本發(fā)明屬于植物活性組分定量檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的同步定量檢測方法。

背景技術(shù)：

大量研究表明，十字花科蔬菜中含有的天然活性成分具有預(yù)防多種癌癥的功效，經(jīng)常大量食用十字花科蔬菜的人群患多種癌癥的概率顯著低于不食用或少量食用十字花科蔬菜的人群。十字花科蔬菜中含有大量的硫代葡萄糖苷和黑芥子酶，在人們加工和食用十字花科蔬菜過程中，黑芥子酶可快速水解硫代葡萄糖苷，并轉(zhuǎn)化生成具有高效抗癌活性的異硫氰酸酯，從而促使十字花科蔬菜具有抗癌防癌的功效。蘿卜是一種人們?nèi)粘４罅渴秤玫氖只剖卟?，蘿卜中含有豐富的硫代葡萄糖苷和黑芥子酶，硫代葡萄糖苷主要為氧化型蘿卜硫苷(4-甲基亞磺?；?3-丁烯基硫代葡萄糖苷，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)和還原型蘿卜硫苷(4-甲硫基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)。在人們加工和食用蘿卜的過程中，黑芥子酶可快速水解氧化型和還原型蘿卜硫苷，并分別轉(zhuǎn)化生成具有高效抗癌活性的氧化型蘿卜硫素(4-甲基亞磺?；?3-丁烯基異硫氰酸酯)和還原型蘿卜硫素(4-甲硫基-3-丁烯基異硫氰酸酯)，從而促使蘿卜具有了抗癌防癌的功效。

氧化型和還原型蘿卜硫素均是具有誘導(dǎo)Ⅱ相解毒酶活性的異硫氰酸酯，不僅可提高人體對致癌物的清除能力，還可抑制并殺死癌細胞。研究表明，氧化型和還原型蘿卜硫素均可通過阻斷癌細胞周期循環(huán)以及促進癌細胞凋亡而阻礙腫瘤組織的生長；氧化型和還原型蘿卜硫素均可作為細胞致癌代謝途徑阻遏因子，通過多重機制特異性地調(diào)節(jié)組織細胞致癌代謝過程；氧化型和還原型蘿卜硫素均能夠高效誘導(dǎo)醌氧化還原酶的表達，加速細胞中致癌物質(zhì)的代謝排出過程，從而具有化學(xué)預(yù)防癌癥的功效；氧化型和還原型蘿卜硫素均具有抑制幽門螺桿菌生長增殖和小鼠胃炎的活性，并能夠通過抑制和消除幽門螺桿菌感染，從而有效預(yù)防幽門螺桿菌感染引起的胃癌。氧化型和還原型蘿卜硫素均是蘿卜中發(fā)現(xiàn)的具有高效抗癌活性的植物活性組分，對乳腺癌、肺癌、前列腺癌以及腸癌等多種癌癥均具有較強的預(yù)防和抑制功效。但氧化型和還原型蘿卜硫素穩(wěn)定性均極差，易降解，且均易與含巰基的化合物反應(yīng)而失去抗癌活性，而它們的前體物質(zhì)氧化型和還原型蘿卜硫苷化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，并在人體攝入后，可在腸道微生物的作用下分別轉(zhuǎn)化生成具有高效抗癌活性的氧化型和還原型蘿卜硫素，因此，氧化型和還原型蘿卜硫苷均可作為抗癌和防癌天然活性成分，從蘿卜中提取富含氧化型和還原型蘿卜硫苷的蘿卜提取物，并將其添加至食品、功能性食品、保健品和藥品中，將更好地促進我國癌癥預(yù)防和治療事業(yè)的發(fā)展。

目前，現(xiàn)有的氧化型和還原型蘿卜硫苷檢測方法主要為高效液相色譜法，該方法是一種檢測氧化型和還原型蘿卜硫苷含量的有效方法，具有準(zhǔn)確度和精密度較高的特點，但已有的檢測方法都是單獨定量檢測氧化型蘿卜硫苷或還原型蘿卜硫苷，且在流動相選擇、檢測波長選擇、檢測準(zhǔn)確度和精密度等方面均需進一步改進。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明中針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種快速、高效、準(zhǔn)確的蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的同步定量檢測方法。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的同步定量檢測方法，包括以下步驟：

