本發(fā)明屬于化學(xué)分析領(lǐng)域，具體涉及一種利用液液微萃取技術(shù)結(jié)合合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPC²-MS/MS）對卷煙主流煙氣中9種芳香胺的釋放量的快速定量分析方法。

背景技術(shù)：

芳香胺是指具有一個芳香性取代基的胺，卷煙煙氣中也存在一些芳香胺。2012年美國食品和藥物管理局（FDA）發(fā)布的關(guān)于煙草制品及煙氣中的有害物質(zhì)和潛在有害物質(zhì)成分列表中明確列出了對1-萘胺、2-萘胺、3-氨基聯(lián)苯、4-氨基聯(lián)苯、鄰甲氧基苯胺、2,6-二甲基苯胺和鄰甲苯胺成分的管制與披露。

煙氣中芳香胺類化學(xué)物的檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。而目前未見到合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測主流煙氣中芳香胺的相關(guān)報道。作為一種新興的儀器檢測技術(shù)，合相色譜質(zhì)譜以無毒、不易燃且不污染環(huán)境的超臨界流體CO₂作為主要流動相，是一種真正的綠色環(huán)保技術(shù)，且相比于液相色譜和氣相色譜有很多突出優(yōu)勢，對于結(jié)構(gòu)類似物、異構(gòu)體、對映體和非對映異構(gòu)體具有很好地分離度和選擇性。

液液微萃取是自2006年發(fā)展起來的一種樣品前處理技術(shù)，其可視為液液萃取溶劑最小化的處理過程。當(dāng)前，液液微萃取技術(shù)因其具有簡便、提取濃縮效率高等特點，已在水相中弱極性物質(zhì)的分析領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

本發(fā)明旨在根據(jù)卷煙煙氣的樣品特點，利用液液微萃取前處理方法，通過合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙主流煙氣中的9種芳香胺（1-萘胺、2-萘胺、3-氨基聯(lián)苯、4-氨基聯(lián)苯、鄰甲氧基苯胺、2,6-二甲基苯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺）進行分析檢測，簡化樣品前處理過程、縮短分析檢測時間，對卷煙產(chǎn)品中芳香胺有害成分的檢測研究工作提供技術(shù)支持。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種卷煙主流煙氣中9種芳香胺（1-萘胺、2-萘胺、3-氨基聯(lián)苯、4-氨基聯(lián)苯、鄰甲氧基苯胺、2,6-二甲基苯胺、鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺）的UPC²-MS/MS分析方法，主要是首先對卷煙樣品進行抽吸測試，以劍橋濾片捕集主流煙氣中的芳香胺，然后利用液液微萃取前處理技術(shù)進行預(yù)處理，最后采用UPC²-MS/MS對芳香胺進行檢測，并通過內(nèi)標(biāo)法進行定量分析。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:

一種液液微萃取合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測卷煙主流煙氣中9種芳香胺的方法，首先通過劍橋濾片捕集主流煙氣中的釋放的芳香胺，加入內(nèi)標(biāo)，以鹽酸水溶液對抽吸得到的劍橋濾片進行振蕩提取，加入氫氧化鈉水溶液將pH調(diào)節(jié)至12~13，加入一定量的萃取溶劑甲苯、鹽析劑氯化鈉進行震搖，離心后取出上層甲苯層，以合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPC²-MS/MS）對其中的芳香胺含量進行分析，并通過內(nèi)標(biāo)法進行定量。具體步驟如下：

（1）樣品前處理：

首先在加拿大深度抽吸模式（抽吸容量55 mL，抽吸時間2 s，抽吸頻率30 s，100%堵塞過濾通風(fēng)孔）下，采用轉(zhuǎn)盤式吸煙機對10支參比卷煙樣品進行抽吸測試，將抽吸得到的劍橋濾片放入到100 mL塑料瓶中，向瓶中加入60 mL 5% 鹽酸水溶液和 250 μL濃度為4.0 mg/L的混合內(nèi)標(biāo)溶液，將塑料瓶置于振蕩器上，以1000 r/min的速率振蕩提取30 min；向瓶中加入4.0 mol/L的氫氧化鈉水溶液以調(diào)節(jié)pH至12~13，加入萃取溶劑甲苯2 mL, 加入鹽析劑氯化鈉2 g，于渦旋混合儀上以2000 r/min振蕩2 min，然后以10000 r/min離心2 min，取出上層甲苯層，加入至2 mL包括50 mg N-丙基乙二胺，50 mg C18，7.5 mg 石墨化炭黑，150 mg 無水硫酸鎂的分散固相萃取凈化管中，于渦旋混合儀上以2000 r/min振蕩2 min，然后以10000 r/min離心2 min，即為樣品待測液；

