)是：盡管sdma的一個或多個氨基酸殘基可以存在于多肽中，但是“游離sdma”是指非多肽鏈的一部分的sdma，包括sdma的鹽。本文所用的術(shù)語“類似物”通常是指可與分析物競爭受體的分析物的修飾形式，所述修飾提供了將分析物連接到另一部分的方法，諸如標記物或固相載體。分析物類似物可以與分析物類似的方式結(jié)合抗體。本文所用的術(shù)語“抗體”通常是指由b淋巴細胞產(chǎn)生的應(yīng)答于對抗原的暴露并特異性結(jié)合該抗原的糖蛋白。術(shù)語“抗體”以其最廣泛的意義使用，并且具體涵蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所需的生物學(xué)活性即可。如本文所用，“抗sdma抗體”、“抗sdma抗體部分”或“抗sdma抗體片段”和/或“抗sdma抗體變體”等包括含有至少一部分免疫球蛋白分子的任何含蛋白質(zhì)或肽的分子，諸如，但不限于重鏈或輕鏈恒定區(qū)的互補性決定區(qū)(cdr)、構(gòu)架區(qū)或其任何部分。本文所用的術(shù)語“抗體片段”是指全長抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合或可變域。具體地，例如，抗體片段可以包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；雙體抗體(diabodies)；線性抗體；單鏈抗體分子；以及來自抗體片段的多特異性抗體。本文所用的術(shù)語“抗原”通常是指能夠在適當條件下與對該抗原具有特異性的抗體反應(yīng)的物質(zhì)。本文所用的術(shù)語“分析物”通常是指樣品中被檢測和/或測量的物質(zhì)或物質(zhì)組。本文所用的術(shù)語“生物樣品”通常是指來自人或動物的組織或液體樣品，包括但不限于全血、血漿、血清、脊髓液(如腦脊髓液)；淋巴液，腹液(腹水)，皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外部部分，眼淚，唾液，尿液，血細胞，腫瘤，器官，組織和體外細胞培養(yǎng)成分的樣品。本文所用的術(shù)語“交叉反應(yīng)性”通常是指抗體的單個抗原結(jié)合位點與多于一種抗原決定因子(determinant)反應(yīng)的能力或抗體分子群體與多于一種抗原反應(yīng)的能力。一般來說，交叉反應(yīng)是因為：(i)交叉反應(yīng)抗原與免疫抗原共有表位，或(ii)其具有與免疫抗原上的表位結(jié)構(gòu)相似的表位(多特異性)。本文所用的術(shù)語“標記(label)”是指可以直接或間接地與分析物類似物(例如，sdma類似物)軛合(例如，經(jīng)由共價或非共價方式，單獨或封裝(encapsulated))的可檢測的化合物或組合物。例如，酶標記可以催化可檢測的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。本公開中使用的酶可以是但不限于：堿性磷酸酶(ap)；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(“g6pdh”)；β-半乳糖苷酶(bgal)；和辣根過氧化物酶(hrp)，蘋果酸脫氫酶(mdh)。對酶的任何表述(諸如本文中的“g6pdh”或“葡萄糖-6-磷酸脫氫酶”)還包括該酶的變體、同種型和突變體，例如us6,455,288中所述的具有氨基酸取代的g6pdh，該專利的全部內(nèi)容通過引用并入本文。標記的使用會產(chǎn)生可通過諸如電磁輻射或直接視覺觀察的方式檢測并且可任選被測量的信號。本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”通常是指從基本同種的抗體群體獲得的抗體，即組成群體的單個抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原位點。與通常包括針對不同表位的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每個單克隆抗體針對抗原上的單個表位。修飾語“單克隆”僅指抗體的特征，而不應(yīng)被解釋為需要通過任何特定方法生產(chǎn)抗體。具體地，例如，單克隆抗體可以通過雜交瘤方法制備，或者可以通過重組dna方法制備，或者可以使用已知技術(shù)從噬菌體抗體庫分離。本文所用的術(shù)語“多肽”通常是指具有通過肽鍵連接的氨基酸序列的分子。該術(shù)語包括蛋白質(zhì)、融合蛋白、低聚肽、環(huán)肽和多肽衍生物?？贵w和抗體衍生物在上文分開的部分中討論，但為了本公開的目的，抗體和抗體衍生物被視為多肽和多肽衍生物的亞類。“受體”是指能夠識別分子的特定空間和極性機構(gòu)(例如表位或決定位點)的任何化合物或組合物。示例性受體包括抗體，fab片段等?！敖Y(jié)合特異性”或“特異性結(jié)合”是指第一分子對第二分子的實質(zhì)性識別，例如分析物，諸如sdma，以及多克隆或單克隆抗體，或?qū)Ψ治鑫锞哂刑禺愋缘目贵w片段(例如，fv、單鏈fv、fab'或f(ab')2片段)。例如，本文使用的“特異性”通常是指單個抗體結(jié)合位點僅與一種抗原決定因子反應(yīng)的能力或抗體分子群體與僅一種抗原反應(yīng)的能力。一般來說，分析物-抗體反應(yīng)中具有高度的特異性?？贵w可以區(qū)分以下中的區(qū)別：(i)分析物的一級結(jié)構(gòu)，(ii)分析物的異構(gòu)體形式，和(iii)如果適用的話，分析物的二級和三級結(jié)構(gòu)。表現(xiàn)出高特異性的抗體-分析物反應(yīng)顯示低交叉反應(yīng)性?！皩嵸|(zhì)結(jié)合”或“基本結(jié)合”是指在特定測定條件下在測定混合物中的分子之間的特異性結(jié)合或識別的量。在其最廣泛的方面，實質(zhì)結(jié)合涉及第一分子不能結(jié)合或識別第二分子與第一分子能結(jié)合或識別第三分子之間的差異，使得該差異足以允許進行在一組特定測定條件下區(qū)別特異性結(jié)合的有意義的測定，所述一組特定測定條件包括分子的相對濃度和培育的時間和溫度。在另一方面，當在一組特定測定條件下第一分子表現(xiàn)出對第二分子的反應(yīng)性低于其表現(xiàn)出的對第三分子的反應(yīng)性的25％，例如低于20％、低于15％、低于10％、低于5％或低于1％時，一個分子在交聯(lián)反應(yīng)性意義上基本不能結(jié)合或識別另一分子?？梢允褂萌舾杀娝苤姆椒y試特異性結(jié)合，例如，免疫組織化學(xué)測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、放射免疫測定(ria)或western印跡測定。本文所用的術(shù)語“鹽”是指在化合物的酸和堿性官能團之間形成的鹽。