本發(fā)明涉及中藥檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種中藥注射劑顏色定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

中藥注射劑最早產(chǎn)生于上世紀(jì)四十年代，由錢信忠等學(xué)者開創(chuàng)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。經(jīng)過近百年的發(fā)展，高峰時(shí)最多有近800個(gè)品種，經(jīng)市場(chǎng)和臨床篩選淘汰，目前有批文可以上市的中藥注射劑約142個(gè)品種，是我國醫(yī)藥市場(chǎng)獨(dú)特的一個(gè)組成部分。我國從1977年版《中華人民共和國藥典》(簡(jiǎn)稱《藥典》)起，就一直收錄有中藥注射劑品種。

中藥注射劑能提升藥效、使某些中藥的療效得到更好地發(fā)揮，在推進(jìn)中藥劑型發(fā)展，拓展中藥的應(yīng)用范圍，服務(wù)廣大人民健康等方面的確功不可沒。從第一支中藥注射劑柴胡注射液的發(fā)明至今，中藥注射劑大體經(jīng)歷了誕生、發(fā)展、整頓、提高的階段。從技術(shù)上來講，業(yè)界大體上已經(jīng)解決了中藥注射劑的有效性問題(盡管作用機(jī)制尚不完全清除)，安全性依然是業(yè)界難題。

隨著中藥注射劑的廣泛應(yīng)用，不良反應(yīng)不斷發(fā)現(xiàn)，甚至致死性不良反應(yīng)也屢有報(bào)道。前幾年發(fā)生的“清開靈注射液事件”、“雙黃連注射液事件”、“魚腥草注射液事件”等說明中藥注射劑的安全性不容忽視，受到業(yè)界甚至公眾的廣泛關(guān)注。目前中藥注射劑處于一個(gè)嚴(yán)控階段，國家層面逐步啟動(dòng)了中藥注射劑再評(píng)價(jià)活動(dòng)，許多專家也在大力呼吁還應(yīng)推動(dòng)中藥注射劑“再提高”。

中藥注射劑按所含成分的復(fù)雜程度，可分為單體成分注射劑(如燈盞花素注射液)、有效部位注射劑(如血塞通注射液和柴胡注射液)、單方注射劑(如丹參注射液)和復(fù)方注射液(清開靈注射液)；其中單方注射劑和復(fù)方注射劑具有中藥總提取物的特征，既是反映中藥用藥、配伍理論的代表性劑型，也是問題較多較嚴(yán)重的劑型。已有的資料表明，中藥注射劑的成分越復(fù)雜，不良反應(yīng)也越復(fù)雜。對(duì)于靜脈用中藥注射劑而言，產(chǎn)生重大安全性事件的幾乎都是成分復(fù)雜的注射液，如刺五加注射液、雙黃連注射液、魚腥草注射液等，幾乎未見單體成分注射液的嚴(yán)重不良反應(yīng)。

在實(shí)際工作中，也的確發(fā)現(xiàn)，成分越復(fù)雜的中藥注射劑，顏色往往越深，而單方和復(fù)方制劑往往顏色較深，為棕紅色或棕黃色等，參見表1。顏色性狀是中藥注射劑的重要內(nèi)容，但各種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的描述都較為宏觀，不甚準(zhǔn)確。即使部分制劑有針對(duì)該性狀描述的檢查內(nèi)容，也是用標(biāo)準(zhǔn)色卡進(jìn)行肉眼比對(duì)或只用儀器進(jìn)行單波長(zhǎng)檢查。因此，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)際執(zhí)行中，要么覆蓋面不全，要么存在很大的主觀誤差，導(dǎo)致這種性狀描述幾乎無實(shí)際性的執(zhí)行力。

表1藥注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的顏色描述(部分)

