本發(fā)明涉及一種人抗肝腎微粒體抗體的快速定量檢測試劑盒，屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：自身免疫性肝病(autoimmuneliverdiseases)主要包括三種與自身免疫密切相關(guān)的、以肝膽損傷為主的疾病:自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis,AIH)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis,PBC)和原發(fā)性硬化性膽管炎(primarysclerosingcholangitis,PSC)。AIH是一種伴循環(huán)自身抗體和高免疫球蛋白血癥、病因未明、呈慢性炎性壞死的肝臟疾病，PBC是以自身免疫介導(dǎo)的肝內(nèi)膽管損傷、以后呈肝纖維化、最終導(dǎo)致肝功能衰竭為特征的一類病因不明的自身免疫性肝臟疾病，PSC是一種原因不明的慢性綜合征，其特征是肝外和/或肝內(nèi)膽管彌漫性炎癥及纖維化所引起的慢性膽汁淤積癥。近年來，國際上對自身免疫性肝病基礎(chǔ)與臨床的研究高度重視，并且進(jìn)展迅速，主要涉及自身免疫性肝病的發(fā)病機(jī)制、遺傳背景、相關(guān)自身抗體及其靶抗原性質(zhì)、臨床流行病學(xué)、臨床診斷及治療和預(yù)后等方面。自身免疫性肝病的診斷主要依靠病史、臨床表現(xiàn)、體征和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。肝組織病理學(xué)檢查被認(rèn)為是AIH，PBC診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但此項(xiàng)檢查臨床應(yīng)用具有局限性，例如，自身免疫性肝病的肝活檢組織病理學(xué)表現(xiàn)特異性不強(qiáng)，非自身免疫性肝病所特有；患者不愿或不適接受此項(xiàng)創(chuàng)傷性檢查；此外，目前多數(shù)醫(yī)院采用B超引導(dǎo)下細(xì)針穿刺取材進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查，此檢查受取材標(biāo)本局限，是否能取得病變組織，對檢查結(jié)果影響很大。盡管如此，肝組織病理學(xué)檢查對自身免疫性肝病診斷、鑒別診斷及病變程度的判斷至關(guān)重要，仍是診斷的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。AIH，PBC早期病變(膽管炎期、慢性膽汁淤積期)屬臨床治療可逆轉(zhuǎn)期或可部分逆轉(zhuǎn)期，后期或終末期(肝纖維化/肝硬化期、肝衰竭期)屬臨床治療不可逆轉(zhuǎn)期，愈后不佳。因此，早期診斷、早期治療尤為重要。目前自身免疫性肝病的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為遺傳易感性是主要因素。AIH存在明顯的家族成員集中發(fā)病現(xiàn)象，而病毒感染、藥物和環(huán)境則可能是在遺傳易感基礎(chǔ)上的促發(fā)因素。幾乎所有AIH都存在不同程度的肝纖維化，嚴(yán)重病例可出現(xiàn)肝硬化。AIH根據(jù)血清免疫學(xué)檢查可分為I型(ANA、SMA)、II型(抗LKM-1抗體)和m型(抗SLA/LP抗體)。人抗肝腎微粒體1型抗體(抗LKM-1抗體)為自身免疫性肝炎II型的血清學(xué)標(biāo)志，目前臨床上抗LKM-1抗體的檢測有膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法。膜條免疫法應(yīng)用的是膜條顯色技術(shù)，其特點(diǎn)為固定幾個項(xiàng)目在同一膜條測定，一般通過手工或者半自動膜條儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，最終通過肉眼進(jìn)行定性判定，該技術(shù)靈敏度低，反應(yīng)時間長，檢測項(xiàng)目只能固定搭配組合，靈活性差。酶聯(lián)免疫吸附法的靈敏度在膜條免疫法基礎(chǔ)上有所提升，但仍然較低，并且線性范圍窄，重復(fù)性差，反應(yīng)時間也較長，仍然不能很好滿足臨床的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種抗LKM-1抗體的快速定量檢測試劑盒，其為熒光免疫層析檢測試紙卡；所述試紙卡是在PVC板上順次相互搭接經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標(biāo)記LKM-1抗原的結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后形成試紙卡。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述稀土熒光微球摻雜有銪元素；所述稀土熒光微球的直徑為50-100nm。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述LKM-1抗原為細(xì)胞色素P4502D6蛋白(簡稱CYP2D6蛋白)。