示例性的鹽包括但不限于硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽，酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖酸鹽，糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽(即，1,1'-亞甲基-二-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))。術(shù)語“鹽”還指在具有酸官能團(諸如羧酸官能團)的化合物與無機或有機堿之間形成的鹽。合適的堿包括但不限于堿金屬諸如鈉、鉀和鋰的氫氧化物；堿土金屬諸如鈣和鎂的氫氧化物；其他金屬諸如鋁和鋅的氫氧化物；氨和有機胺，諸如未取代或羥基取代的單-、二-或三烷基胺；二環(huán)己胺；三丁胺；吡啶；n-甲基、n-乙基胺；二乙胺；三乙胺；單-、雙-或三-(2-羥基-低級烷基胺)，諸如單-、雙-或三-(2-羥乙基)胺，2-羥基-叔丁胺或三-(羥甲基)甲胺，n,n，-二低級烷基-n-(羥基低級烷基)胺，諸如n,n，-二甲基-n-(2-羥乙基)胺或三(2-羥乙基)胺；n-甲基-d-葡糖胺；和氨基酸諸如精氨酸、賴氨酸等?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)向本公開，一般來說，本公開涉及以解決與除分析物之外的樣品和試劑組分相關(guān)的背景信號的方式對樣品中的分析物進行免疫檢測。例如，除分析物之外的樣品組分可以相互反應(yīng)或與用于測定的試劑的組分反應(yīng)。這種反應(yīng)可能導(dǎo)致干擾檢測方法的準確性。眾所周知生物樣品包含許多能在測定中產(chǎn)生背景噪音的成分?？梢允褂没趀mit(酶放大免疫測定技術(shù))均相免疫測定系統(tǒng)的改進測定來分析樣品。在傳統(tǒng)的測定中，將含有分析物的樣品與抗分析物抗體、分析物和酶的軛合物以及當與該酶接觸時產(chǎn)生信號的底物相接觸?？贵w與軛合物的結(jié)合抑制或降低酶活性。當分析物存在于樣品中時，樣品分析物與軛合分析物競爭以結(jié)合抗體，這導(dǎo)致從酶/底物生成更多的信號。當不存在分析物時，抗體和軛合物之間可能會發(fā)生更多的結(jié)合，從而限制或防止信號生成。因此，當存在更多的分析物時會生成更多的信號。動力學(xué)測定可以使用信號生成率作為樣品在分析物中的存在或量的指標。在本公開的一個方面，傳統(tǒng)的emit測定格式在分析物和校準品兩者的第一反應(yīng)序列中進行。為了方便起見，本第一反應(yīng)序列可以在本文中被識別為“顯色測定”。然后，在本公開的改進測定中，在樣品和校準品的第二反應(yīng)序列中進行第二和單獨的測定。為方便起見，本文將第二反應(yīng)序列識別為“空白測定”。空白測定的試劑不含抗分析物抗體，且通常不含軛合物。因此，空白測定提供了與樣品相關(guān)的背景信號。在多個方面，公開涉及在兩種示例性方法中使用信號來確定分析物的濃度。為了方便起見，示例性方法在本文中稱為“速率”方法和“固定”方法。在兩種方法中，使用顯色和空白測定中的信號量或信號之間的差異。在一個方面，如本領(lǐng)域熟知的那樣，信號被測量為酶/底物系統(tǒng)在特定波長處的吸光度。例如，測量g6pdh/nad酶/底物系統(tǒng)在340nm處的吸光度將提供在g6pdh存在下nad至nadh的相對轉(zhuǎn)化量的值。該值可用于提供反映酶所致的底物轉(zhuǎn)化的凈信號(對于固定方法)或反應(yīng)速率(reactionrate)(對于速率方法)。作為可選的，酶底物反應(yīng)可以與介導(dǎo)在底物和多種電子受體(例如，染料)之間的電子轉(zhuǎn)移的電子載體聯(lián)合使用，這將允許在不同于底物的波長下測量反應(yīng)速率。在固定方法中，計算凈信號。在一個實施方式中，凈信號基于在預(yù)定終點處的顯色和空白測定之間的信號差異(例如，吸光度)，其可以是或不是通過全部底物的耗盡來完成反應(yīng)。在空白和顯色測定的終點處測量的信號的差異量可以用于提供凈信號(例如，凈信號＝[顯色信號量]-[空白信號量])?；蛘?，對于顯色和空白測定兩者，均可以確定它們在預(yù)定起始點t1(可以在完成所有試劑的混合時或混合后的另一個預(yù)定時間)和預(yù)定終止點(t2)之間的信號量的差異。然后可以使用來自這些確定的信號量的差異來確定凈信號(例如，凈信號＝([t2顯色]-[t1顯色])-([t2空白]-[t1空白]))?？梢詫粜盘柵c校準曲線進行比較，以確定樣品在分析物中量。當基于來自顯色和空白測定中的每一個的單次測量來計算凈信號時，可以在試劑具有足夠的時間進行反應(yīng)之后進行測量。例如，可以在所有試劑混合后的約30秒至約10分鐘進行每個測定中的單次測量。更具體地，單個測量可以在所有試劑混合后的30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、390、420、450、480、510、540、570和600秒鐘之一時進行。當在空白和顯色測定中的每一個測量兩個信號時，在測定開始(樣品和所有試劑混合)后的約15秒至2分鐘之后進行第一次測量(t1)。這個時間可以根據(jù)試劑的濃度和樣品的預(yù)期濃度進行調(diào)整。特別地，t1可以是在所有試劑混合后的15、30、45、60、75、90、105或120秒。第二次測量(t2)可是t1后的15秒至幾分鐘。例如，t2可以是在第一次測量(t1)之后的例如15秒、18秒、30秒、45秒或1、2、3、4或5分鐘。在速率方法中，以確定的時間間隔從顯色測定的信號中減去來自空白測定的信號以提供反應(yīng)速率。校準品的反應(yīng)速率用于提供校準曲線，其可用于通過將在樣品上的測定的反應(yīng)速率的曲線與校準曲線進行比較來確定樣品在分析物中的量。在速率方法中，反應(yīng)速率可以通過在酶介導(dǎo)的反應(yīng)期間在多個時間點測量信號(例如，吸光度)來確定?？紤]試劑的濃度和測定的溫度的信號測量的時間和間隔的確定屬于本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。例如，速率可以如下測定：于在室溫在樣品(或校準品)和所有試劑混合后約2-10分鐘開始測量吸光度，并且在另外的1-15分鐘內(nèi)每5-60秒再進行測量。反應(yīng)速率可以表示為吸光度隨時間的變化。例如，可以在將樣品(或校準品)和所有試劑混合后約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分鐘開始測量吸光度。通常在約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分鐘內(nèi)以5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒的間隔測量吸光度。這些時間可以延長或縮短，這取決于反應(yīng)條件、分析物和試劑。在固定或速率方法中，來自樣品第一反應(yīng)混合物的背景可以在計算凈信號或反應(yīng)速率時核算以提供標準化信號。在一個實施方式中，從用于代替樣品的校準品基質(zhì)測量背景吸光度。最初在所有試劑與基質(zhì)的混合之后或其后的有限時間之后測量校準品基質(zhì)的吸光度。