因此，中藥注射劑顏色性狀的描述一直是中藥注射劑質(zhì)量檢查的短板，特別是具有總提取物特征的單方、復(fù)方制劑，其顏色性狀表述在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)里也是五花八門(見表1)。安全性問題目前已成為中藥注射劑社會(huì)廣為關(guān)注的問題，由于中藥注射劑的顏色性狀是內(nèi)在物質(zhì)的綜合反映，重視該性狀的定量描述和客觀定量檢查有利于提升中藥注射劑的內(nèi)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)控其內(nèi)在質(zhì)量變化。實(shí)踐證明，過期失效的中藥注射劑顏色較深，變色(主要是顏色加深)也是中藥注射劑重要的早期變質(zhì)表現(xiàn)；但這種表現(xiàn)一直被學(xué)術(shù)界和技術(shù)界忽視。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種中藥注射劑顏色定量檢測(cè)方法。本發(fā)明既可以采用全部紫外-可見區(qū)吸收光譜曲線下面積進(jìn)行判斷，也可采用包含部分紫外區(qū)特定波長(zhǎng)區(qū)的吸收曲線下面積進(jìn)行判斷。本發(fā)明為中藥注射劑顏色性狀的檢查提供了準(zhǔn)確方法，特別適用于具有總提取物特征的單方、復(fù)方中藥注射劑顏色性狀檢查。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種中藥注射劑顏色定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括以下步驟：

步驟1)將中藥注射劑制備成溶液，如果是中藥注射液則直接進(jìn)行步驟(2)；

所述中藥注射劑為具有總提取物特征的單方或復(fù)方中藥注射液或注射用粉針劑。

步驟2)將中藥注射劑溶液或中藥注射液加入到多孔板或比色皿中；置于酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)掃描設(shè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜；為了避免飽和吸收，可以將中藥注射劑溶液或中藥注射液稀釋1-128倍。

所述的多孔板為平底紫外透明96孔板或384孔板。

所述波長(zhǎng)范圍為200-800nm的部分或全部波長(zhǎng)并同時(shí)至少包含部分紫外區(qū)波長(zhǎng)，步進(jìn)波長(zhǎng)為0.5-2nm。200-800nm包括紫外光和可見光的波長(zhǎng)范圍?？梢愿鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇波長(zhǎng)范圍，如選擇400-800nm的可見光、200-400nm的紫外光、或者既包含紫外光又包含可見光的200-600nm，使用包含紫外區(qū)的波長(zhǎng)范圍檢測(cè)效果更好。

步驟3)計(jì)算吸收光譜曲線下面積；將曲線下面積與對(duì)照品或規(guī)定值進(jìn)行比較，進(jìn)行結(jié)果判斷。

結(jié)果判斷中，對(duì)以總提取物為特征的中藥注射劑，規(guī)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜曲線下面積大于對(duì)照品或規(guī)定值應(yīng)判定為不符合要求。具體的規(guī)定值根據(jù)中藥注射劑品種視情況確定。

結(jié)果判斷中，對(duì)以單體成分或活性部位為特征的中藥注射劑，活性成分主吸收區(qū)的吸收光譜曲線下面積小于對(duì)照品或規(guī)定值應(yīng)判定為不符合要求；而非活性成分主吸收區(qū)的吸收光譜曲線下面積大于對(duì)照品或規(guī)定值應(yīng)判定為不符合要求。規(guī)定值由根據(jù)中藥注射劑品種視情況的情況確定。

《藥典》中有規(guī)定采用單波長(zhǎng)比色的方法檢測(cè)中藥注射液顏色的方法，由于中藥注射劑所含成分復(fù)雜，往往在可見區(qū)波長(zhǎng)區(qū)缺乏具有特征性的吸收波長(zhǎng)，這種檢測(cè)往往比較片面?！端幍洹芬灿杏脴?biāo)準(zhǔn)色卡肉眼比對(duì)的檢查方法，但肉眼色卡比對(duì)的主觀誤差較大，結(jié)果準(zhǔn)確率不高。為解決上述問題，本發(fā)明利用吸收曲線下面積的原理，定量檢查中藥注射劑的顏色。將中藥注射劑制備成規(guī)定體積的液體，如果已是中藥注射液則可以直接用于檢查。檢查時(shí)，將中藥注射劑溶液置于紫外透明容器，如96孔板或比色皿中，在200-800nm掃描吸光度(光經(jīng)為1cm時(shí))或光密度(多孔板檢測(cè)，光經(jīng)不為1cm時(shí))，計(jì)算溶液200-800nm下的吸收曲線下面積。對(duì)于具有總提取物特征的單方或復(fù)方中藥注射劑而言，顏色加深是反映中藥注射劑穩(wěn)定性下降、變質(zhì)的重要指標(biāo)，因此可與對(duì)照溶液或規(guī)定值進(jìn)行比較，當(dāng)吸收光譜曲線下面積大于一定值時(shí)可以判定該注射劑的顏色性狀不符合要求。對(duì)于以單體成分或有效部位為特征的中藥注射劑而言，當(dāng)活性成分的主吸收區(qū)吸收光譜曲線下面積低于一定值，或非活性成分吸收區(qū)的吸收光譜曲線下面積超出一定值則可以明確判定顏色性狀不符合要求。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明提供的方法檢測(cè)出的顏色結(jié)果更加客觀，更加準(zhǔn)確，特別適用于中藥注射劑顏色性狀檢查。由于該方法簡(jiǎn)便，也可作為中藥注射劑內(nèi)在質(zhì)量變化的快速篩查方法。