在本發(fā)明進(jìn)一步地實(shí)施方案中，所述稀土熒光微球標(biāo)記LKM-1抗原的制備方法為：1、稀土熒光微球的活化；2、稀土熒光微球標(biāo)記的CYP2D6蛋白制備：將CYP2D6蛋白與上述活化的稀土熒光微球混合，反應(yīng)過夜；然后加入硼氫化鈉反應(yīng)；離心洗滌3遍，重懸于的pH7.6的100mMTris-HCl緩沖液中(含0.5％GSH、0.1％BSA和0.2％木質(zhì)素磺酸鈉)，4℃避光保存?zhèn)溆?。在本發(fā)明另一個實(shí)施方案中，所述吸附熒光微球標(biāo)記LKM-1抗原的結(jié)合墊通過以下方法制備：將玻璃纖維膜浸泡于含0.5％GSH、1.5％木質(zhì)素磺酸鈉和0.5％BSA的100mMTris-HCl緩沖液中，pH7.6；浸泡，然后取出并烘箱烘干，將玻璃纖維膜置于噴臺上，用微定量噴頭將稀土熒光微球標(biāo)記的LKM-1抗原溶液噴到玻璃纖維膜，即得。在本發(fā)明又一個實(shí)施方案中，所述包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的制備方法如下：用包被稀釋液將兔抗人CYP2D6單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體制成溶液，將它們分別作為檢測線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，然后置于烘箱中烘干。在一個具體實(shí)施方案中，所述包被稀釋液為含0.5％BSA和0.5％木質(zhì)素磺酸鈉的100mMTris-HCl緩沖液，pH7.4。在本發(fā)明又一個實(shí)施方案中，所述樣品墊的制備方法如下：將玻璃纖維膜浸泡于0.25MTris緩沖液(pH7.5)，含1.2％TritonX-100，2.5％BSA的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時。在本發(fā)明中，所述試紙卡的組裝過程如下：在PVC板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。所述試劑盒，檢測方法為：1)將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；2)精確吸取100μl血清樣本，樣本為全血時吸取150μl樣本，加入到樣本孔中，15-30分鐘內(nèi)用熒光免疫層析分析儀定量判定結(jié)果；3)設(shè)置好儀器相關(guān)參數(shù)后將試紙卡放入倉內(nèi)進(jìn)行檢測，儀器將顯示出樣品濃度的定量測定結(jié)果。在本發(fā)明抗LKM-1抗體快速定量檢測試劑盒的制備過程中，在噴涂液中添加了木脂素磺酸鈉，其作為表面活性劑時，不僅抗體穩(wěn)定性效果極佳，并且由于其配體作用導(dǎo)致對銪元素?zé)晒馕⑶虬l(fā)光強(qiáng)度隨著時間延長沒有出現(xiàn)減弱現(xiàn)象。另外，考慮到作為LKM-1抗原的CYP2D6蛋白其本身是一種廣泛存在于人肝臟微粒體中藥物代謝酶，雖然其抗LKM-1抗體具有最佳的結(jié)合效果，但是其體外的穩(wěn)定性不佳，為此本發(fā)明針對CYP2D6蛋白篩選出了一種極佳的特殊穩(wěn)定劑谷胱甘肽(GSH)；從而提高了整體試劑盒的穩(wěn)定性。具體實(shí)施方式還可進(jìn)一步通過實(shí)施例來理解本發(fā)明，其中所述實(shí)施例說明了一些制備或使用方法。然而，要理解的是，這些實(shí)施例不限制本發(fā)明。現(xiàn)在已知的或進(jìn)一步開發(fā)的本發(fā)明的變化被認(rèn)為落入本文中描述的和以下要求保護(hù)的本發(fā)明范圍之內(nèi)。在本發(fā)明中，在無特殊說明的前提下，“％”代表重量百分比。實(shí)施例1抗LKM-1抗體檢測試紙卡制備包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的制備：用包被稀釋液將兔抗人CYP2D6單克隆抗體(LifeSpanBioSciencesInc.)和羊抗小鼠IgG抗體調(diào)整濃度到12mg/ml，膜液量為2μl/cm，將它們分別作為檢測線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，檢測線和質(zhì)控線間隔為5mm，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時。所述包被稀釋液組成為含0.5％BSA和0.5％木質(zhì)素磺酸鈉的100mMTris-HCl緩沖液，pH7.4。吸附熒光微球標(biāo)記的抗原的結(jié)合墊制備：1、稀土熒光微球的醛基化：取30mg稀土熒光微球，用50mM，pH9.0的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為10分鐘，最后重懸于200μl的上述碳酸鹽緩沖液中。加入400μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時。