校準品基質(zhì)可以是缺少任何分析物的校準品或?qū)φ栈旌衔?。例如，缺少分析物的校準品基質(zhì)可以是通過透析或如本文進一步描述的另一預(yù)處理方法已去除分析物的樣品。在一個實施方式中，經(jīng)分離的或內(nèi)源性物種特異性或非特異性血清、血漿或其他生物體液可用作校準品基質(zhì)。在本文進一步描述的其它實施方式中，校準品基質(zhì)可以是水或含有蛋白質(zhì)和/或其它組合物的稀釋劑(例如，pbs中的bsa)。校準品基質(zhì)用于在顯色測定和空白測定中代替樣品，以提供兩個測定的背景信號。如果已經(jīng)確定了背景，則從固定方法(或t1和t2時的測量)的凈信號中或從用于確定速率方法中的樣品反應(yīng)速率的每個測量中減去背景。例如，在速率方法中，從用于確定樣品的反應(yīng)速率的每個吸光度測量(即，吸光度隨時間變化)中減去校準品基質(zhì)(和試劑)的吸光度。在另一方面，以與樣品反應(yīng)速率相似的方式測定背景速率。然后從樣品反應(yīng)速率中減去背景速率，以提供第一樣品反應(yīng)混合物的標準化反應(yīng)速率。因此，本公開涉及用于進行分析物測定的方法。所述方法包括通過形成包括樣品、抗分析物抗體、包含分析物和酶的軛合物以及當與所述酶接觸時產(chǎn)生信號的底物的樣品第一反應(yīng)混合物，來對樣品進行顯色測定(樣品第一反應(yīng)序列)。通常，樣品第一反應(yīng)混合物通過如下方式形成：首先使樣品與抗體和底物相接觸，然后在第二步中加入軛合物。然而，樣品可以先與抗體和軛合物組合，并且在第二步中加入底物。在一個方面，酶和軛合物保持分開，直到反應(yīng)序列準備好開始。除非本文另有說明，本文所用的“接觸”在其最廣泛的方面以任何順序組合試劑。一旦樣品第一反應(yīng)混合物已經(jīng)形成，可以在混合后立即或在其后的一個或多個預(yù)定時間之后測量信號量用于本公開的固定或速率方法。在本公開的改進的固定和速率方法中，以與樣品第一反應(yīng)序列相似的方式進行單獨的測定序列(樣品第二反應(yīng)序列或“空白測定”)。然而，樣品第二反應(yīng)序列的試劑不含抗分析物抗體。通常，空白測定的試劑不含軛合物，但是在此描述了其中加入少量軛合物或酶的實施方式。特別地，通過使樣品與底物相接觸形成樣品第二反應(yīng)混合物，在一些情況下，與軛合物接觸但沒有抗分析物抗體。測量來自樣品第二反應(yīng)混合物的信號。以與樣品第一反應(yīng)序列相同的方式確定使用來自校準品基質(zhì)的背景的凈信號或反應(yīng)速率，以提供樣品第二反應(yīng)序列的標準化凈信號或標準化反應(yīng)速率。在速率方法中，為了提供樣品的最終反應(yīng)速率，從樣品第一反應(yīng)序列的標準化反應(yīng)速率中減去樣品第二反應(yīng)序列的標準化速率。最終反應(yīng)速率可用于確定樣品在分析物中的存在或量。通常，這通過將樣品的最終反應(yīng)速率與標準曲線進行比較來完成，該標準曲線可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制作。用于校準品的顯色和空白測定可以以類似于樣品的顯色和空白測定的方式進行。因此，通過將包括已知量的分析物的一組校準品中的每個校準品與抗分析物抗體、包括分析物和酶的軛合物以及當與所述酶接觸時產(chǎn)生信號的底物相接觸形成校準品第一反應(yīng)混合物，從而進行一系列的校準品第一反應(yīng)序列(顯色測定)。測量來自每個校準品第一反應(yīng)混合物的信號，并且通過以上述用于樣品第一反應(yīng)混合物的方式核算與每個校準品第一反應(yīng)混合物相關(guān)的背景來生成每個校準品第一反應(yīng)混合物的標準化凈信號(固定方法)或標準化反應(yīng)速率(速率方法)。其中一個校準品可以是用于確定背景的校準品基質(zhì)(其不包括分析物)。在分開的反應(yīng)序列(空白分析)中，校準品第二反應(yīng)序列通過形成校準品第二反應(yīng)混合物來進行，所述校準品第二反應(yīng)混合物通過組校準品組中的每個校準品在不存在抗分析物抗體和特別是軛合物的情況下與底物相接觸來形成。在一些情況下，軛合物也可以存在，通常以如本文進一步描述的少量存在。對于每個校準品第二反應(yīng)混合物測量信號，并且通過以上述方式核算與校準品第二反應(yīng)混合物相關(guān)的背景，對每種混合物的凈信號或反應(yīng)速率進行標準化。因此，在計算固定方法中的背景信號時，從顯色測定的標準化凈信號中減去來自空白測定的標準化凈信號。在速率方法中，通過從校準品第一反應(yīng)序列中的每個校準品的標準化速率中減去校準品第二反應(yīng)序列中的校準品的標準化速率來確定每個校準品的最終反應(yīng)速率。然后可以基于每個校準品的最終反應(yīng)速率來制作標準化標準曲線，并將其用于將樣品的標準化反應(yīng)速率與標準化標準曲線進行比較來確定樣品在分析物中量。在一個實施方式中，與顯色測定和空白相關(guān)的試劑在表1中示出。將試劑在適當?shù)南♂寗┖?或緩沖液中合并。如表1所示，空白測定試劑2(r2)不含軛合物，盡管其可以如本文進一步描述的那樣存在，以確保反應(yīng)具有適當體積的緩沖液。在某些方面，空白測定r1可能在未使用空白測定r2的情況下具有額外的體積。在一個實施方式中，用于顯色測定的試劑與用于空白測定的試劑相同，除了存在或不存在抗體和軛合物。當r2在空白測定中不含有任何軛合物時，它仍然含有稀釋劑、緩沖液和其它用于顯色測定的組分。表1在一些實施方式中，空白測定r1還可以含有抗分析物抗體。由于加入到反應(yīng)混合物中的分析物-酶軛合物，顯色測定中的校準品和測試樣品通?？梢灶A(yù)期地引起吸光度的增加。當在空白測定中進行測試時，許多樣品也產(chǎn)生陽性反應(yīng)，因為與內(nèi)源底物或與r1底物反應(yīng)的內(nèi)源酶即使沒有軛合物存在下也將引起吸光度的增加。然而，通常將樣品和校準品稀釋到通常較小的背景信號被進一步削弱的程度，使得當在空白測定中測試時，反應(yīng)混合物在吸光度上幾乎不引起變化。因為吸光度的變化可能會低于檢測器的靈敏度范圍，所以會導(dǎo)致自動分析儀的校準曲線失效。為了避免這個問題，可以將酶或分析物-酶軛合物加入到空白測定中以確保產(chǎn)生小的吸光度的陽性的變化(不管校準品或樣品行為如何)。因此，表2示出了本實施方式中存在的試劑。表2r2中酶或軛合物的濃度通常保持較低，以防止在校準品基質(zhì)的測定中不必要的噪音。例如，當酶是g6pdh時，可以將約1-15ng/ml的酶(結(jié)合或未結(jié)合)加入到空白測定中。特別地，可以加入約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15ng/ml。r2中軛合物的量取決于分析物的大小，因為較大的分析物需要較大量的軛合物以提供相同量的酶。在一個實施方式中，用于顯色測定的r2中酶(單獨或結(jié)合的)的濃度比空白測定的r2中酶的濃度高約10至約150倍。