本發(fā)明也可以用于中藥液體制劑的顏色性狀檢查，將中藥固體制劑溶解稀釋后也可用本發(fā)明檢查其顏色性狀。鑒于中藥注射劑的安全性問題較為突出，為增強(qiáng)本發(fā)明的針對(duì)性，故以中藥注射劑為主要保護(hù)范圍。

附圖說明

圖1去大分子和富含大分子的中藥注射劑。Q、S、D、Dz分別為清開靈注射液、雙黃連注射液、燈盞細(xì)辛注射液和丹參注射液。1-3分別表示經(jīng)3k、10k和30k分子篩處理后獲得的去大分子注射液；4為中藥注射劑原液；5-7分別表示經(jīng)3k、10k和30k分子篩處理后獲得的富含大分子注射液，大分子物質(zhì)得到10倍富集。

圖2清開靈注射液原液未烘烤和60℃烘烤后的可見吸收光譜。Q0是烘烤前的吸收光譜，Q15和Q30分別是烘烤15、30天的吸收光譜。

圖3清開靈注射液原液未烘烤(0D)和60℃烘烤15天(15D)和30天(30D)后的可見吸收光譜曲線下面積(400-800nm)。

圖4雙黃連注射液原液未烘烤和60℃烘烤后的可見吸收光譜。S0是烘烤前的吸收光譜，S15和S30分別是烘烤15、30天的吸收光譜。

圖5雙黃連注射液原液未烘烤(0D)和60℃烘烤15天(15D)和30天(30D)后的可見吸收光譜曲線下面積(400-800nm)。

圖6丹參注射液原液未烘烤和60℃烘烤后的可見吸收光譜。D0是烘烤前的吸收光譜，D15和D30分別是烘烤15天和30天的吸收光譜。

圖7丹參注射液原液未烘烤(0D)和60℃烘烤15天(15D)和30天(30D)后的可見吸收光譜曲線下面積(400-800nm)。

圖8燈盞細(xì)辛注射液原液未烘烤和60℃烘烤后的可見吸收光譜。Dz0是烘烤前的吸收光譜，Dz15和Dz30分別是烘烤15天和30天的吸收光譜。

圖9燈盞細(xì)辛注射液原液未烘烤(0D)和60℃烘烤15天(15D)和30天(30D)后的可見吸收光譜曲線下面積(400-800nm)。

圖10清開靈注射液原液未烘烤和60℃烘烤后的紫外-可見吸收光譜。Q0是烘烤前的吸收光譜，Q15是烘烤15天的吸收光譜(230-800nm，稀釋128倍后檢測(cè))。

圖11清開靈注射液原液未烘烤(Q)和60℃烘烤15天(Q15)后的紫外-可見吸收光譜曲線下面積(230-800nm，稀釋128倍后檢測(cè))。

圖12雙黃連注射液原液未烘烤和60℃烘烤后的紫外-可見吸收光譜。S0是烘烤前的吸收光譜，S15是烘烤15天的吸收光譜(230-800nm，稀釋128倍后檢測(cè))。

圖13雙黃連注射液原液未烘烤(S0)和60℃烘烤15天(S15)后的紫外-可見吸收光譜曲線下面積(230-800nm，稀釋128倍后檢測(cè))。

圖14丹參注射液原液未烘烤和60℃烘烤后的紫外-可見吸收光譜。D0是烘烤前的吸收光譜，D15是烘烤15天的吸收光譜(230-800nm，稀釋128倍后檢測(cè))。

圖15丹參注射液原液未烘烤(D0)和60℃烘烤15天(D15)后的紫外-可見吸收光譜曲線下面積(230-800nm，稀釋128倍后檢測(cè))。

圖16燈盞細(xì)辛注射液原液未烘烤和60℃烘烤后的紫外-可見吸收光譜。Dz0是烘烤前的吸收光譜，Dz15是烘烤15天的吸收光譜(230-800nm，稀釋128倍后檢測(cè))。

