本發(fā)明涉及一種基于光學(xué)原子磁力儀的原位力譜方法，屬于生物力譜技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子之間的相互作用在生物體中處處存在，這種相互作用對維持所有細胞的生存和正?；顒颖夭豢缮?。研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的分子機制，對人們了解DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因表達機制、揭示各種生命活動現(xiàn)象具有極其重要的指導(dǎo)作用。伴隨納米科技的進步，人們已經(jīng)發(fā)展了多種單分子力譜方法來直接檢測生物大分子之間的相互作用，其中的超低場力譜技術(shù)是在超低場磁成像基礎(chǔ)上發(fā)展起來的全新形態(tài)，利用磁標記法來探測分子間相互作用力。作為分子探針的磁性粒子會產(chǎn)生一個強磁場信號，進而粒子的磁場強度被高靈敏度的磁力儀所探測。在有足夠強的外界微擾力借助磁性粒子作用于非共價鍵合分子對時，物理吸附或者結(jié)合力較弱的分子首先發(fā)生解離，并隨之進行布朗運動，擾亂了粒子的磁偶極。最終導(dǎo)致這些解離分子將不會產(chǎn)生信號，僅有與目標分子特異性結(jié)合的較強分子對才能被探測。相比于目前已經(jīng)發(fā)展成熟的多種力譜方法，超低場力譜技術(shù)能夠?qū)⒋罅康膯畏肿邮录瑫r測量，克服了單一事件的隨機性；同時計算作用力所需的參數(shù)都能精確得到，而無須額外的校準；采用分子間特異的相互作用力來探測識別多種不同的生物分子和細胞，因此也不需要繁瑣的物理分離，廣泛應(yīng)用于分子間(抗體-抗原、受體-配體、DNA、蛋白質(zhì))的相互作用力測量。然而，目前超低場生物力譜技術(shù)采用離心力方法來施加外界微擾力，很難實現(xiàn)施力過程和測量過程的一體化，樣品需要在離心機和原子磁力儀兩個獨立裝置間反復(fù)轉(zhuǎn)移，才能獲得力-磁場強度曲線。這就使得整個力譜檢測過程費時費力，效率不高，并且還會增加測量的誤差。鑒于此，建立一種原位超低場力譜方法，實現(xiàn)與磁力儀的一體化，將提高超低場力譜的測量效率和精準性，具有更大的應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于光學(xué)原子磁力儀的原位力譜方法，本發(fā)明原子力譜方法解決了現(xiàn)有技術(shù)的超低場力譜方法不能與磁力儀一體化而費時費力、測量效率低，且樣品反復(fù)轉(zhuǎn)移容易增加實驗誤差的問題，為一種新型的超低場原位力譜技術(shù)。

本發(fā)明首先提供一種適用于原位力譜檢測的系統(tǒng)，它包括光學(xué)原子磁力儀、線性掃描裝置和微流控芯片；

所述線性掃描裝置安裝于所述光學(xué)原子磁力儀的樣品通道中；

所述線性掃描裝置的樣品臺固定于其掃描通道的進出口軸線上；

所述微流控芯片設(shè)于所述樣品臺上，并隨所述樣品臺沿所述掃描通道移動；

所述微流控芯片的微流體通道用于固定待測分子，所述微流體通道內(nèi)的流體循環(huán)流動以對待測分子施加流體曳力。

所述的系統(tǒng)中，所述線性掃描裝置還包括線性馬達和原子氣池傳感器，所述線性馬達驅(qū)動所述樣品臺沿所述掃描通道運動，所述原子氣池傳感器設(shè)于所述樣品通道的一側(cè)，當所述磁探針最接近所述原子氣池傳感器的時候，所述原子氣池傳感器測量的磁信號達到最強點，在樣品的磁場曲線(掃描距離—磁場強度)上，譜峰的高度對應(yīng)于樣品的磁場強度。

所述的系統(tǒng)中，所述通過在所述微流體通道的兩端連接一回路實現(xiàn)對所述微流體通道內(nèi)流體的循環(huán)流動，在所述回路上設(shè)置閥門，通過控制閥門的開度大小實現(xiàn)對流體流速的控制。