在各種實施方方式中，在顯色測定中軛合物的濃度比酶在用于空白測定的試劑中的濃度高10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140和150倍。當結(jié)合時，酶的活性通常小于未結(jié)合的酶的活性。例如，結(jié)合酶的活性與未結(jié)合酶的活性差異很大，例如，結(jié)合酶的活性為未結(jié)合的酶的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。因此，當未結(jié)合的酶用于空白測定的r2中時，其可以以比結(jié)合時少的量使用，并且仍然提供與結(jié)合酶相同的活性。當酶具有多于一種底物時，底物或多種底物可以過量存在于試劑中。在一些方面，測定試劑可以包括測定試劑的穩(wěn)定劑。例如，當信號產(chǎn)生酶是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(g6pdh)時，可將葡萄糖-6-磷酸鹽(g6p)或nad加入含有軛合物的試劑中以穩(wěn)定酶-分析物軛合物。血清含有幾種有助于背景的酶。因此，向試劑稀釋劑中添加特異性酶抑制劑可以進一步提高測定精度。抑制劑有助于消除顯色和空白測定中的一部分干擾噪聲。因此，在各個方面，反應(yīng)組分可以包括內(nèi)源性樣品酶的抑制劑。例如，已知草氨酸鈉是乳酸脫氫酶(ldh)的抑制劑，后者是nad和/或nadp的酶。草氨酸鈉通過阻止ldh轉(zhuǎn)換樣品中或可能是與測定相關(guān)的酶-底物系統(tǒng)的一部分(例如，g6pdh/nad)的nad來防止與內(nèi)源性樣品ldh相關(guān)的背景信號。超過三十種血清酶和酶抑制劑組合是已知的，并且抑制劑可用于其中許多。在一個方面，校準品包括已知量的分析物(或者校準品基質(zhì)中不含有)在去離子水或鹽水中以提供用于代替樣品的校準品基質(zhì)。在其它方面，使用經(jīng)分離的血清代替水或鹽水。透析的血清是天然的、物種特異性的或非特異性的血清或血漿，其已經(jīng)在例如透析過程中將分析物去除。已知多種其它樣品預(yù)處理方法可以除去或鈍化分析物。在這些實施方式的每一個中，將溶液用已知量的分析物摻入以提供一系列超過樣品在分析物中預(yù)期濃度范圍的校準品。在另一個實施方式中，校準溶液是蛋白質(zhì)基的溶液，諸如1-7％bsa在pbs中。在該實施方式中，可能需要將bsa校準品校準為經(jīng)分離和加標的血清校準品。通常，因為空白測定旨在補償內(nèi)源性蛋白質(zhì)、酶或有助于背景信號的其它大分子組分，水或鹽水更適用于非生物樣品，盡管在許多情況下使用水或鹽水作為生物樣品的校準品溶液可獲得足夠的特異性。此外，在自動分析儀中使用水或鹽水緩沖液用于校準品基質(zhì)可能具有為校準品基質(zhì)產(chǎn)生錯誤信息的傾向，因為與使用緩沖液相關(guān)的反應(yīng)速率可導(dǎo)致相比于血清的顯著增加的反應(yīng)速率。在這種情況下，減去校準品基質(zhì)的吸光度值可能導(dǎo)致負的速率。雖然這些速率可以針對血清校準品基質(zhì)進行標準化，但在這種情況下，自動分析儀通常會產(chǎn)生錯誤信息。根據(jù)本公開的一個實施方式，分析物是sdma，且酶-軛合物系統(tǒng)是g6pdh/nad。在該實施方式中，將sdma的類似物與g6pdh結(jié)合并用作顯色和空白測定中的軛合物，以確定來自動物諸如人、貓和狗的血清或血漿樣品中sdma的存在或量。在該實施方式的一個方面，通過將已知量的sdma與校準品基質(zhì)(經(jīng)分離的血清或血漿)組合來制備校準品。如上所述使用如表3所示的示例性量的以下試劑進行顯色和空白測定：表3特別地，抗sdma抗體在顯色測定的r1中可以具有的濃度為約4至約10μg/ml，例如，約4、5、6、7、8、9或10μg/ml。在顯色測定或空白測定的r1中，g6p和nad可以具有約8–75mm，更特別地約10–65mm或約20–55mm，更特別地約8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70mm的濃度。在顯色測定的r2中，sdma-g6phd軛合物可以具有約0.25至約0.75μg/ml，更特別地約0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.65、0.70或0.75μg/ml的濃度。在空白測定的r2中，軛合物的濃度可以為約5–30ng/ml，更特別地約5、10、15、20、25或30ng/ml。g6p存在于r2試劑中以穩(wěn)定酶。或者，可以使用nad。穩(wěn)定底物是任選的。盡管可以調(diào)節(jié)體積以適應(yīng)不同的分析物和反應(yīng)條件，但是試劑可以與樣品和校準品以下列體積混合用于顯色和空白測定。樣品：5-20μlr1：20-60μlr2：20-150μl在一個具體的實施方式中，反應(yīng)混合物含有10μl的樣品、40μl的r1和125μl的r2。在顯色和空白測定中使用上述試劑，可以制作校準曲線并用于確定血清或血漿樣品中sdma的存在或量。圖1示出了使用速率方法用beckman臨床化學(xué)分析儀測定正常和慢性腎臟疾病人血清樣品中sdma的結(jié)果。結(jié)果顯示了與金標準lc-ms值相比的sdma濃度的準確測定。使用人血清(未經(jīng)分離)作為校準品基質(zhì)。因此，本公開涉及確定動物包括人和例如家畜、農(nóng)場和動物園動物中的慢性腎臟疾病的方法。所述方法包括根據(jù)本公開的方法確定來自動物受試者的生物樣品中的sdma濃度，并將濃度與標準曲線或其他模型比較，其中樣品中的sdma的量來自與健康受試者和患有慢性腎臟疾病的受試者的相同物種。在一個實施方式中，公開涉及包括用于確定樣品在分析物中存在或量的試劑的試劑盒。例如，試劑盒可以包括用于進行顯色測定的第一組試劑，諸如包括抗分析物抗體和酶的信號產(chǎn)生底物的第一試劑，以及包括分析物和所述酶的軛合物的第二試劑。試劑盒還可以包括第二組試劑，其包括含有底物的第三試劑。第二組試劑還可以包括含有緩沖液/稀釋劑和任選的所述軛合物的第四試劑。僅含緩沖液/稀釋劑的第四試劑的目的是確保與第二組試劑相關(guān)的反應(yīng)以適當?shù)捏w積進行。當?shù)诙M試劑不包括第四試劑時，應(yīng)相應(yīng)地調(diào)整第三試劑的體積。此外，第三或第四試劑可以含有抗分析物抗體。每種試劑中組分的濃度和量可以如上文對于顯色和空白測定中的每一個中的r1和r2所述。例如，第一試劑中軛合物的濃度比第四試劑中軛合物的濃度高約5至約150倍。在一個方面，試劑盒中的至少一種試劑包括除了軛合物的酶之外的酶的抑制劑。試劑盒還可以包括標準品或一組標準品(校準品)，其包括在合適的稀釋劑，諸如水、鹽水或經(jīng)分離或加工的血清或血漿(例如，預(yù)處理的樣品)中稀釋的已知量的分析物。當分析物是sdma時，示例性試劑盒在第一試劑中包括抗sdma抗體(多克隆或單克隆)和底物，諸如nad和g6p。第二試劑包括sdma類似物和g6pdh的軛合物作為酶的穩(wěn)定劑。第三試劑包括sdma-g6pdh軛合物和任選的第四試劑。第四試劑可以僅含有稀釋劑或緩沖液，或者其可以含有所述軛合物。