圖17燈盞細(xì)辛注射液原液未烘烤(Dz0)和60℃烘烤15天(Dz15)后的紫外-可見吸收光譜曲線下面積(230-800nm，稀釋128倍后檢測(cè))。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1中藥注射劑的顏色與大分子有關(guān)。

清開靈注射液，規(guī)格10ml，批號(hào)1003272；雙黃連注射液，規(guī)格20ml，批號(hào)20100324；丹參注射液，規(guī)格10ml，批號(hào)1005104；燈盞細(xì)辛注射液，規(guī)格10ml，批號(hào)20130533。四種注射液均從市場(chǎng)購得，由正規(guī)藥廠生產(chǎn)，有國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)文號(hào)，符合藥典規(guī)定。

將上述四種中藥注射液分別加入到3k、10k、30k無菌超濾離心管(規(guī)格50ml)中，于4℃3000rpm離心截留制備超濾液，即得各種去大分子注射液，同時(shí)也獲得富含大分子注射液。富含大分子注射液為10倍富集，即取10份注射液原液制備成1份富含大分子液。為了便于比較，各注射液原野液置于1.5ml離心管中進(jìn)行拍照。獲得的樣品保存在-40℃?zhèn)溆谩?/p>

經(jīng)不同分子篩截留后得到不同的去大分子注射液，以3k截留的去大分子注射液顏色較淺，透明度較高；其次是10k截留和30k截留獲得的去大分子注射液(見圖1)。對(duì)富含大分子注射液來說，雖未見沉淀但顏色似醬油不透明(見圖1)。表明大分子物質(zhì)是顏色的主要來源。

實(shí)施例2清開靈注射液可見吸收光譜曲線下面積與顏色性狀和穩(wěn)定性變化的有關(guān)，但尚不靈敏。

清開靈注射液，規(guī)格10ml，批號(hào)1003272，購自市場(chǎng)，由正規(guī)藥廠生產(chǎn)，有國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)文號(hào)，符合藥典規(guī)定。

取清開靈注射液原液10ml，置于15ml無菌帶蓋試管中，于60℃恒溫烘箱30天。測(cè)定正常原液和烘烤15天和30天后的400-800nm吸收光譜(步進(jìn)波長(zhǎng)為1nm)，測(cè)定時(shí)取50μl加入到平底透明384孔板中，用Tecan酶標(biāo)儀進(jìn)行掃描。以吸收光譜的曲線下面積來反映樣品顏色的總體變化，曲線下面積采用梯形法進(jìn)行計(jì)算，即，將曲線下面積根據(jù)波長(zhǎng)間隔分割成多個(gè)梯形，先計(jì)算出每個(gè)梯形的面積然后將各個(gè)梯形的面積進(jìn)行累加。

在該熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)中，清開靈注射液的吸收光譜發(fā)生增強(qiáng)(未烘烤、烘烤15天和30天的可見吸收曲線參見圖2)，吸收光譜曲線下面積參見圖3。經(jīng)吸收曲線下面積計(jì)算，清開靈注射液烘烤30天后的曲線下面積明顯增加，增加率約24％，但烘烤15天的曲線下面積增加率很小(1.08％)，見表2。

根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，清開靈注射液的顏色性狀為棕黃色或棕紅色。從肉眼看，不管是未經(jīng)烘烤的原液還是經(jīng)過60℃烘烤15天或30天的原液，該注射液的顏色還是合符規(guī)定。顯然，清開靈注射液經(jīng)過60℃15天或30天烘烤，內(nèi)在質(zhì)量應(yīng)該已經(jīng)發(fā)生重大變化，甚至烘烤15天也出現(xiàn)了明顯深色沉淀，說明顏色性狀已經(jīng)發(fā)生了一定程度的改變，但仍為棕紅色，用宏觀描述的方法不能區(qū)別，而用可見吸收光譜曲線下面積則有利于反映出來，但靈敏性偏低(與實(shí)施例6對(duì)比)。

表2清開靈注射液、雙黃連注射液、丹參注射液和燈盞細(xì)辛注射液熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的可見光譜曲線下面積變化

實(shí)施例3雙黃連注射液可見吸收光譜曲線下面積與顏色性狀和穩(wěn)定性有關(guān)，但不夠靈敏。

雙黃連注射液，規(guī)格20ml，批號(hào)20100324，購自市場(chǎng)，由正規(guī)藥廠生產(chǎn)，有國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)文號(hào)，符合藥典規(guī)定。