(1)將氧化型和還原型蘿卜硫苷標(biāo)準(zhǔn)品溶解于甲醇-水溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液；利用甲醇-水溶液將所述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液倍比稀釋，微孔濾膜過濾，得系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

(2)稱取75mg待測蘿卜提取物，溶解于5mL甲醇-水溶液，微孔濾膜過濾，得蘿卜提取物樣品溶液；

(3)將步驟(1)所得系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和步驟(2)所得蘿卜提取物樣品溶液分別進行高效液相色譜檢測分析，分別獲得標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積；

檢測條件如下：5μm，4.6×250mm的DIKMA Diamodsil C-18色譜柱，進樣量為5μL，柱溫為30℃；流動相A為甲醇/濃度為0.1％的三氟乙酸水溶液＝1/99，v/v；流動相B為甲醇/濃度為0.1％的三氟乙酸水溶液＝3/7，v/v；梯度洗脫模式，30分鐘內(nèi)流動相B比例從0％線性增加至100％；流動相流速為1mL/min；流動相用量為1000mL；紫外線檢測波長為235nm；采用外標(biāo)法定量；

(4)根據(jù)步驟(3)所得檢測結(jié)果，以系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，對應(yīng)色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)進行線性回歸分析，分別建立氧化型和還原型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；

(5)根據(jù)步驟(3)所得檢測結(jié)果，分別將樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積代入步驟(4)所得對應(yīng)的曲線方程中，獲得樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度，計算獲得蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量。

所述步驟(1)中的系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度均為0.0625-2.000mg/mL。

所述步驟(1)和(2)中的甲醇-水溶液均為甲醇和水按照1：99的體積比制得的；所述微孔濾膜為孔徑0.45μm的有機濾膜。

所述(2)中的蘿卜提取物為蘿卜種子、蘿卜芽苗或蘿卜根莖的提取物。

所述步驟(4)中的氧化型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝1.2270+48.7148X，R＝0.9994；還原型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝0.2273+76.9141X，R＝0.9999。

所述步驟(5)中的蘿卜提取物中氧化型蘿卜硫苷的含量計算方程為：氧化型蘿卜硫苷的含量＝5×氧化型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度÷蘿卜提取物樣品質(zhì)量×100％；蘿卜提取物中還原型蘿卜硫苷的含量計算方程為：還原型蘿卜硫苷的含量＝5×還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度÷蘿卜提取物樣品質(zhì)量×100％。

本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明采用梯度洗脫方式，可同步洗脫氧化型和還原型蘿卜硫苷，從而實現(xiàn)蘿卜提取物樣品中氧化型和還原型蘿卜硫苷的同步定量檢測，顯著降低了檢測成本。

2.本發(fā)明采用梯度洗脫方式，不僅可充分洗脫氧化型和還原型蘿卜硫苷，還可充分洗脫極性較低的雜質(zhì)成分，從而避免過多的雜質(zhì)成分在色譜柱中發(fā)生死吸附，顯著提高了色譜柱的使用壽命。

3.本發(fā)明的同步定量檢測方法實現(xiàn)了氧化型和還原型蘿卜硫苷兩種活性組分的同步定量檢測，顯著提高了定量檢測效率，大大降低了定量檢測成本；具有快速、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點，檢測更加靈敏，氧化型和還原型蘿卜硫苷的定量限分別可達0.0045mg/mL和0.0025mg/mL。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的氧化型和還原型蘿卜硫苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)；

圖中：a為氧化型蘿卜硫苷；b為還原型蘿卜硫苷；

圖2為本發(fā)明的氧化型和還原型蘿卜硫苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖0.0625mg/mL；

圖3為本發(fā)明氧化型和還原型蘿卜硫苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖0.250mg/mL；

圖4為本發(fā)明為氧化型和還原型蘿卜硫苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖2.000mg/mL；

圖5為本發(fā)明實施例1的蘿卜提取物樣品溶液的色譜圖；

圖6為本發(fā)明實施例2的蘿卜提取物樣品溶液的色譜圖；

圖7為本發(fā)明實施例3的蘿卜提取物樣品溶液的色譜圖。

圖2-7中：峰1代表氧化型蘿卜硫苷；峰2代表還原型蘿卜硫苷。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施例，對本發(fā)明的檢測技術(shù)方案作進一步的描述，但這些實施例并不構(gòu)成對本發(fā)明要求保護范圍的限制。