所述的系統(tǒng)中，所述微流控芯片包括PDMS薄片和貼附于其上表面和下表面的所述基底，所述PDMS薄片內(nèi)設(shè)有所述微流體通道；

所述基底上修飾有能與所述分子對連接的官能團；

所述微流控芯片采用無磁材料，所述基底采用玻璃或者石英片。

所述的系統(tǒng)中，所述官能團可為-OH、-NH₂、-SH或-COOH。

所述的系統(tǒng)中，利用Labview軟件控制所述微流控芯片內(nèi)流體流速(控制回路上的閥門)和所述光學(xué)原子磁力儀的磁力儀檢測系統(tǒng)，，可實現(xiàn)微擾力的原位施加和磁信號的原位檢測，有利于提高力譜測量的精準性和工作效率。

本發(fā)明進一步提供利用所述系統(tǒng)進行原位力譜檢測的方法，包括如下步驟：

(1)將磁探針標記的分子對固定于所述微流控芯片的微流體通道內(nèi)，并連接于所述微流控芯片的基底上，所述磁探針經(jīng)磁鐵磁化；

(2)將經(jīng)步驟(1)處理的所述微流控芯片安裝于所述樣品臺上，啟動所述線性掃描裝置進行掃描，即得到所述磁探針標記的所述分子對的磁場強度；

(3)啟動所述光學(xué)原子磁力儀，控制所述微流控芯片內(nèi)流體流速和所述光學(xué)原子磁力儀的磁力儀檢測系統(tǒng)，得到不同流體流速時的磁場強度變化量，根據(jù)流體力學(xué)即得到力與磁場強度變化量之間的變化曲線，進而實現(xiàn)所述分子對的分子間非共價相互作用力的檢測。

上述的方法中，所述線性掃描裝置的掃描速度為0.1～10mm/s，掃描長度為0～300mm。

上述的方法中，所述磁探針的尺寸(即半徑)為10nm～10μm；

所述分子對可為蛋白質(zhì)、雙鏈DNA、抗體-抗原或受體-配體；

可采用stop-flow微流控控制的方法固定所述分子對。

上述的方法中，步驟(2)中，掃描過程中，當所述磁探針與所述線性掃描裝置的原子氣池傳感器之間的距離最短時，此時測量得到的磁信號即為所述磁探針標記的所述分子對的磁場強度。

上述的方法中，步驟(3)中，所述微流控芯片內(nèi)的流體流速為0～1000rpm。

上述的方法中，步驟(3)中，根據(jù)式(1)所示微流體曳力公式得到不同流體流速下所對應(yīng)的外力：

F＝-6πηrv (1)

式(1)中，η表示流體的粘滯系數(shù)，r表示所述磁探針的半徑，v表示流體的運動速度；

根據(jù)不同流速下測量得到的磁場強度變化量，得到流速-磁場強度變化量之間的變化曲線，當磁場強度變化量最大時所對應(yīng)的力即為分子對發(fā)生解離所需作用力，根據(jù)流速和公式(1)即可獲得該作用力的大小。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：

本發(fā)明的目的是測得分子對間的非共價相互作用力的大小，是通過力與磁場強度變化量之間的關(guān)系得到，當磁場強度變化量最大時對應(yīng)的力即為分子對間的相互作用力；磁場強度變化量為光學(xué)原子磁力儀的測定值與分子對的磁場強度的差值，分子對的磁場強度由線性掃描裝置測定得到。

待研究的分子對直接固定于微流控芯片上，并內(nèi)置于超低場磁力儀的檢測區(qū)。通過Labview軟件控制可以同時實現(xiàn)微流控芯片內(nèi)微擾力的施加和磁力儀內(nèi)樣品信號的檢測，提供一種新型的超低場原位力譜。這樣完全避免了樣品在施力過程和測量過程的反復(fù)轉(zhuǎn)移，減少了相應(yīng)的實驗誤差，提高了力譜測量的工作效率。原位力譜技術(shù)可以直接反映微流控芯片內(nèi)生物大分子間相互作用的動態(tài)過程。

附圖說明

圖1為本發(fā)明適用于原位力譜檢測的系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明安裝線性掃描裝置的超低場原子磁力儀的靈敏度。