取雙黃連注射液原液10ml，置于15ml無菌帶蓋試管中，于60℃恒溫烘箱30天。測(cè)定正常原液和烘烤15天和30天后的400-800nm吸收光譜(步進(jìn)波長(zhǎng)為1nm)，測(cè)定時(shí)取50μl加入到平底透明384孔板中，用Tecan酶標(biāo)儀進(jìn)行掃描。以吸收光譜的曲線下面積來反映樣品顏色的總體變化，曲線下面積采用梯形法進(jìn)行計(jì)算，即，將曲線下面積根據(jù)波長(zhǎng)間隔分割成多個(gè)梯形，先計(jì)算出每個(gè)梯形的面積然后將各個(gè)梯形的面積進(jìn)行累加。

在該熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)中，雙黃連注射液的吸收光譜發(fā)生較弱程度的增強(qiáng)(未烘烤、烘烤15天和30天的可見吸收曲線參見圖4)，吸收光譜曲線下面積參見圖5。經(jīng)吸收光譜曲線下面積計(jì)算，雙黃連注射液的曲線下面積增加，烘烤15天增加約8％，烘烤30天增加率約為20％，見表2。

根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，雙黃連注射液的顏色性狀為棕紅色。從肉眼看，不管是未經(jīng)烘烤的原液還是經(jīng)過60℃烘烤15天或30天的原液，雙黃連注射液的顏色還是保持著本色。顯然，該注射液經(jīng)過60℃15天和30天的烘烤，內(nèi)在質(zhì)量應(yīng)該已經(jīng)發(fā)生重大變化，且烘烤到15天可見小量深色沉淀，但液體仍為棕紅色，因此用宏觀描述的方法不能區(qū)別，而用吸收曲線下面積有利于反映顏色差別，但烘烤15天吸收曲線下面積只增加了約8％。雖然該法具有進(jìn)步意義，但尚不夠靈敏，因?yàn)樵趯?shí)際工作中，波動(dòng)5-10％的范圍常常屬于正常波動(dòng)范圍。

實(shí)施例4丹參注射液可見吸收光譜曲線下面積與顏色性狀和穩(wěn)定性有關(guān)，但不夠靈敏。

丹參注射液，規(guī)格10ml，批號(hào)1005104，購自市場(chǎng)，由正規(guī)藥廠生產(chǎn)，有國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)文號(hào)，符合藥典規(guī)定。

取丹參注射液原液10ml，置于15ml無菌帶蓋試管中，于60℃恒溫烘箱30天。測(cè)定正常原液和烘烤15天和30天后的400-800nm吸收光譜(步進(jìn)波長(zhǎng)為1nm)，測(cè)定時(shí)取50μl加入到平底透明384孔板中，用Tecan酶標(biāo)儀進(jìn)行掃描。以吸收光譜的曲線下面積來反映樣品顏色的總體變化，曲線下面積采用梯形法進(jìn)行計(jì)算，即將曲線下面積根據(jù)波長(zhǎng)間隔分割成多個(gè)梯形，先計(jì)算出每個(gè)梯形的面積然后將各個(gè)梯形的面積進(jìn)行累加。

在該熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)中，丹參注射液的吸收光譜發(fā)生微量程度的增加(未烘烤原液、烘烤15天和30天的可見吸收曲線參見圖6)，吸收光譜曲線下面積參見圖7。經(jīng)吸收曲線下面積計(jì)算，丹參注射液的吸收光譜曲線下面積還是增加的，但烘烤15天的增加率不到10％，烘烤30天的增加率也約為11％，見表2。

根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，丹參注射液的顏色性狀應(yīng)為棕色至棕紅色。從肉眼看，不管是未經(jīng)烘烤的原液還是經(jīng)過60℃烘烤15天或30天的原液，該注射液的顏色還是保持著本色。顯然，該注射液經(jīng)過60℃15天和30天烘烤，內(nèi)在質(zhì)量應(yīng)該已經(jīng)發(fā)生變化，均可見小量深色沉淀，但液體顏色幾乎無變化，仍為棕紅色，因此用宏觀描述的方法不能區(qū)別，而用吸收光譜曲線下面積有利于反映出顏色變深改變，但吸收曲線下面積只增加程度較小。