實施例1

蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的同步定量檢測方法，包括以下步驟：

(1)將氧化型和還原型蘿卜硫苷標(biāo)準(zhǔn)品溶解于甲醇-水溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液；利用甲醇-水溶液將所述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液倍比稀釋，微孔濾膜過濾，得系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

所述步驟(1)中的系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度均分別為0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.250mg/mL、0.500mg/mL、1.000mg/mL和2.000mg/mL；

(2)稱取75mg待測蘿卜提取物，溶解于5mL甲醇-水溶液，微孔濾膜過濾，得蘿卜提取物樣品溶液；共設(shè)置并抽取了3種待測蘿卜提取物樣品，分別如表1中所述的樣品1、樣品2和樣品3；

所述步驟(1)和(2)中的甲醇-水溶液均為甲醇和水按照1：99的體積比制得的；所述微孔濾膜為孔徑0.45μm的有機濾膜。

所述(2)中的蘿卜提取物為蘿卜芽苗的提取物。

(3)將步驟(1)所得系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和步驟(2)所得蘿卜提取物樣品溶液分別進行高效液相色譜檢測分析，分別獲得標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積；

檢測條件如下：5μm，4.6×250mm的DIKMA Diamodsil C-18色譜柱，進樣量為5μL，柱溫為30℃；流動相A為甲醇/濃度為0.1％的三氟乙酸水溶液＝1/99，v/v；流動相B為甲醇/濃度為0.1％的三氟乙酸水溶液＝3/7，v/v；梯度洗脫模式，30分鐘內(nèi)流動相B比例從0％線性增加至100％；流動相流速為1mL/min；流動相用量為1000mL；紫外線檢測波長為235nm；采用外標(biāo)法定量；

(4)根據(jù)步驟(3)所得檢測結(jié)果，氧化型蘿卜硫苷質(zhì)量濃度為0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.250mg/mL、0.500mg/mL、1.000mg/mL和2.000mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液對應(yīng)的色譜峰面積分別為4.0058、6.4441、12.7776、26.3434、52.0528、97.5527；還原型蘿卜硫苷質(zhì)量濃度為0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.250mg/mL、0.500mg/mL、1.000mg/mL和2.000mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液對應(yīng)的色譜峰面積分別為4.9265、9.5765、19.3007、39.2233、77.3107、153.8754；以系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，對應(yīng)色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)進行線性回歸分析，分別建立氧化型和還原型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；

所述步驟(4)中的氧化型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝1.2270+48.7148X，R＝0.9994；還原型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝0.2273+76.9141X，R＝0.9999。

由此可知，在質(zhì)量濃度為0.0625-2.000mg/mL的范圍內(nèi)，氧化型和還原型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系均較好，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可分別用于計算蘿卜提取物樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度。

說明：常規(guī)的蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量一般在0.5-12％的范圍內(nèi)，按照本發(fā)明所述的“精密稱取75mg待測蘿卜提取物樣品，溶解于5mL的1％甲醇-水溶液中，作為蘿卜提取物樣品溶液”，能夠滿足所得蘿卜提取物樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度均在0.0625-2.000mg/mL的范圍內(nèi)。因此，可通過設(shè)置不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，以能夠符合要求的樣品質(zhì)量濃度為準(zhǔn)。

(5)根據(jù)步驟(3)所得檢測結(jié)果，分別將樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積代入步驟(4)所得對應(yīng)的曲線方程中，獲得樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度，計算獲得蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量。

所述步驟(5)中的蘿卜提取物中氧化型蘿卜硫苷的含量計算方程為：氧化型蘿卜硫苷的含量＝5×氧化型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度÷蘿卜提取物樣品質(zhì)量×100％；蘿卜提取物中還原型蘿卜硫苷的含量計算方程為：還原型蘿卜硫苷的含量＝5×還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度÷蘿卜提取物樣品質(zhì)量×100％。

具體如下：

樣品1中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積分別為7.3164和119.9826；樣品2中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積分別為7.2189和123.2129；樣品3中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積分別為7.4625和119.2903。

經(jīng)計算，樣品1-3中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度和樣品1-3中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量如表1所示。

