本發(fā)明屬于食品分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及有機(jī)液態(tài)奶的鑒別方法。
背景技術(shù)：
：2015年世界牛奶年產(chǎn)量預(yù)計(jì)可超8億噸，是市面上消耗量最大的食物之一。作為飲食中蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來(lái)源，同時(shí)提供包括生物活性肽、抗氧化劑、維生素、礦物質(zhì)等多種生理活性物質(zhì)，被譽(yù)為膳食中完美的食物之一。我國(guó)有機(jī)產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，特別是在果蔬、奶制品等方面。2014年的有機(jī)食品銷(xiāo)售額已達(dá)到37.01億歐元，同比增長(zhǎng)52.3％。然而，較低的產(chǎn)量和較高的認(rèn)證成本導(dǎo)致有機(jī)產(chǎn)品價(jià)格往往比其傳統(tǒng)生產(chǎn)的同行高，并且由于缺乏相應(yīng)的鑒別分析技術(shù)，有機(jī)食品真實(shí)性難以追溯。針對(duì)脂肪酸、抗氧化劑、激素及農(nóng)獸藥殘留等一種或幾種指標(biāo)的定性、定量的分析，可以對(duì)有機(jī)牛奶和普通牛奶進(jìn)行有效的區(qū)分，但是存在一定的局限性，并不能全面反映有機(jī)牛奶的品質(zhì)，且因?qū)嶒?yàn)室和操作人員的不同會(huì)對(duì)方法的準(zhǔn)確度和精密度造成影響。因此以有機(jī)液態(tài)奶作為研究對(duì)象，對(duì)其有機(jī)真實(shí)性進(jìn)行鑒別研究是一個(gè)具有價(jià)值的研究方向?，F(xiàn)有的研究表明，非靶向代謝指紋圖譜可用于區(qū)分有機(jī)/非有機(jī)系統(tǒng)生成產(chǎn)品，如馬鈴薯、包菜、胡蘿卜、小麥、辣椒、番茄、番茄汁、菠菜、大蒜、辣椒、番茄醬、玉米粒、紅葡萄、萵苣、蘋(píng)果、花椰菜等。然而未見(jiàn)將非靶向代謝指紋圖譜應(yīng)用于有機(jī)/非有機(jī)系統(tǒng)液態(tài)奶的鑒別中。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種基于非靶向檢測(cè)的有機(jī)液態(tài)奶鑒別方法，該方法為有機(jī)液態(tài)奶的鑒別提供了新途徑。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種有機(jī)液態(tài)奶的鑒別方法，它包括以下步驟：1)樣品提?。簩⒋郎y(cè)樣品用醇溶液進(jìn)行震蕩提取，提取液氮?dú)獯蹈珊笥眉姿崴芤簭?fù)溶，然后經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾；2)UPLC-MS檢測(cè)：將濾液經(jīng)色譜分離并采用質(zhì)譜檢測(cè)分析，得到樣本的原始代謝圖譜，其中，色譜分離采用的是HSST3色譜柱，流動(dòng)相是甲酸水溶液與乙腈，采用梯度洗脫；3)對(duì)原始代謝圖譜進(jìn)行分析，從而鑒別有機(jī)液態(tài)奶。優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品在提取前還有進(jìn)行脫脂處理的步驟。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述脫脂處理的方法是先將待測(cè)樣品進(jìn)行超聲破乳，然后離心脫脂。優(yōu)選地，所述醇溶液為甲醇。優(yōu)選地，所述甲酸水溶液的質(zhì)量濃度為0.1％。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述梯度洗脫的程序、流速及流動(dòng)相中各成分的體積百分比為：優(yōu)選地，所述質(zhì)譜檢測(cè)的條件是：電噴霧離子化，采用ESI+模式檢測(cè)，毛細(xì)管電壓1.0KV，錐孔電壓30.0V，錐孔氣流速50L/h，源溫度150℃，霧化氣溫度550℃，霧化氣流速1000L/h，以MSE為采集模式，低碰撞能量4eV，高碰撞能量10-50eV，采集質(zhì)量范圍50-1200m/z，應(yīng)用亮氨酸-腦啡肽作為鎖定質(zhì)量，正離子模式下產(chǎn)生[M+H]+離子556.2771Da。