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制：配制包括9種芳香胺和6種氘代內(nèi)標(biāo)的單標(biāo)儲備液的配制、9種芳香胺和6種氘代內(nèi)標(biāo)的混標(biāo)儲備液的配制以及系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制；具體過程如下：

單標(biāo)儲備液：以甲醇作為溶劑分別配制質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的9種芳香胺和6種氘代內(nèi)標(biāo)的單標(biāo)儲備液；

混標(biāo)儲備液：分別移取200 μL鄰甲苯胺、間甲苯胺、對甲苯胺；50 μL 1-萘胺、2-萘胺；20 μL 2,6-二甲基苯胺；10 μL 3-氨基聯(lián)苯、4-氨基聯(lián)苯、鄰甲氧基苯胺的單標(biāo)儲備液，以甲苯定容至10 mL, 得到9種芳香胺的混合儲備液；分別移取50 μL 6種氘代內(nèi)標(biāo)的單標(biāo)儲備液，以甲苯定容至25 mL, 得到質(zhì)量濃度為4 mg/mL的6種氘代內(nèi)標(biāo)的混合儲備液；

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL的9種芳香胺的混合儲備液，分別加入50 μL的6種氘代內(nèi)標(biāo)的混合儲備液，以甲苯稀釋定容至2 mL，得到系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

（3）UPC²-MS/MS測定：

吸取配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入UPC²-MS/MS，以標(biāo)準(zhǔn)系列峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比對其質(zhì)量建立線性回歸方程，對樣品待測液進行測定，測得各目標(biāo)芳香胺的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比，代入線性回歸方程，分別得到樣品中9種芳香胺的含量。

UPC²-MS/MS分析條件

色譜條件：色譜柱選用HSS C18色譜柱，1.7 mm；柱溫：60℃；進樣量：2 mL；助溶劑：甲醇；流速：2 mL/min；補償溶劑：0.1%甲酸的甲醇；流速：0.2 mL/min；洗脫梯度如表1所示：

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧電離源（ESI），溫度：150℃；毛細管電壓：3.0 kV；去溶劑氣溫度：300℃；去溶劑氣流速：800 L/h；反吹氣流速：50 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），詳細參數(shù)見表2。

本發(fā)明具有如下效果：

（1）本方法首次通過液液微萃取前處理方法，建立了一種卷煙主流煙氣中9種芳香胺的合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的快速測定方法。主要是根據(jù)卷煙煙氣樣品的特點，對液液微萃取前處理方法的提取溶劑、鹽析劑等進行了選擇與優(yōu)化，并對影響色譜分離條件的色譜柱的選擇、助溶劑的選擇、流速以及系統(tǒng)背壓進行了優(yōu)化。

（2）本方法的樣品前處理過程以及合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測過程簡單、快速，大大節(jié)省了分析時間，便于批量樣品分析。

（3）本方法的重復(fù)性好，適用于卷煙主流煙氣中9種芳香胺釋放量的檢測。

附圖說明：

圖1：本發(fā)明測定方法流程圖。

圖2：提取溶劑的選擇。

圖3：鹽析劑的選擇。

圖4：標(biāo)準(zhǔn)工作溶液總離子流圖。

具體實施方式

本發(fā)明結(jié)合實例做進一步描述，但并不是限制本發(fā)明。

實例1：

（1）儀器與試劑：

合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；RM-200A轉(zhuǎn)盤式吸煙機（德國Borgwaldt公司）；Labnet VX-200旋渦混合儀（美國Labnet公司）；Sigma 3-30K高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

鄰甲苯胺（o-TOL）、間甲苯胺（m-TOL）、對甲苯胺（p-TOL）、2,6-二甲基苯胺（2,6-DMA）、鄰甲氧基苯胺（o-ASD）、1-萘胺（1-NA）、2-萘胺（2-NA）、3-氨基聯(lián)苯（3-ABP）、4-氨基聯(lián)苯（4-ABP），D9-鄰甲苯胺（o-TOL-d9）、D7-鄰甲氧基苯胺（o-ASD-d7）、D7-1-萘胺（1-NA-d7）、D7-2-萘胺（2-NA-d7）、D11-2,6-二甲基苯胺（2,6-DMA-d11）、D9-4-氨基聯(lián)苯（4-ABP-d9）（德國Dr. Ehrensorfer公司）；甲苯、正己烷、環(huán)己烷（色譜純，美國J. T. Baker公司），氫氧化鈉、氯化鈉、硫酸鈉（分析純，天津北方試劑公司），2 mL的分散固相萃取凈化試劑盒（50 mg N-丙基乙二胺，50 mg C18，7.5 mg 石墨化炭黑，150 mg 無水硫酸鎂）（美國Agilent公司）；3R4F參比卷煙樣品（美國肯塔基大學(xué)）。