表1蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量測定結(jié)果

為了驗證定量檢測方法的準(zhǔn)確性和實用性，本實施例進行了如下試驗：

1.精密度試驗

分別取3種質(zhì)量濃度的氧化型和還原型蘿卜硫苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0.125、0.250、0.500mg/mL，在同一檢測條件下連續(xù)測定3次，分別獲得氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積，并計算獲得氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積的RSD值(RSD值，即相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，又稱變異系數(shù)，反映檢測方法變異程度的指標(biāo)；當(dāng)RSD值小于3％時，說明本發(fā)明的檢測方法變異程度較小)。精密度試驗結(jié)果如表2所示。

表2精密度試驗測定結(jié)果

由表2可知，3種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中，氧化型蘿卜硫苷色譜峰面積的RSD值分別為1.06％、0.55％和0.63％，還原型蘿卜硫苷色譜峰面積的RSD值分別為0.66％、0.61％和0.43％，均小于3％，表明本發(fā)明的定量檢測方法精密度良好，變異程度較小。

2.穩(wěn)定性試驗

吸取0.500mg/mL的氧化型和還原型蘿卜硫苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，室溫下保存于棕色瓶中，在同一檢測條件下，分別于標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制后0h、6h和12h，每個時間段連續(xù)測定3次，分別獲得氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積，并計算氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積的RSD值(當(dāng)RSD值小于3％時，說明本發(fā)明的樣品穩(wěn)定性較好)。穩(wěn)定性試驗結(jié)果如表3所示。

表3穩(wěn)定性試驗測定結(jié)果

由表3可知，保存0h、6h和12h后，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中氧化型蘿卜硫苷色譜峰面積的RSD值分別為0.63％、0.47％和0.53％，還原型蘿卜硫苷色譜峰面積的RSD值分別為0.43％、0.50％和0.31％，均小于3％，表明本發(fā)明的樣品溶液穩(wěn)定性較好。

3.重現(xiàn)性試驗

對蘿卜提取物樣品1中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量重復(fù)進行3次定量檢測，檢測方法采用實施例1中相應(yīng)的方法(當(dāng)RSD值小于5％時，說明本發(fā)明的檢測方法重現(xiàn)性較好)。重現(xiàn)性試驗結(jié)果如表4所示。

表4重現(xiàn)性試驗測定結(jié)果

由表4可知，通過3次重復(fù)定量檢測，蘿卜提取物樣品1中氧化型蘿卜硫苷的含量分別為0.83％、0.84％和0.85％，還原型蘿卜硫苷的含量分別為10.38％、10.33％和10.43％。經(jīng)計算，氧化型蘿卜硫苷色譜峰面積的RSD值為0.69％，還原型蘿卜硫苷色譜峰面積的RSD值為0.48％，均小于5％，說明本發(fā)明的檢測方法重現(xiàn)性較好。

4.回收率試驗

準(zhǔn)確制備已知氧化型和還原型蘿卜硫苷含量的蘿卜提取物樣品適量，精密稱定，分別加入氧化型和還原型蘿卜硫苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，進樣測定5次，獲得對應(yīng)的氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積，分別計算氧化型和還原型蘿卜硫苷的平均回收率和RSD值，結(jié)果如表5和表6所示。

表5氧化型蘿卜硫苷回收率試驗測定結(jié)果(1mL)

表6還原型蘿卜硫苷回收率試驗測定結(jié)果(1mL)

由表5和表6可知，蘿卜提取物樣品中氧化型和還原型蘿卜硫苷的平均回收率分別為98.36％和101.44％，RSD值分別為1.14％和2.61％，表明本發(fā)明的檢測方法回收率較好。

由以上試驗可知：本發(fā)明的蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的同步定量檢測方法精密度高，穩(wěn)定性、檢測重現(xiàn)性和回收率均較好。采用該發(fā)明方法，同步定量檢測得出蘿卜提取物樣品中氧化型和還原型蘿卜硫苷含量分別為0.83％和10.38％(均為表1中含量的平均值)。

實施例2

蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的同步定量檢測方法，包括以下步驟：

(1)將氧化型和還原型蘿卜硫苷標(biāo)準(zhǔn)品溶解于甲醇-水溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液；利用甲醇-水溶液將所述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液倍比稀釋，微孔濾膜過濾，得系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

所述步驟(1)中的系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度均分別為0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.250mg/mL、0.500mg/mL、1.000mg/mL和2.000mg/mL；