除了試劑盒之外，本公開涉及包括試劑盒的試劑和疑似含有sdma的樣品的反應(yīng)混合物。例如，反應(yīng)混合物可以包括樣品或校準品、抗sdma抗體、sdma-g6pdh軛合物、nad和g6p。在本公開的試劑盒、方法和反應(yīng)混合物中的每一個中，可以使用許多酶/底物系統(tǒng)代替g6pdh/nad。作為另一個實例，蘋果酸脫氫酶是類似于g6pdh的使用nad+到nadh的還原來催化蘋果酸到草酰乙酸的氧化的酶。此外，已知許多酶突變體可增強酶的信號或穩(wěn)定性。參見例如第6,455,288號美國專利。分析物-酶軛合物可以通過多種已知方法制備。所用方法和試劑的選擇可以提供分析物和酶之間各種長度的連接子。連接子長度可以影響抗體抑制酶活性的能力，從而影響測定靈敏度。通常，可以使用約5-15個原子或2-20埃的連接子。對于根據(jù)本公開可檢測的許多分析物，酶與分析物的結(jié)合屬于本領(lǐng)域的普通技術(shù)。例如，圖2示出了式1的sdma類似物(如下)與葡萄糖-6-脫氫磷酸酶(g6pdh)的軛合物。結(jié)合前，g6pdh被琥珀酰亞氨基碘乙酸酯(sia)活化。使用sia的活化導(dǎo)致sdma和酶(-c-c-s-c-c(o)-)之間的五個原子的連接子，其不包括在sdma衍生過程中由氮替代氧導(dǎo)致的sdma上的非原生氮。圖3示出了使用3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亞胺酯(sbpa)將式1的sdma類似物與g6pdh軛合產(chǎn)生了9個原子的連接子(不計非原生氮)(-c-c-s-c-c(o)-c-n-c-c(o)-)。圖4示出了使用磺基琥珀酰亞胺基-4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(smcc)將式1的sdma類似物與g6pdh的軛合產(chǎn)生了12個原子連接子?？梢酝ㄟ^用其它試劑修飾g6pdh或在軛合反應(yīng)中使用其它sdma類似物來調(diào)整連接子的長度，以提供例如約5至約15個原子，特別是約5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個原子的連接子長度。因此，本公開涉及通過5-15個原子的連接子的sdma和酶的軛合物，其僅包括經(jīng)過最短路徑而直接在連接子鏈中的那些原子，其排除了不是sdma和酶之間最短路徑的部分的連接子分子中的側(cè)鏈、取代基或環(huán)的原子。連接子長度可以在約2埃至約20埃的范圍內(nèi)，特別是約5至約15埃，更特別地約6-10埃。在一個實施方式中，在g6pdh底物葡萄糖-6-磷酸鹽(g6p)和/或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)存在下，將sdma與g6pdh軛合。通過調(diào)節(jié)酶、底物和sdma的比例可以獲得最佳的軛合物-酶活性和抗體對該活性的抑制。適用于與g6pdh軛合的sdma的幾個類似物描述于第8,481,690號美國專利中，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。取決于sdma和g6pdh之間的連接子的期望長度，可以使用以下類似物之一：其中x和y是1至5的整數(shù)。式a、b和c提供可與包括適當“硫醇反應(yīng)性位點”(即，將于硫醇基團反應(yīng)的位點)的軛合靶反應(yīng)的可用硫醇。例如，馬來酰亞胺、烷基和芳基鹵化物以及α-鹵代?；强膳c硫醇反應(yīng)形成硫醚的說明性硫醇反應(yīng)性位點。類似地，吡啶基二硫化物可以與硫醇反應(yīng)形成混合二硫化物。用sia、sbap或smcc活化的g6pdh提供了適當?shù)牧虼挤磻?yīng)位點。當x＝1時，式a與sia活化的g6pdh的軛合提供了在sdma和g6pdh之間五個原子的連接子。式a(x＝1)與smcc的軛合產(chǎn)生十二個原子的連接子。其它連接子長度可以通過變化x來獲得。在x＝1的一個具體實施方式中，sdma類似物具有以下結(jié)構(gòu)式(式1)：式1可以由sdma(可從emdchemicalsinc.，gibbstown,nj商購獲得)通過以下說明性合成方案制備(1)：方案1：通過使sdma與二碳酸二叔丁酯(boc2o)反應(yīng)來保護sdma的一級和二級氨基結(jié)構(gòu)。然后將得到的叔丁氧基羰基(boc)保護的sdma((boc3)-sdma，1)與樹脂連接。例如，(boc3)-sdma(1)可以通過使(boc3)-sdma(1)與樹脂在2-(1h-7-氮苯并三氮唑-1)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸甲銨(hatu)和n,n-二異丙基乙胺(dipea)的存在下在二甲基甲酰胺(dmf)中接觸而連接到半胱胺-4-甲氧基三苯甲基樹脂(emdchemicals,inc.,gibbstown,nj)以提供樹脂結(jié)合(boc3)-sdma胱酰胺(2)。除去樹脂結(jié)合(boc3)-sdma胱酰胺(2)上的boc保護基團，并使用例如在二氯甲烷中的三氟乙酸從樹脂上切除所得樹脂結(jié)合的sdma胱酰胺，以得到sdma胱酰胺(3)，其通過與鹽酸反應(yīng)轉(zhuǎn)化為鹽酸鹽(4)。傳統(tǒng)的emit測定通過監(jiān)測在340nm處的吸光度來測量nadh(或nadph)的積累。在本公開的另一個實施方式中，向試劑中加入變色染料和電子介體可以允許測量不同于340nm處的吸光度的吸光度。在一個具體實例中，染料是3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四唑溴化物(mtt)，且介體是1-甲氧基吩嗪甲硫酸鹽(pms)。如圖5所示，pms從nadp中吸收電子并將其轉(zhuǎn)移到mtt，這還原了mtt以提供在約650nm處的吸光度?？箂dma抗體可以是如第8,481,690號美國專利所述的多克隆或單克隆的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知制備多克隆和單克隆抗體的方法。在一個實施方式中，抗體是針對具有以下結(jié)構(gòu)的sdma-klh軛合物產(chǎn)生的單克隆抗體：在各方面，用于本公開的改進的測定中的抗sdma抗體可以對sdma具有高特異性，并且與一種或多種選自不對稱二甲基精氨酸(adma)、l-精氨酸和n-甲基精氨酸的化合物沒有或基本上沒有交叉反應(yīng)性。例如，抗sdma抗體對adma、l-精氨酸和n-甲基精氨酸具有低于在一組特定的測定條件下其對sdma的反應(yīng)性的25％、低于20％、低于15％、低于10％、低于5％或者低于1％的反應(yīng)性。所有上述組分可用于確定樣品中游離sdma的存在或量的方法。例如，方法包括使樣品與抗sdma抗體、包括sdma和g6pdh的軛合物以及包括nad和g6p的底物相接觸。如本文所述，測量nad至nadh的轉(zhuǎn)化率，并將其與標準曲線進行比較，以確定樣品中sdma的存在或量。