優(yōu)選地，步驟3)中，將樣本的原始代謝圖譜采用ProgenesisQI軟件導(dǎo)入，進(jìn)行峰對(duì)齊，峰提取，去卷積預(yù)處理，再對(duì)導(dǎo)出的數(shù)據(jù)依次進(jìn)行PCA、PLS-DA、OPLS-DA模式識(shí)別方法分析，建立多維統(tǒng)計(jì)模型，可視化地顯示有機(jī)液態(tài)奶與普通牛奶的代謝譜差異，并采用模型的VIP值，結(jié)合學(xué)生氏t檢驗(yàn)的p值篩選獲得差異代謝物，并對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行初步鑒定。本發(fā)明能全面反映有機(jī)牛奶的品質(zhì)，全面、綜合地區(qū)分有機(jī)液態(tài)奶中代謝產(chǎn)物的差異，準(zhǔn)確地將有機(jī)液態(tài)奶與普通牛奶鑒別開(kāi)，該方法具有準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性好，精密度高，檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例1樣本的基峰色譜圖(BPI圖)。圖2是本發(fā)明實(shí)施例2樣本的基峰色譜圖(BPI圖)。圖3是本發(fā)明實(shí)施例3樣本的基峰色譜圖(BPI圖)。圖4是本發(fā)明實(shí)施例4樣本的基峰色譜圖(BPI圖)。圖5是本發(fā)明實(shí)施例4所有組樣本的主成分分析PCA得分圖。圖6是本發(fā)明實(shí)施例4采用PLS-DA對(duì)所有樣本的分析得分圖。圖7是本發(fā)明實(shí)施例4采用OPLS-DA對(duì)兩組樣本的分析得分圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明。實(shí)施例11.1樣本基本信息有機(jī)液態(tài)奶和普通液態(tài)奶均為某地大型超市零售，超高溫瞬時(shí)滅菌利樂(lè)磚包裝，產(chǎn)地為內(nèi)蒙古呼和浩特，季節(jié)均取樣于2016年夏季，每個(gè)批次取6個(gè)平行樣本，共計(jì)120個(gè)樣本。表1：液態(tài)奶樣本注：普通牛奶中，品牌A樣本標(biāo)記為M，品牌B標(biāo)記為T(mén)，品牌C標(biāo)記為Y。有機(jī)牛奶中，品牌B標(biāo)記為T(mén)Y，品牌C標(biāo)記為J。1.2樣本制備采用物理方法結(jié)合化學(xué)方法對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，以獲得液態(tài)奶親水性代謝提取物。取-80℃冷凍儲(chǔ)存的樣本，置于室溫下解凍至室溫。取100ul牛奶置于離心管中，加入400ul預(yù)冷卻的色譜級(jí)甲醇(比例為1:4)，渦旋震蕩30s，靜置20min；取出4℃下14000轉(zhuǎn)/min離心15分鐘，沉淀蛋白；取上清液，氮吹干燥，用0.1wt％的甲酸水溶液復(fù)溶，定容至1ml。經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾，得到濾液。1.3UPLC-QTOF-MS分析本實(shí)驗(yàn)的儀器分析平臺(tái)為UPLC-QTOF-MS(Waters，UPLC.XevoG2-XSQTof)。分離色譜柱采用HSST3色譜柱(2.1*100mm,1.8μm，Waters，USA)。色譜分離條件為：柱溫保持40℃，進(jìn)樣量為5μL，流速為0.50mL/min，樣品室溫度為6℃。流動(dòng)相A為0.1wt％甲酸水溶液，流動(dòng)相B為純乙腈。采用梯度方式洗脫樣品。表2梯度洗脫程序時(shí)間流速(ml/min)A(體積百分比)B(體積百分比)00.5991100.5595120.5595130.519913.10.5991150.5991質(zhì)譜條件：電噴霧離子化，采用ESI+模式檢測(cè)。