采用同樣的離心法洗滌和重懸到200μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃?zhèn)溆谩?、稀土熒光微球標(biāo)記的CYP2D6蛋白的制備：將10mg的CYP2D6蛋白(PROSPEC公司)與上述醛基化的稀土熒光微球溶液混合，4℃反應(yīng)過夜。然后，加入硼氫化鈉至終濃度15mM，4℃反應(yīng)6小時；然后用50mMpH7.6的Tris-HCl緩沖液，采用離心法洗滌3遍，重懸于200μl的100mMTris-HCl緩沖液中(含0.5％GSH、0.1％BSA和0.2％木質(zhì)素磺酸鈉)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?、將玻璃纖維膜浸泡于100mMTris-HCl緩沖液中(含0.5％GSH、1.5％木質(zhì)素磺酸鈉和0.5％BSA，pH7.6)，4℃浸泡4小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用。將玻璃纖維膜在Bio-DotXYZ3050三維噴點(diǎn)平臺上，用Bio-JetQuanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標(biāo)記的CYP2D6蛋白溶液噴到玻璃纖維膜，37℃烘干4小時，備用。樣品墊的制備：將玻璃纖維膜浸泡于0.25MTris緩沖液(pH7.5)，含1.2％TritonX-100，2.5％BSA的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時。試紙卡的組裝：在PVC板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。實(shí)施例2試紙卡線性范圍、精密度、特異性測試和靈敏度測試取含量為0、5、20、50、100和200RU/ml的抗LKM-1抗體標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用試紙卡進(jìn)行測定。檢測方法：將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡(實(shí)施例1制備)，平放；精確吸取100μl標(biāo)準(zhǔn)品樣本，加入到試紙卡的樣本孔中，20分鐘后用熒光免疫層析分析儀進(jìn)行檢測。線性：以熒光強(qiáng)度值和對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體為Y(熒光強(qiáng)度)＝161.1X+17.4，R2值>0.999，說明本發(fā)明試紙卡在0-200RU/ml范圍內(nèi)線性良好。數(shù)據(jù)見下表：抗LKM-1抗體標(biāo)準(zhǔn)品熒光強(qiáng)度(RLU)0RU/ml1.95RU/ml804.210RU/ml162620RU/ml324950RU/ml8099100RU/ml16141200RU/ml32223靈敏度：采用PBS緩沖液作為空白對照，以空白對照2倍熒光強(qiáng)度作為最低檢測濃度(即靈敏度)，結(jié)果表明：0.1RU/ml標(biāo)準(zhǔn)品平行測定5次的平均熒光強(qiáng)度為34.2；而空白對照的平均熒光強(qiáng)度為2.1。說明試紙卡的靈敏度可達(dá)0.1RU/ml。精密度：取已知高濃度和低濃度抗LKM-1抗體含量的全血樣本，樣本抗LKM-1抗體含量分別為17.8RU/ml和94.6RU/ml；采用實(shí)施例1制備試紙卡重復(fù)測定10次，計算CV。結(jié)果表明低濃度樣本的CV為1.84％；高濃度樣本的CV為2.29％。實(shí)施例3穩(wěn)定性測試將實(shí)施例1制備的試紙卡在37℃環(huán)境下放置3個月，然后按照實(shí)施例2的方法測定試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線及R2值，并采用50RU/ml的抗LKM-1抗體標(biāo)準(zhǔn)品對試劑盒進(jìn)行精密度考察(平行測定10次，計算CV％)，具體結(jié)果如下：對比例1試紙卡制備同實(shí)施例1，區(qū)別在于，在制備各步驟中不添加木質(zhì)素磺酸鈉。對比例2試紙卡制備同實(shí)施例1，區(qū)別在于，在制備各步驟中不添加GSH。對比例3試紙卡制備同實(shí)施例1，區(qū)別在于，在制備各步驟中將木質(zhì)素磺酸鈉替換為等量的吐溫20。實(shí)施例4臨床測試從醫(yī)院收集AIH患者及健康人的血液樣本，采用實(shí)施例1試紙卡對樣本進(jìn)行測定，并且采用相同樣本通過ELISA方法進(jìn)行測定，結(jié)果見下表：樣本編號實(shí)施例1ELISA12.6RU/ml2.6RU/ml24.2RU/ml4.3RU/ml329.4RU/ml29.9RU/ml433.2RU/ml32.8RU/ml518.7RU/ml19.2RU/ml本
發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個或更多個技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。當(dāng)前第1頁1 2 3