如本文所述，sdma與如本文所述具有5-15個原子的連接子(2-10埃)的g6pdh軛合。抗sdma抗體可以是對于adma、l-精氨酸和n-甲基精氨酸沒有反應(yīng)性或基本上沒有反應(yīng)性的單克隆抗體在另一個實施例中，本發(fā)明涉及一種用于確定在樣品中的sdma的方法，所述方法包括衍生游離sdma并使用針對該衍生物的抗體。例如，第2004/0214252號美國專利公開(其全部內(nèi)容通過引用并入本文)描述了修飾sdma的胍基氮的方法和修飾的sdma的抗體。因此，在一個實施方式中，樣本中的sdma在根據(jù)本文的公開內(nèi)容的方法確定之前被修飾。在該實施方式中，抗sdma抗體應(yīng)結(jié)合修飾的sdma和軛合物的sdma，后者也可以是被修飾的具有足夠的親和力以提供合適的測定。實施例實施例1：經(jīng)分離的血清的制備將未處理的商業(yè)的犬科血清(500ml)裝載到兩英尺snakeskintm透析管(3.5kmwco，35mmdryi.d.)(thermoscientific)，并在4℃下對著帶有20g碳粉的pbs緩沖液(20l)透析至少6小時。通過更換緩沖液和碳重復(fù)三次該過程。在透析之前和之后通過lc/ms測量血清中的sdma濃度。在透析前的血清中，sdma為9.89μg/dl。透析后，sdma為0.02μg/dl。將用經(jīng)炭分離的犬科血清儲存在-80℃?zhèn)涫褂?。實施?：sdma標準品制備將sdma.hc1(chembio)溶解在去離子水中至最終的sdma濃度為1000μg/ml。將200μlsdma水溶液加入到10ml經(jīng)分離的血清中，使最終儲備溶液具有20μg/ml的sdma濃度。溶液儲存在-80℃。將280μlsdma儲備溶液轉(zhuǎn)移到10ml經(jīng)分離的血清中，以制備56μg/dl的標準sdma。通過連續(xù)地在經(jīng)分離的血清中稀釋儲備溶液以制備其它sdma標準品，提供28.0、14.0、7.0和3.75μl/dl的溶液。這些標準品可以通過lc/ms驗證。實施例3：稀釋劑的制備稀釋劑制劑r1和r2含有表4中標明的組分。草氨酸鈉是本文它處所述的可選組分。表4稀釋劑制備方案r1稀釋劑(1l比例)。將以下組分加入到500ml去離子水中：10gbsa50ml1mtris，ph8.00.372gedta鈉4mlbrij-35(30％)4mlproclin1500.96gpeg600017.6gnacl10ml小鼠血清1.665g草氨酸鈉(可選)使用攪拌棒以低速充分混合該溶液。一旦粉末完全溶解，根據(jù)需要用10nnaoh或3nhcl將ph調(diào)節(jié)至7.0。將溶液加入量筒中，并使用去離子水使其達到1l的最終體積。充分混合后，將溶液輕柔混合，并通過0.2μm的氮化纖維素過濾器(cellulosenitridefilter)過濾，并在使用前儲存在4℃。r2稀釋劑(1l比例)：將以下組分加入到500ml去離子水中：10gbsa100ml1mtris，ph8.02ml0.5medta(ph8.0)4mlbrij-35(30％)4mlproclin1500.96gpeg600017.6gnacl10ml小鼠血清g6p0.56g1.665g草氨酸鈉(可選)使用攪拌棒以低速充分混合該溶液。一旦粉末完全溶解，根據(jù)需要用10nnaoh或3nhcl將ph調(diào)節(jié)至8.0。將溶液加入量筒中，并使用去離子水使其達到1l的最終體積。充分混合后，將溶液輕柔混合，并通過0.2μm的氮化纖維素過濾器過濾，并在使用前儲存在4℃。實施例4：測定試劑的制備r1試劑和r1空白的制備r1試劑和r1空白在r1稀釋劑中含有nad(35mm)、g6p(56mm)。r1試劑還包括抗體(10.5μg/ml)。g6p是軛合物的穩(wěn)定劑，是可選的。使稀釋劑和其它材料在制備試劑前達到室溫。通過將4.644gnad和3.160g葡萄糖-6-磷酸鈉(g6p)加入到r1稀釋劑中來制備2x底物工作溶液(100ml)。通過溫和混合將粉末完全溶解，并用10mnaoh或3mhcl將ph調(diào)節(jié)至7.0。將溶液加入量筒中，加入另外的r1稀釋劑，以得到最終體積為100ml。通過在滾筒上輕柔旋轉(zhuǎn)將溶液充分混合，并通過0.2μm的氮化物纖維素過濾器過濾。通過將抗體儲備(6.6mg/ml)在r1稀釋劑中以1:10倍預(yù)稀釋來制備4x抗體工作溶液(25ml)，得到660μg/ml的抗體溶液。將1.59ml預(yù)稀釋的抗體溶液(660μg/ml)加入到23.41ml的r1稀釋劑中以制備濃度為42μg/ml的抗體工作溶液(4x)。通過混合40ml底物工作溶液(2x)，20ml抗體工作溶液(4x)和20mlr1稀釋劑來制備r1試劑。將溶液輕柔混合，用鋁箔覆蓋，并在使用前在4℃下儲存。通過混合40ml底物工作溶液(2x)和40mlr1稀釋劑來制備r1空白。將溶液輕柔混合，用鋁箔覆蓋，并在使用前在4℃下儲存。r2試劑和r2空白的制備r2試劑含有在r2稀釋劑中的sdma-g6pdh軛合物(0.42μg/ml)。r2空白含有在r2稀釋劑中的sdma-g6pdh軛合物(0.014μg/ml)。將0.3ml軛合物儲備(批號#5616-80-2，770μg/ml)加入到29.7mlr2稀釋劑以將軛合物預(yù)稀釋1:100倍，得到7.7μg/ml的最終濃度。將21.8ml預(yù)稀釋的軛合物溶液加入到378.2ml的r2稀釋劑中以制備r2試劑。將0.73ml預(yù)稀釋的軛合物溶液加入到399.27mlr2稀釋劑中以制備r2空白。將溶液充分混合并在使用前在4℃下儲存。實施例5：sdma類似物n,n'-二甲基精氨酸硫醇(sdma-sh)的制備材料：-半胱胺4-甲氧基三苯甲基樹脂：裝載0.7mmol/g樹脂和200-400目共聚物基質(zhì)(novabiochem)-fmoc-sdma(boc)20na：mw624.7，純度≥95％(novabiochem)-hatu：mw380.3(novabiochem)-n,n-二異丙基乙胺：通過再蒸餾純化，99.5％，來自sigma-dmf(無水)：純度≥99.8％，來自sigma-哌啶：20％在無水dmf中步驟：向20ml小瓶中加入半胱胺4-甲氧基三苯甲基樹脂(1.2g，0.46mmol)、fmoc-sdma(boc)2ona(0.9g，1.4mmol，3.0當量)、hatu(0.54g，1.4mmol，3.0當量)、二異丙基乙胺(0.4ml，2.3mmol，5.0當量)和無水dmf(18ml)。將混合物覆蓋并在室溫下倒置16小時。使用玻璃移液管從小瓶中移出液體。然后用dmf(18ml，4次)，接著用甲醇(18ml，4次)洗滌樹脂。樹脂在含20％哌啶的dmf中在室溫下倒置15分鐘(18ml，3次)。然后用dmf(18ml，4次)，接著用甲醇(18ml，4次)洗滌樹脂，并在凍干機上干燥1小時。然后可以將黃/淺粉色樹脂儲存在4℃或切割以得到sdma-sh。為將sdma-sh從樹脂(50mg)切割下來，將其在三氟乙酸(3ml)中在室溫下轉(zhuǎn)化(inverted)1小時。然后將深紅色漿液過濾并用乙腈(1ml)沖洗，得到澄清的黃色溶液。然后將溶液凍干，得到稠黃色油狀物的sdma-sh(7mg)。