實(shí)施例5燈盞細(xì)辛注射液可見吸收光譜曲線下面積與顏色性狀和穩(wěn)定性變化有關(guān)，但不夠靈敏。

燈盞細(xì)辛注射液，規(guī)格10ml，批號(hào)20130533，購自市場(chǎng)，由正規(guī)藥廠生產(chǎn)，有國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)文號(hào)，符合藥典規(guī)定。

取燈盞細(xì)辛注射液原液10ml，置于15ml無菌帶蓋試管中，于60℃恒溫烘箱30天。測(cè)定正常原液和烘烤15天和30天后的400-800nm吸收光譜(步進(jìn)波長(zhǎng)為1nm)，測(cè)定時(shí)取50μl加入到平底透明384孔板中，用Tecan酶標(biāo)儀進(jìn)行掃描。以可見吸收光譜的曲線下面積來反映樣品顏色的總體變化，曲線下面積采用梯形法進(jìn)行計(jì)算，即將曲線下面積根據(jù)波長(zhǎng)間隔分割成多個(gè)梯形，先計(jì)算出每個(gè)梯形的面積然后將各個(gè)梯形的面積進(jìn)行累加。

在該熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)中，燈盞細(xì)辛注射液的吸收光譜發(fā)生較弱程度的增強(qiáng)(未烘烤原液、烘烤15天和30天的可見吸收曲線參見圖8)，吸收光譜曲線下面積參見圖9。經(jīng)吸收光譜曲線下面積計(jì)算，該注射液的曲線下面積烘烤15天增加約2％，烘烤30天增加約為3％，見表2。

根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，燈盞細(xì)辛注射液的顏色性狀為棕色。從肉眼看，不管是未經(jīng)烘烤的原液還是經(jīng)過60℃烘烤30天的原液，該注射液的顏色還是保持著本色。顯然，該注射液經(jīng)過60℃15天和30天烘烤，內(nèi)在質(zhì)量應(yīng)該已經(jīng)發(fā)生重大變化，也均可見小量深色沉淀，但顏色變化不明顯，仍為棕色，用宏觀描述的方法不能區(qū)別，而用吸收光譜曲線下面積有利于反映該變化，但吸收曲線下面積只增加較小。因此，該法尚不夠靈敏，因?yàn)樵趯?shí)際工作中，波動(dòng)5-10％的范圍常常屬于正常波動(dòng)范圍。

實(shí)施例6清開靈注射液紫外-可見吸收光譜曲線下面積能靈敏地反映顏色性狀變化。

清開靈注射液，規(guī)格10ml，批號(hào)1003272，購自市場(chǎng)，由正規(guī)藥廠生產(chǎn)，有國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)文號(hào)，符合藥典規(guī)定。

取清開靈注射液原液10ml，置于15ml無菌帶蓋試管中，于60℃恒溫烘箱15天。測(cè)定正常原液和烘烤15天后的230-800nm吸收光譜(步進(jìn)波長(zhǎng)為1nm)，測(cè)定時(shí)先稀釋到128倍再取160μl加入到平底紫外透明96孔板中，用Tecan酶標(biāo)儀進(jìn)行掃描。分別計(jì)算吸收曲線紫外區(qū)(230-400nm)、可見區(qū)(400-800nm)和紫外-可見區(qū)(230-800nm)的曲線下面積。即，將曲線下面積根據(jù)波長(zhǎng)間隔分割成多個(gè)梯形，先計(jì)算出每個(gè)梯形的面積然后將各個(gè)梯形的面積進(jìn)行累加。

在該熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)中，清開靈注射液的吸收光譜發(fā)生明顯的增強(qiáng)(未烘烤和烘烤15天的紫外-可見吸收曲線參見圖10)，吸收光譜曲線下面積參見圖11。經(jīng)吸收曲線下面積計(jì)算，清開靈注射液的紫外區(qū)和可見區(qū)吸收光譜曲線下面積均增加，但紫外區(qū)吸收曲線下面積增加較可見區(qū)明顯(紫外區(qū)增加82％，紫外-可見區(qū)綜合增加76％)，見表3。