(2)稱取75mg待測蘿卜提取物，溶解于5mL甲醇-水溶液，微孔濾膜過濾，得蘿卜提取物樣品溶液；共設(shè)置并抽取了3種待測蘿卜提取物樣品，分別如表7中所述的樣品1、樣品2和樣品3；

所述步驟(1)和(2)中的甲醇-水溶液均為甲醇和水按照1：99的體積比制得的；所述微孔濾膜為孔徑0.45μm的有機濾膜。

所述(2)中的蘿卜提取物為蘿卜種子的提取物。

(3)將步驟(1)所得系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和步驟(2)所得蘿卜提取物樣品溶液分別進行高效液相色譜檢測分析，分別獲得標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積；

檢測條件如下：5μm，4.6×250mm的DIKMA Diamodsil C-18色譜柱，進樣量為5μL，柱溫為30℃；流動相A為甲醇/濃度為0.1％的三氟乙酸水溶液＝1/99，v/v；流動相B為甲醇/濃度為0.1％的三氟乙酸水溶液＝3/7，v/v；梯度洗脫模式，30分鐘內(nèi)流動相B比例從0％線性增加至100％；流動相流速為1mL/min；流動相用量為1000mL；紫外線檢測波長為235nm；采用外標(biāo)法定量；

(4)根據(jù)步驟(3)所得檢測結(jié)果，氧化型蘿卜硫苷質(zhì)量濃度為0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.250mg/mL、0.500mg/mL、1.000mg/mL和2.000mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液對應(yīng)的色譜峰面積分別為4.0058、6.4441、12.7776、26.3434、52.0528、97.5527；還原型蘿卜硫苷質(zhì)量濃度為0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.250mg/mL、0.500mg/mL、1.000mg/mL和2.000mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液對應(yīng)的色譜峰面積分別為4.9265、9.5765、19.3007、39.2233、77.3107、153.8754；以系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，對應(yīng)色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)進行線性回歸分析，分別建立氧化型和還原型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；

所述步驟(4)中的氧化型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝1.2270+48.7148X，R＝0.9994；還原型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝0.2273+76.9141X，R＝0.9999。

由此可知，在質(zhì)量濃度為0.0625-2.000mg/mL的范圍內(nèi)，氧化型和還原型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系均較好，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可分別用于計算蘿卜提取物樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度。

說明：常規(guī)的蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量一般在0.5-12％的范圍內(nèi)，按照本發(fā)明所述的“精密稱取75mg待測蘿卜提取物樣品，溶解于5mL的1％甲醇-水溶液中，作為蘿卜提取物樣品溶液”，能夠滿足所得蘿卜提取物樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度均在0.0625-2.000mg/mL的范圍內(nèi)。因此，可通過設(shè)置不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，以能夠符合要求的樣品質(zhì)量濃度為準(zhǔn)。

(5)根據(jù)步驟(3)所得檢測結(jié)果，分別將樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積代入步驟(4)所得對應(yīng)的曲線方程中，獲得樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度，計算獲得蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量。

所述步驟(5)中的蘿卜提取物中氧化型蘿卜硫苷的含量計算方程為：氧化型蘿卜硫苷的含量＝5×氧化型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度÷蘿卜提取物樣品質(zhì)量×100％；蘿卜提取物中還原型蘿卜硫苷的含量計算方程為：還原型蘿卜硫苷的含量＝5×還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度÷蘿卜提取物樣品質(zhì)量×100％。

具體如下：

樣品1中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積分別為86.6106和8.9186；樣品2中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積分別為87.0152和8.9955；樣品3中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積分別為86.3413和8.6879。

計算所得的3種樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度和3種樣品中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量如表7所示。

表7蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量測定結(jié)果

由表7可知，本實施例的同步定量檢測得出蘿卜提取物樣品中氧化型和還原型蘿卜硫苷含量分別為11.69％和0.75％(均為表7中含量的平均值)。

實施例3

蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的同步定量檢測方法，包括以下步驟：

(1)將氧化型和還原型蘿卜硫苷標(biāo)準(zhǔn)品溶解于甲醇-水溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液；利用甲醇-水溶液將所述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液倍比稀釋，微孔濾膜過濾，得系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

所述步驟(1)中的系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度均分別為0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.250mg/mL、0.500mg/mL、1.000mg/mL和2.000mg/mL；