毛細(xì)管電壓1.0KV，錐孔電壓30.0V，錐孔氣流速50L/h，源溫度150℃，霧化氣溫度550℃，霧化氣流速1000L/h。以MSE為采集模式，低碰撞能量4eV，高碰撞能量10-50eV，采集質(zhì)量范圍50-1200m/z。應(yīng)用亮氨酸-腦啡肽作為鎖定質(zhì)量，正離子模式下產(chǎn)生[M+H]+離子556.2771Da。1.4數(shù)據(jù)處理采用waters組學(xué)分析軟件ProgenesisQI軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入，峰對(duì)齊，峰提取，去卷積等，得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的主成分分析(PCA)，導(dǎo)入Ezinfo進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)，并結(jié)合VIP值和p值找出差異顯著的化合物。實(shí)施例21.1樣本基本信息同實(shí)施例1中1.1。1.2樣本制備同實(shí)施例1中1.2。1.3UPLC-QTOF-MS分析本實(shí)驗(yàn)的儀器分析平臺(tái)為UPLC-QTOF-MS(Waters，UPLC.XevoG2-XSQTof)。分離色譜柱采用HILIC色譜柱(2.1*100mm,2.5μm，Waters，USA)。色譜分離條件為：柱溫保持40℃，進(jìn)樣量為5μL，流速為0.40mL/min，樣品室溫度為6℃。流動(dòng)相A為含10mmol/L乙酸銨的0.1wt％甲酸水溶液；流動(dòng)相B為乙腈。采用梯度方式洗脫樣品。表3梯度洗脫程序時(shí)間流速(ml/min)A(％)B(％)00.599110.5595150.5595170.5199200.5991質(zhì)譜條件與實(shí)施例1相同。1.4數(shù)據(jù)處理同實(shí)施例1中1.4。實(shí)施例31.1樣本基本信息同實(shí)施例1中1.1。1.2樣本制備同實(shí)施例1中1.2。1.3UPLC-QTOF-MS分析本實(shí)驗(yàn)的儀器分析平臺(tái)為UPLC-QTOF-MS(Waters，UPLC.XevoG2-XSQTof)。分離色譜柱采用BEHC18色譜柱(2.1*50mm,2.5μm，Waters，USA)。色譜分離條件為：柱溫保持40℃，進(jìn)樣量為5μL，流速為0.50mL/min，樣品室溫度為6℃。流動(dòng)相A為0.1％甲酸水溶液，流動(dòng)相B為純乙腈。采用梯度方式洗脫樣品。梯度洗脫程序及質(zhì)譜條件同實(shí)施例2中1.3。1.4數(shù)據(jù)處理同實(shí)施例1中1.4。實(shí)施例41.1樣本基本信息同實(shí)施例1中1.1。1.2樣本制備采用物理方法結(jié)合化學(xué)方法對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，以獲得液態(tài)奶親水性代謝提取物。取-80℃冷凍儲(chǔ)存的樣本，置于室溫下解凍至室溫，置于超聲儀中超聲15分鐘進(jìn)行反乳化作用，破壞牛奶樣本的穩(wěn)定性。于4℃下4000轉(zhuǎn)/min離心20分鐘，去除上層的脂肪層；再次離心剩余清液，使觀察到的所有脂肪層被去除。取上述脫脂牛奶0.5ml，置于離心管中，加入1.5ml預(yù)冷卻的色譜級(jí)甲醇(比例為1:3)，渦旋震蕩30s，靜置20min；取出4℃下14000轉(zhuǎn)/min離心15分鐘，沉淀蛋白；取500μL上清液，經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾，得到濾液。1.3UPLC-QTOF-MS分析同實(shí)施例1中1.3。1.4數(shù)據(jù)處理同實(shí)施例1中1.4。試驗(yàn)例1依據(jù)實(shí)施例1～4進(jìn)行液態(tài)奶親水性代謝提取物非靶向檢測(cè)，并將不同BPI圖進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)圖1-4。由圖1-4可知，實(shí)施例4效果最為理想。