根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，清開靈注射液的顏色性狀為棕黃色或棕紅色。從肉眼看，不管是未經(jīng)烘烤的原液還是經(jīng)過60℃烘烤15天的原液，該注射液的顏色還是合符規(guī)定。顯然，清開靈注射液經(jīng)過60℃15天烘烤，內(nèi)在質(zhì)量應(yīng)該已經(jīng)發(fā)生重大變化，甚至出現(xiàn)了深色沉淀，且顏色性狀已經(jīng)發(fā)生了一定程度的改變，但液體仍為棕紅色，用宏觀描述的方法不能區(qū)別，用可見吸收光譜曲線下面積不靈敏，而用紫外-可見吸收光譜曲線下面積則能夠靈敏地反映出來。表明用紫外-可見吸收光譜曲線下面積來評(píng)價(jià)顏色性狀變化更具有進(jìn)步意義。

表3清開靈注射液、雙黃連注射液、丹參注射液和燈盞細(xì)辛注射液熱15天穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的可見、紫外和紫外-可見區(qū)吸收光譜曲線下面積的變化率。

實(shí)施例7雙黃連注射液紫外-可見吸收光譜曲線下面積能靈敏地反映顏色性狀變化。

雙黃連注射液，規(guī)格20ml，批號(hào)20100324，購自市場(chǎng)，由正規(guī)藥廠生產(chǎn)，有國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)文號(hào)，符合藥典規(guī)定。

取雙黃連注射液原液10ml，置于15ml無菌帶蓋試管中，于60℃恒溫烘箱15天。測(cè)定正常原液和烘烤15天后的230-800nm吸收光譜(步進(jìn)波長(zhǎng)為1nm)，測(cè)定時(shí)先稀釋到128倍取160μl加入到平底紫外透明96孔板中，用Tecan酶標(biāo)儀進(jìn)行掃描。以吸收光譜的曲線下面積來反映樣品顏色的總體變化，分別計(jì)算紫外區(qū)(230-400nm)、可見區(qū)(400-800nm)和紫外-可見區(qū)(230-800nm)吸收光譜曲線下面積，即，將曲線下面積根據(jù)波長(zhǎng)間隔分割成多個(gè)梯形，先計(jì)算出每個(gè)梯形的面積然后將各個(gè)梯形的面積進(jìn)行累加。

在該熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)中，雙黃連注射液的紫外和可見吸收光譜發(fā)生一定程度的增加(未烘烤原液和烘烤15天的紫外-可見吸收曲線參見圖12)，吸收光譜曲線下面積參見圖13。經(jīng)吸收光譜曲線下面積計(jì)算，雙黃連注射液紫外區(qū)和可見區(qū)吸收光譜的曲線下面積均增加，但可見區(qū)增加的值較小，而紫外區(qū)增加的值要大得多(46％)，紫外-可見區(qū)綜合增加43％，見表3。

根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，雙黃連注射液的顏色性狀為棕紅色。從肉眼看，不管是未經(jīng)烘烤的原液還是經(jīng)過60℃烘烤15天的原液，雙黃連注射液的顏色還是保持著本色。顯然，該注射液經(jīng)過60℃15天烘烤，底部出現(xiàn)小量深色沉淀，說明內(nèi)在質(zhì)量已經(jīng)發(fā)生重大變化，但液體仍為棕紅色，用宏觀描述的方法不能區(qū)別，而用可見吸收光譜曲線下面積也不能靈敏地反映出來，但用包括紫外區(qū)吸收光譜曲線下面積能夠明顯地反映出來。顯然，用包含紫外區(qū)的吸收曲線下面積來評(píng)價(jià)顏色性狀變化則更有進(jìn)步意義。

實(shí)施例8丹參注射液紫外-可見吸收光譜曲線下面積能靈敏地反映顏色性狀變化。

丹參注射液，規(guī)格10ml，批號(hào)1005104，購自市場(chǎng)，由正規(guī)藥廠生產(chǎn)，有國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)文號(hào)，符合藥典規(guī)定。

取丹參注射液原液10ml，置于15ml無菌帶蓋試管中，于60℃恒溫烘箱15天。測(cè)定正常原液和烘烤15天后的230-800nm吸收光譜(步進(jìn)波長(zhǎng)為1nm)，測(cè)定時(shí)先稀釋128倍再取160μl加入到平底紫外透明96孔板中，用Tecan酶標(biāo)儀進(jìn)行掃描。以吸收光譜的曲線下面積來反映樣品顏色的總體變化，計(jì)算紫外區(qū)(230-400nm)、可見區(qū)(400-800)和紫外-可見區(qū)(230-800nm)吸收曲線下面積，即，將曲線下面積根據(jù)波長(zhǎng)間隔分割成多個(gè)梯形，先計(jì)算出每個(gè)梯形的面積然后將各個(gè)梯形的面積進(jìn)行累加。