由于硫醇的氧化，化合物應(yīng)立即使用或儲存于-80℃(儲存于-80℃，2個月后氧化<10％)。通過lc/ms和nmr確認了sdma-sh(式1)。式1實施例6：sdma與g6pdh的軛合通過將sdma類似物sdma-sh與用sia、sbpa或smcc活化的g6pdh在nad和g6p存在下軛合來制備sdma和g6pdh的軛合物。sdma和g6pdh之間的連接子的長度可以通過選擇用于活化的試劑來改變，如圖2、3和4所示。用sia進行酶預(yù)活化：一小瓶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(g6pdh)(12mg)溶于3mlmes緩沖液(50mm，ph8.0)中并旋轉(zhuǎn)1小時以確保酶完全溶解。將酶溶液保持在冰上直至需要。向酶溶液中加入額外的4.5mlmes緩沖液(50mm，ph8.0)，通過渦旋(5秒)充分混合并保持在冰上10分鐘。將100gg6p溶于1ml去離子水中并在冰上10分鐘。將200mgnadh溶于1ml去離子水中并保持在冰上10分鐘。將0.68mlg6p溶液和0.34mlnadh溶液加入到酶溶液中，通過渦旋(5秒)充分混合并保持在冰上10分鐘。將一小瓶sia(50mg)溶于0.5mldmso(100mg/ml)中。將0.14mlsia溶液加入到酶溶液中，通過渦旋(5秒)充分混合，用鋁箔覆蓋，并在室溫下旋轉(zhuǎn)2小時。將溶液轉(zhuǎn)移到g2slide-a-lyzer透析盒中，并在4℃下在黑暗中對著pbs緩沖液(4l)透析5小時。將緩沖液更換為新鮮pbs(4l)，溶液在4℃下在黑暗中透析整夜。將透析緩沖液更換為mes(4l，25mm，ph8.0)，溶液在4℃下透析3小時。從透析盒中移取12.5ml酶溶液，加入0.32mlmes緩沖液(1m，ph8.0)和0.32mledta(0.2m，ph8.0)，使溶液的最終濃度達到50mmmes、5mmedta。如果需要，如果酶溶液小于12.5ml，則可以相應(yīng)地調(diào)節(jié)mes和edta的體積。將溶液用氬氣脫氣5分鐘。用sbpa進行酶預(yù)活化：向含有2mgg6pdh的1mlmes緩沖液(50mm，ph8.0)中加入11.3mgg6p和16.8mgnadh，充分混合并保持在冰上10分鐘。將sbpa(50mg)溶于0.5mldmso(100mg/ml)中。將0.025mlsbap加入到酶溶液中，通過渦旋(5秒)充分混合，用鋁箔覆蓋，并在室溫下旋轉(zhuǎn)2小時。將溶液轉(zhuǎn)移到g2slide-a-lyzer透析盒中，并在4℃下在黑暗中對著pbs緩沖液(2l)透析5小時。將緩沖液更換為新鮮pbs(2l)，并將溶液在4℃下在黑暗中透析整夜。將透析緩沖液更換為mes(2l，25mm，ph8.0)，溶液在4℃下透析3小時。從透析盒中移取2.5ml酶溶液，加入0.060mlmes緩沖液(1m，ph8.0)和0.025mledta(0.5m，ph8.0)，使溶液的最終濃度達到50mmmes和5mmedta。用smcc進行酶預(yù)活化：在含有2mgg6pdh的1mlmes緩沖液(50mm，ph8.0)中加入11.3mgg6p和16.8mgnadh，充分混合并保持在冰上10分鐘。將50mg磺基琥珀酰亞胺基-4-(n-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(smcc)溶于0.5mldmso(100mg/ml)中。將0.035mlsmcc溶液加入到酶溶液中，通過渦旋(5秒)充分混合，用鋁箔覆蓋，并在室溫下旋轉(zhuǎn)2小時。將溶液轉(zhuǎn)移到g2slide-a-lyzer透析盒中，并在4℃下在黑暗中對著pbs緩沖液(2l)透析5小時。將緩沖液更換為新鮮pbs(2l)，溶液在4℃下在黑暗中透析整夜。將透析緩沖液更換為mes(2l，25mm，ph8.0)用于在4℃下共3小時。從透析盒中移取2.5ml酶溶液，加入0.060mlmes緩沖液(1m，ph8.0)和0.025mledta(0.5m，ph8.0)，使溶液的最終濃度達到50mmmes和5mmedta。sdma和預(yù)活化g6pdh的軛合：將新制備的sdma-sh(式1)加入到預(yù)活化的以下量的酶溶液中：0.35ml(100mg/ml)sia活化的g6pdh和0.065ml(100mg/ml)sbap或smcc活化的g6pdh。將溶液充分混合，并將混合物在4℃下旋轉(zhuǎn)36小時。使用g2slide-a-lyzer透析盒(thermoscientific)在4℃對著pbs(2或4l)透析(3或4個循環(huán))反應(yīng)混合物。通過在4℃下對著trishcl緩沖液(25mm，ph8.0)透析4小時使sdma酶軛合物溶液平衡。用0.45μm離心過濾器(1500*g，10分鐘)過濾溶液。表5示出了每種軛合物的連接子長度和活性以及抗體抑制軛合物的g6pdh的能力。連接子長度不包括式1的sdma衍生物中的非原生氮。在sia存在下的g6pdh的預(yù)活化導(dǎo)致比用sbpa或smcc制備的軛合物更好的酶活性。表5實施例7：抗sdma單克隆抗體的制備產(chǎn)生單克隆抗體的方法屬于本領(lǐng)域的已知技術(shù)。在一個實施方式中，抗體是針對具有以下結(jié)構(gòu)的sdma-klh軛合物產(chǎn)生的單克隆抗體：抗sdma抗體的純化如下進行：材料：·2×2l抗sdma·專用于抗sdmaigg純化的反相(rpa)柱(5ml)(gehealthcare)·pierceigg純化緩沖液·igg聯(lián)結(jié)緩沖液·igg低ph洗脫緩沖液·pbs，ph7.4用于透析·2x4l@4c方案：·rpa柱(5ml)在3ml/min的聯(lián)結(jié)緩沖液中平衡1.流量由od280nm監(jiān)測·將1000ml抗sdma在等體積的pierceigg聯(lián)結(jié)緩沖液中稀釋1.對額外1000毫升重復(fù)步驟·稀釋的抗sdma以6ml/min裝載在rpa柱上1.od280nm監(jiān)測·用pbs/igg聯(lián)結(jié)緩沖液1：1@3ml/min洗滌rpa柱，直到1.od280nm達到基線·使用igg低ph洗脫緩沖液(3min/ml)洗脫抗sdmaigg1.手動收集峰·用2次更換的4lpbs立即透析抗sdmaigg1.30ml10kmwco盒2.匯集的體積和od280nm用于確定igg濃度通過sdspage、sec和基于平板的免疫測定(plate-basedimmunoassay)分析抗體，如第8,481,690號美國專利所述實施例8：測定步驟在犬科、貓科和人樣品中對sdma進行本公開的改進測定。試劑組分在表5中示出。表5如上所述制備的試劑的移液量對于顏色測定和空白測定是相同的：樣品和校準品的顯色和空白測定以及相關(guān)計算在beckman自動分析儀上進行。在校準基質(zhì)(經(jīng)分離的犬血清)中含有56.0、28.0、14.0、7.0和3.75以及0μg/dlsdma的校準標準品用于貓和狗兩者。將分析儀編程為進行顯色和空白分析如下：將樣品和校準品加入到試劑r1中，并在加入r2之前溫育3-4分鐘。