圖3為微流控芯片內(nèi)作為分子探針的磁性顆粒物的磁場曲線。

圖4為利用本發(fā)明原位力譜方法測量得到的雙鏈DNA(15bp)的力-磁場強度曲線。

圖5為利用本發(fā)明原位力譜方法測量得到的雙鏈DNA(16bp)的力-磁場強度曲線。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

如圖1所示，本發(fā)明適用于原位力譜檢測的系統(tǒng)的示意圖，其組裝和使用過程如下：

步驟一、首先，在光學(xué)原子磁力儀的樣品通道中安裝線性掃描裝置，樣品臺可以穩(wěn)定固定在掃描通道的進出口軸線上。樣品臺采用無磁材料，包括塑料、玻璃、硅片等，掃描速度0.1～10mm/s，掃描長度0～300mm。

其中，線性掃描裝置還包括線性馬達和原子氣池傳感器(圖中(B(b)所示))，該線性馬達驅(qū)動樣品臺沿掃描通道運動，原子氣池傳感器設(shè)于樣品通道的一側(cè)。

步驟二、加工制作微流控芯片。在官能團(-OH、-NH₂、-SH、-COOH等官能團)修飾的微流控芯片基底上固定有微流體通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄片，然后在上面再固定基底蓋片。在PDMS薄片兩端的流體通道進出口上封裝聚四氟乙烯的流體管道，構(gòu)成簡單的微流控芯片(封裝后芯片總尺寸為長<100mm，高<5mm，寬<10mm)。

步驟三、利用微流控裝置，在芯片基底上固定待研究的磁探針標記的分子對，采用的磁探針尺寸為10nm～10μm，分子對可為雙鏈DNA、抗體-抗原、受體-配體等，分子對的修飾固定過程可通過stop-flow微流控控制。

微流控芯片內(nèi)的被測物包括生物大分子及多種細胞，例如腫瘤細胞、免疫細胞、細菌、衣原體、支原體。

步驟四、先用磁鐵對探針進行磁化，然后將含有待測分子對的微流控芯片安裝在線性掃描樣品臺上，利用掃描磁成像的方式，獲得樣品的磁場曲線，測量磁場強度。在樣品掃描過程中，當磁探針處于最接近原子氣池傳感器的時候，測量的磁信號達到最強點。在樣品的磁場曲線(掃描距離—磁場強度)上，譜峰的高度對應(yīng)于樣品的磁場強度。

步驟五、在原子磁力儀上，利用Labview軟件控制微流控裝置和磁力儀檢測系統(tǒng)，逐步改變微流控芯片內(nèi)的流速，利用流體力學(xué)得到力-磁場強度曲線，從而確定磁標記分子間非共價的相互作用力。

微流控芯片內(nèi)的流速控制0～1000rpm，利用微流體曳力公式F＝-6πηrv(其中，η是溶液的粘滯系數(shù)，r是顆粒物(磁探針)的半徑，v是流體的運動速度)可以確定施加作用力大??；根據(jù)不同流速下測量得到的磁場強度變化量，得到力-磁場強度曲線，進而獲得分子對發(fā)生解離所需作用力大小的信息。

利用Labview軟件同時控制微流控裝置和磁力儀檢測系統(tǒng)，可實現(xiàn)微擾力的原位施加和磁信號的原位檢測，有利于提高力譜測量的精準性和工作效率。

實施例1、安裝線性掃描裝置對超低場原子磁力儀的影響

在光學(xué)原子磁力儀的樣品通道中安裝線性掃描裝置，組成部分包括X-Y-Z三維位移馬達、樣品桿、旋轉(zhuǎn)固定臺。其中，樣品桿采用2mm直徑的石英棒，可以穩(wěn)定固定在掃描通道的進出口軸線上。通過優(yōu)化電動馬達的掃描速度，調(diào)節(jié)樣品桿運動方向，將線性掃描裝置對超低場原子磁力儀的影響降至最低。

如圖2所示，在安裝線性掃描裝置后，采用1000pT的方波磁場檢測超低場原子磁力儀的靈敏度。利用Labview軟件調(diào)節(jié)磁力儀各參數(shù)，可將磁場強度的背景噪音降至1pT，檢測靈敏度達到150fT·Hz^-1/2。