制備所得的液態(tài)奶親水性代謝提取物偏極性，當(dāng)使用HSST3色譜柱時(shí)，對(duì)極性化合物有較好的分離效果。使用BEHC18柱進(jìn)行測(cè)定時(shí)，背景峰較多，而使用HILIC色譜柱時(shí)，20分鐘的梯度洗脫，但集中在前4分鐘出峰，代謝物流出太快，重疊較多。而針對(duì)樣本制備方法，當(dāng)對(duì)液態(tài)奶進(jìn)行脫脂處理后，提取峰反而增多，化合物種類(lèi)更豐富，可能是去脂之后，去除了脂肪的影響，減少了基質(zhì)效應(yīng)，并且脂肪結(jié)合型物質(zhì)被釋放出來(lái)，提高了更廣的非脂類(lèi)代謝物的覆蓋度。試驗(yàn)例2依據(jù)實(shí)施例4進(jìn)行液態(tài)奶親水性代謝提取物非靶向檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果見(jiàn)圖5-7。2.1主成分分析(PCA)主成分分析作為無(wú)監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法，可以真實(shí)反映樣本的聚類(lèi)情況。對(duì)兩組樣本正離子模式下進(jìn)行PCA分析，R2X＝93％，模型較可靠。PCA得分圖如圖5，可看出所有樣本均在95％置信區(qū)間，并且有機(jī)牛奶組樣本均處于右側(cè)，大部分普通牛奶組處于左側(cè)。2.2偏最小二乘判別分析(PLS-DA)進(jìn)一步采用有監(jiān)督的方法PLS-DA對(duì)五個(gè)品牌牛奶樣本進(jìn)行建模分析，模型的參數(shù)R2Y表示模型的解釋程度，Q2表示模型的預(yù)測(cè)率。結(jié)果R2Y＝96％，Q2＝95％，PLS-DA得分圖如圖6，有明顯的組間分類(lèi)趨勢(shì)。2.3正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)將品牌分為有機(jī)和普通兩組，采用有監(jiān)督的方法OPLS-DA進(jìn)行建模分析，R2Y＝96％，Q2＝95％，得分圖如圖7所示。通過(guò)OPLS-DA分析，兩組樣本在正離子模式下能夠得到很好地分離，所有的有機(jī)牛奶均處于主成分1的左側(cè)，而普通牛奶組處于主成分1的右側(cè)。結(jié)合OPLS-DA模型的VIP值和t檢驗(yàn)的p值，尋找兩組之間的差異顯著具有重要貢獻(xiàn)的變量(代謝物)，并利用自建的牛奶數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行初步鑒定。2.4兩組之間差異性代謝物的挖掘及鑒定采用OPLS-DA模型的VIP值(VIP>1)和t檢驗(yàn)的p值(p<0.05)來(lái)尋找差異性代謝物。定性方法為搜索自建牛奶數(shù)據(jù)庫(kù)。牛奶數(shù)據(jù)庫(kù)建立方法為搜集文獻(xiàn)中牛奶相關(guān)代謝物，在chemspider中下載該代謝物的mol文件，錄入ProgenesisSDFStudio軟件，整理成數(shù)據(jù)庫(kù)，mol文件包含有代謝物的質(zhì)荷比m/z值及二級(jí)質(zhì)譜碎片。差異性代謝物數(shù)據(jù)如表4所示：表4差異性代謝物鑒定結(jié)果本發(fā)明通過(guò)對(duì)液態(tài)奶樣本進(jìn)行非靶向檢測(cè)分析，采用所有樣本中物質(zhì)的峰強(qiáng)度進(jìn)行PCA分析，成功對(duì)所有組樣本進(jìn)行建模。5組牛奶之間存在顯著性差異，且有機(jī)液態(tài)奶與普通液態(tài)奶之間區(qū)分明顯。在此基礎(chǔ)上，對(duì)各組樣本進(jìn)行有監(jiān)督模式的統(tǒng)計(jì)分析，包括PLS-DA和OPLS-DA，采用OPLS-DA模型的VIP值(VIP>1)和學(xué)生氏t檢驗(yàn)的p值(p<0.05)來(lái)尋找差異性代謝物?？芍袡C(jī)液態(tài)奶與常規(guī)液態(tài)奶的差異代謝物主要?dú)w屬于小分子有機(jī)酸、氨基酸類(lèi)、磷脂以及小分子糖類(lèi)等物質(zhì)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3