（2）樣品前處理：

首先在加拿大深度抽吸模式（抽吸容量55 mL，抽吸時間2 s，抽吸頻率30 s，100%堵塞過濾通風(fēng)孔）下，采用轉(zhuǎn)盤式吸煙機對參比卷煙樣品（10支）進行抽吸測試。將抽吸得到的劍橋濾片放入到100 mL塑料瓶中，向瓶中加入60 mL 5% 鹽酸水溶液和 250 μL濃度為4.0 mg/L的混合內(nèi)標(biāo)溶液，將塑料瓶置于振蕩器上，以1000 r/min的速率振蕩提取30 min。向瓶中加入4.0 mol/L的氫氧化鈉水溶液以調(diào)節(jié)pH至12~13，加入萃取溶劑2 mL, 加入鹽析劑氯化鈉2 g，于渦旋混合儀上以2000 r/min振蕩2 min，然后以10000 r/min離心2 min。取出上層萃取劑層，加入至2 mL的分散固相萃取凈化管（50 mg N-丙基乙二胺，50 mg C18，7.5 mg 石墨化炭黑，150 mg 無水硫酸鎂）中，于渦旋混合儀上以2000 r/min振蕩2 min，然后以10000 r/min離心2 mi，取上清液待UPC²-MS/MS分析。

其中分別以甲苯、正己烷和環(huán)己烷為萃取劑，對萃取溶劑的選擇進行了優(yōu)化，其結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明甲苯的萃取效率最高。此外，對鹽析劑的選擇也進行了優(yōu)化。如圖3所示，結(jié)果表明加入鹽析劑有助于提高萃取效率，因氯化鈉和硫酸鈉的差別不大，最終選擇氯化鈉作為鹽析劑。

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制主要包括9種芳香胺和6種氘代內(nèi)標(biāo)的單標(biāo)儲備液的配制、9種芳香胺和6種氘代內(nèi)標(biāo)的混標(biāo)儲備液的配制以及系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制，具體配制過程如前面所述，此處不再重復(fù)。

（4）UPC²-MS/MS分析

首先對影響9種芳香胺及6種氘代內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)進行了優(yōu)化。然后對影響分析效果的實驗條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，包括色譜柱、助溶劑、流速。結(jié)果表明在C18柱上的分離效果最好，9種芳香胺全部出峰，且當(dāng)以甲醇為助溶劑、系統(tǒng)流速為2.0 mL/min時能得到最好的分離度。在最優(yōu)條件下得到標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖如圖4所示。

（5）分析結(jié)果

將6種濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行UPC²-MS/MS分析，以目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比對芳香胺的濃度進行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程、相關(guān)系數(shù)，本法線性關(guān)系良好，結(jié)果如表3所示。

對3R4F參比卷煙進行抽吸測試，對其中的芳香胺釋放量進行UPC²-MS/MS分析測定。此外，將三種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到載有煙氣總粒相物的劍橋濾片上，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4。可見除了2,6-DMA的回收率較低之外，其他8種芳香胺的回收率的范圍均在66%～130%之間。2,6-DMA測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差以及回收率均較低，這可能是由于2,6-DMA揮發(fā)性較強導(dǎo)致的，因此樣品預(yù)處理后應(yīng)盡快分析。

此外，將該方法的測定結(jié)果與傳統(tǒng)的現(xiàn)行國標(biāo)方法的測定結(jié)果進行了比對，結(jié)果如表5所示，可見除3-ABP和4-ABP的測定結(jié)果有一定差異外，其余7種芳香胺而言該方法與傳統(tǒng)方法測定結(jié)果的一致性較好。由于本方法的基于液液微萃取的前處理過程簡單，且采用新穎、環(huán)保、快速的合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，因此提供了一種快速、準(zhǔn)確的主流煙氣中芳香胺測定的新方法。

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