實施例2、在原子磁力儀內(nèi)的線性掃描平臺上檢測微流控芯片修飾的磁探針

在氨基修飾的玻璃基底上對中心區(qū)域進行局部醛基化修飾。將0.6ml 8.4mg/ml NaHCO₃水溶液，150mg mPEG-SVA,4mg Ald-PEG-SVA混合均勻后取上層清液1-2ul滴加至玻璃基底中心位點，加蓋上4mm小玻片，室溫反應(yīng)3h，然后用大量水清洗，得到局部醛基化基底。再將0.6ml 8.4mg/ml NaHCO₃水溶液，150mg mPEG-SVA混合均勻取上層清液20ul滴加至整個局部醛基化基底，反蓋上另一片局部醛基化基底,室溫反應(yīng)3h，然后用大量水清洗吹干。

然后在上述修飾好的玻璃基底上，用環(huán)氧樹脂膠固定含有微流體通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄片，在其上面再固定基底蓋片，形成玻片-PDMS-玻片的夾層。然后在PDMS薄片兩端的流體通道進出口上封裝聚四氟乙烯的流體管道，構(gòu)成簡單的微流控芯片，最后用環(huán)氧樹脂膠對整個芯片進行封裝加固。

利用微流控裝置，在芯片內(nèi)部基底上固定待研究的磁探針標記的雙鏈DNA分子對。雙鏈DNA分子一端氨基修飾，可與醛基化修飾的芯片基底連接；另一端生物素修飾，可與親和素修飾的磁探針M280連接。

在磁鐵磁化后，將含有磁標記DNA分子對的微流控芯片安裝到線性掃描樣品臺上，利用掃描磁成像的方式，掃描速度1mm/s，掃描長度220mm，獲得樣品的磁場曲線。在樣品掃描過程中，當磁探針處于最接近原子氣池傳感器的時候，測量的磁信號達到最強點。在如圖3所示的磁場曲線上，譜峰的高度對應(yīng)于樣品的磁場強度，測量得到的磁場強度為25pT。

實施例3、利用本發(fā)明的原位力譜方法測量雙鏈DNA(15bp)的力-磁場強度曲線

在實施例2中，采用15bp的雙鏈DNA分子，利用Labview軟件同時控制微流控裝置和磁力儀檢測系統(tǒng)，可實現(xiàn)微擾力的原位施加和磁信號的原位檢測?？刂莆⒘骺匦酒瑑?nèi)的流速0～500rpm，每個流速位點作用3分鐘。根據(jù)不同流速下測量得到的磁場強度變化量，得到力-磁場強度變化量曲線，進而獲得分子對發(fā)生解離所需作用力大小的信息。如圖4所示，15bp的雙鏈DNA分子在180rpm流速作用下發(fā)生解離。利用微流體曳力公式F＝-6πηrv(其中，η是流體的粘滯系數(shù)，r是顆粒物(磁探針)的半徑，v是流體的運動速度)可以得出15bp的雙鏈DNA分子間非共價相互作用力大小。

實施例4、利用本發(fā)明的原位力譜方法測量雙鏈DNA(16bp)的力-磁場強度曲線

在實施例2中，采用16bp的雙鏈DNA分子，利用Labview軟件同時控制微流控裝置和磁力儀檢測系統(tǒng)，可實現(xiàn)微擾力的原位施加和磁信號的原位檢測?？刂莆⒘骺匦酒瑑?nèi)的流速0～500rpm，每個流速位點作用3分鐘。根據(jù)不同流速下測量得到的磁場強度變化量，得到力-磁場強度變化量曲線，進而獲得分子對發(fā)生解離所需作用力大小的信息。如圖5所示，16bp的雙鏈DNA分子在220rpm流速作用下發(fā)生解離。利用微流體曳力公式F＝-6πηrv(其中，η是流體的粘滯系數(shù)，r是顆粒物(磁探針)的半徑，v是流體的運動速度)可以得到16bp的雙鏈DNA分子間非共價相互作用力大小。并且對比實施例3的測量結(jié)果，表明本發(fā)明的原位力譜方法具有了區(qū)分單堿基對的力譜分辨能力。