(2)稱取75mg待測蘿卜提取物，溶解于5mL甲醇-水溶液，微孔濾膜過濾，得蘿卜提取物樣品溶液；共設(shè)置并抽取了3種待測蘿卜提取物樣品，分別如表8中所述的樣品1、樣品2和樣品3；

所述步驟(1)和(2)中的甲醇-水溶液均為甲醇和水按照1：99的體積比制得的；所述微孔濾膜為孔徑0.45μm的有機濾膜。

所述(2)中的蘿卜提取物為蘿卜根莖的提取物。

(3)將步驟(1)所得系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和步驟(2)所得蘿卜提取物樣品溶液分別進行高效液相色譜檢測分析，分別獲得標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積；

檢測條件如下：5μm，4.6×250mm的DIKMA Diamodsil C-18色譜柱，進樣量為5μL，柱溫為30℃；流動相A為甲醇/濃度為0.1％的三氟乙酸水溶液＝1/99，v/v；流動相B為甲醇/濃度為0.1％的三氟乙酸水溶液＝3/7，v/v；梯度洗脫模式，30分鐘內(nèi)流動相B比例從0％線性增加至100％；流動相流速為1mL/min；流動相用量為1000mL；紫外線檢測波長為235nm；采用外標(biāo)法定量；

(4)根據(jù)步驟(3)所得檢測結(jié)果，氧化型蘿卜硫苷質(zhì)量濃度為0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.250mg/mL、0.500mg/mL、1.000mg/mL和2.000mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液對應(yīng)的色譜峰面積分別為4.0058、6.4441、12.7776、26.3434、52.0528、97.5527；還原型蘿卜硫苷質(zhì)量濃度為0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.250mg/mL、0.500mg/mL、1.000mg/mL和2.000mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液對應(yīng)的色譜峰面積分別為4.9265、9.5765、19.3007、39.2233、77.3107、153.8754；以系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，對應(yīng)色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)進行線性回歸分析，分別建立氧化型和還原型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；

所述步驟(4)中的氧化型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝1.2270+48.7148X，R＝0.9994；還原型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝0.2273+76.9141X，R＝0.9999。

由此可知，在質(zhì)量濃度為0.0625-2.000mg/mL的范圍內(nèi)，氧化型和還原型蘿卜硫苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系均較好，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可分別用于計算蘿卜提取物樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度。

說明：常規(guī)的蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量一般在0.5-12％的范圍內(nèi)，按照本發(fā)明所述的“精密稱取75mg待測蘿卜提取物樣品，溶解于5mL的1％甲醇-水溶液中，作為蘿卜提取物樣品溶液”，能夠滿足所得蘿卜提取物樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度均在0.0625-2.000mg/mL的范圍內(nèi)。因此，可通過設(shè)置不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，以能夠符合要求的樣品質(zhì)量濃度為準(zhǔn)。

(5)根據(jù)步驟(3)所得檢測結(jié)果，分別將樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積代入步驟(4)所得對應(yīng)的曲線方程中，獲得樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度，計算獲得蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量。

所述步驟(5)中的蘿卜提取物中氧化型蘿卜硫苷的含量計算方程為：氧化型蘿卜硫苷的含量＝5×氧化型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度÷蘿卜提取物樣品質(zhì)量×100％；蘿卜提取物中還原型蘿卜硫苷的含量計算方程為：還原型蘿卜硫苷的含量＝5×還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度÷蘿卜提取物樣品質(zhì)量×100％。

具體如下：

樣品1中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積分別為6.0498和19.1482；樣品2中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積分別為6.1232和19.3020；樣品3中氧化型和還原型蘿卜硫苷的色譜峰面積分別為6.1472和18.9174。

計算所得的3種樣品溶液中氧化型和還原型蘿卜硫苷的質(zhì)量濃度和3種樣品中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量如表8所示。

表8蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的含量測定結(jié)果

由表8可知，本實施例的同步定量檢測得出蘿卜提取物樣品中氧化型和還原型蘿卜硫苷含量分別為0.67％和1.64％(均為表8中含量的平均值)。

以上對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但本發(fā)明并不限于以上描述。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，任何對蘿卜提取物中氧化型和還原型蘿卜硫苷的同步定量檢測方法進行的同等修改和替代都是在本發(fā)明的范圍之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所做出的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。