在加入r2后，在大約36秒開始，在340nm處測量od。每18秒測量吸光度，進行4次額外的18秒循環(huán)。從用于計算顯色和空白測定的反應(yīng)速率(吸光度/分鐘的變化)的每個測量中減去校準品基質(zhì)的吸光度值(0μg/dlsdma)以提供歸一化的顯色和空白反應(yīng)速率。為了確定標準曲線的速率，從顯色測定中的每個校準品的歸一化速率中減去來自空白測定的每個校準品的歸一化速率。通過從顯色測定中的樣品的標準化速率中減去空白測定中樣品的標準化速率來確定樣品sdma濃度，以提供最終樣品反應(yīng)速率，將其與最終標準曲線進行比較。表6示出了使用單獨的顯色測定(“無減除”)和當從顯色測定速率(“有減除”)中減去空白測定速率時，貓科和犬科血清的sdma測定結(jié)果。樣品偏差反映了lc/ms結(jié)果與使用上述步驟的結(jié)果之間的差異。表6表7示出了使用含有已知量的sdma的已經(jīng)分離的犬血清制備的校準曲線(有減除和無減除)。為其它物種制備了類似的曲線。表7表8示出了使用上述速率測定步驟(即，有減除的顯色和空白測定)使用sdma摻入的未經(jīng)分離的人血清的圖6中所示的校準曲線的值。表8sdma(μg/dl)反應(yīng)速率(δa/分鐘)0.00.08.620.013.231.729.360.758.898.8該曲線用于確定正常和慢性腎臟疾病人血清樣品中的濃度，如圖1所示。實施例9：酶抑制劑的使用將乳酸脫氫酶抑制劑草氨酸鈉加入到空白試劑稀釋劑和如實施例3中所述的試劑中。如表9所示，使用抑制劑可以提高測定的準確度。表9在該實施例中，如表10所示，犬科血清的標準曲線由含有和不含草氨酸鈉的制備?？梢詾槠渌锓N制備類似的曲線。表10sdma(μg/dl)無草氨酸鹽有草氨酸鹽0.10.00.05.14.34.114.817.618.028.438.037.959.975.573.797.9116.0116.0實施例10：用經(jīng)分離和未經(jīng)分離的人血清校準品測試人血清樣品確定了使用內(nèi)源和經(jīng)炭分離的人血清作為校準品基質(zhì)回收在人血清樣品中sdma。本實驗收集的數(shù)據(jù)可用于制定速率和固定校準方法的校準曲線。如表11所示制備測定試劑。表11如實施例7制備抗sdmamab，并以1.5μg/ml的測定濃度使用。如實施例6制備sdma-g6pdh，并以0.3μg/ml的測定濃度使用。用經(jīng)炭分離的人血清，用以下sdma濃度(μg/dl)制備校準品：0.0、4.7、15.0、29.0、59.0和111.0(由lc/ms確定)。根據(jù)實施例8進行速率方法。在固定方法中，將beckman儀器設(shè)定為測量反應(yīng)開始后1分鐘至3分鐘之間的在340nm的吸光度變化。用于確定sdma濃度的固定和速率計算方法的結(jié)果在圖7中示出。實施例11：使用緩沖液校準品的未經(jīng)分離的人校準品劑量使用緩沖液基的校準品(0、6、11、24、46和95μg/dlsdma在含有1％bsa的pbs緩沖液中)校準sdma測定，并用于測試未經(jīng)分離的人血清標準品以確定回收率。該實驗使用固定方法計算在儀器循環(huán)12和16的340nm處的吸光度的變化，其中每個循環(huán)為18秒(t1＝216秒，t2＝288秒)。沒有從凈吸光度中減去試劑空白(dih2o)的吸光度。如實施例9所示運行測定。結(jié)果在圖8中示出。實施例12：手動和自動背景減除的比較測試了載入到beckman分析儀上的自動背景減除方法，以確定載入解決方案的有效性。依指令運行sdma測定，且分離地運行測定，以及使用離線方法作為對照進行結(jié)果計算。如實施例1制備經(jīng)炭分離的犬血清校準品。試劑組分在表12中示出。表12組分試劑1試劑2r1空白r2空白nad(mm)5050g6p(mm)8080sdma-mab(μg/ml)2000sdma-g6pdh(μg/ml)00.400.004反應(yīng)體積如下：樣品體積：17μi試劑1體積：25μi試劑2體積：125μi顯色和空白測定法不連接載入分析儀。每個測定分別生成數(shù)據(jù)，并脫離儀器處理。從校準品和樣品的顯色測定反應(yīng)od中減去空白測定反應(yīng)od。將曲線擬合到校準數(shù)據(jù)，并使用最佳擬合曲線的方程來從減除的反應(yīng)od確定樣品濃度。表13示出了固定反應(yīng)方法中校準品的吸光度的凈變化：表13表14示出了使用由表13所示的校準品生成的標準曲線的樣品中sdma的測量。表14實施例12：來自不同物種的校準品基質(zhì)的分析分析由不同動物物種的匯集血清制成的校準品組，以便在使用來自不同物種的血清的校準品時測定sdma測定的穩(wěn)健性。使用如實施例10中的固定方法，對來自狗、貓和馬的經(jīng)分離或內(nèi)源(未經(jīng)分離)的血清制成的校準品，進行人sdma的測定。測定結(jié)果在圖8、9和10中示出。實施例13：緩沖液基的校準使用含有1％bsa的pbs作為校準基質(zhì)對表13中的校準濃度制作校準曲線。結(jié)果在圖12中中示出。實施例14：沒有軛合物加入到空白試劑中的sdma測定使用實施例8的速率步驟，用表5的試劑濃度運行sdma測定，不同的是沒有軛合物加入到r2中。測定在beckman分析儀上運行。結(jié)果在表15中示出。表15盡管本文已經(jīng)描述了本公開的各種具體實施方式，但是應(yīng)當理解，本公開不限于這些確切實施方式，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不脫離本公開的范圍和精神的情況下對做出各種改變或修改。上面給出的實施例僅僅是說明性的，并不意味著是本公開的所有可能的實施方式、應(yīng)用或修改的詳盡列表。因此，在不脫離本公開的范圍和精神的情況下，本公開的所描述的方法和系統(tǒng)的各種修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。雖然已經(jīng)結(jié)合具體實施方式描述了本公開，但是應(yīng)當理解，所要求保護的公開內(nèi)容不應(yīng)被不適當?shù)叵抻谶@些具體實施方式。實際上，用于實施本公開的描述的模式的各種修改對于分子生物學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見，且旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文所述的任何數(shù)值包括以一個單位的增量從較低值到較高值的所有值，條件是在任何較低值和任何較高值之間存在至少兩個單位的間隔。例如，如果說組分的濃度或過程變量的值諸如大小、角度大小、壓力、時間等是例如為1至90、具體為20至80、更具體為30至70，也就是說，在本說明書中明確列舉了諸如15至85、22至68、43至51、30至32等的值。對于小于1的值，根據(jù)需要將一個單位視為0.0001、0.001、0.01或0.1。這些僅僅是特定目的的實例，并且列出的最低值和最高值之間的數(shù)值的所有可能的組合將被認為在本申請中以相似的方式明確說明。當前第1頁12