在該熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)中，丹參注射液的吸收光譜在紫外區(qū)發(fā)生明顯增加(50％)，而在可見區(qū)只發(fā)生微量程度增加，紫外-可見區(qū)綜合增加37％(見表3，未烘烤原液和烘烤15天的紫外-可見吸收曲線參見圖14)，各吸收光譜曲線下面積參見圖15。

根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，丹參注射液的顏色性狀應(yīng)為棕色至棕紅色。從肉眼看，不管是未經(jīng)烘烤的原液還是經(jīng)過60℃烘烤15天的原液，該注射液的顏色還是保持著本色。顯然，該注射液經(jīng)過60℃15天烘烤，底部出現(xiàn)小量深色沉淀，但仍為棕紅色，用宏觀描述的方法不能區(qū)別，用可見吸收光譜曲線下面積也不能夠靈敏地反映，而用包含紫外區(qū)的吸收光譜曲線下面積則可反映出顏色性狀的改變。因此，用包含紫外區(qū)吸收光譜曲線下面積來檢查該中藥注射劑的顏色性狀具有進(jìn)步意義。

實(shí)施例9燈盞細(xì)辛注射液紫外-可見吸收光譜曲線下面積能靈敏地反映顏色性狀變化。

燈盞細(xì)辛注射液，規(guī)格10ml，批號(hào)20130533，購自市場(chǎng)，由正規(guī)藥廠生產(chǎn)，有國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)文號(hào)，符合藥典規(guī)定。

取燈盞細(xì)辛注射液原液10ml，置于15ml無菌帶蓋試管中，于60℃恒溫烘箱15天。測(cè)定正常原液和烘烤15天后的230-800nm吸收光譜(步進(jìn)波長(zhǎng)為1nm)，測(cè)定時(shí)先稀釋128倍再取160μl加入到平底紫外透明96孔板中，用Tecan酶標(biāo)儀進(jìn)行掃描。以吸收光譜的曲線下面積來反映樣品顏色的總體變化，計(jì)算紫外區(qū)(230-400nm)、可見區(qū)(400-800)和紫外-可見區(qū)(230-800nm)吸收曲線下面積，即將曲線下面積根據(jù)波長(zhǎng)間隔分割成多個(gè)梯形，先計(jì)算出每個(gè)梯形的面積然后將各個(gè)梯形的面積進(jìn)行累加。

在該熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)中，燈盞細(xì)辛注射液的紫外-可見吸收光譜發(fā)生一定程度的增加(未烘烤原液和烘烤15天的紫外-可見吸收曲線參見圖16)，吸收光譜曲線下面積參見圖17。以紫外區(qū)吸收光譜曲線下面積增加明顯(42％)，可見區(qū)增加較小，紫外-可見區(qū)綜合增加也明顯(34％)，見表3。

根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，燈盞細(xì)辛注射液的顏色性狀為棕色。從肉眼看，不管是未經(jīng)烘烤的原液還是經(jīng)過60℃烘烤15天的原液，該注射液的顏色還是保持著本色。該注射液經(jīng)過60℃15天烘烤，底部出現(xiàn)小量深色沉淀，但液體仍為棕色。因此，用宏觀描述的方法不能區(qū)別，用可見吸收光譜曲線下面積也不好靈敏地反映，而用紫外-可見吸收光譜曲線下面積則可以明顯地反映出來，表明用包含紫外區(qū)的吸收光譜曲線下面積變化檢查中藥注射劑的顏色性狀具有進(jìn)步意義。

以上四種中藥注射液均是市場(chǎng)較常用的中藥注射劑，兩種為復(fù)方、兩種為單方，在總提物中藥注射劑中具有一定的代表性。存在或新產(chǎn)生的大分子物質(zhì)是中藥注射劑顏色的重要來源，顏色變深是中藥注射劑重要的穩(wěn)定性變化表現(xiàn)。按理，中藥注射劑應(yīng)該嚴(yán)控顏色性狀變化。在上述的實(shí)施例中發(fā)現(xiàn)，只有清開靈注射液和雙黃連注射液在60℃條件30天有肉眼可辨的顏色加深，其他兩種因變色程度小，即使用可見吸收光譜曲線下面積也不好判斷；但用紫外或紫外-可見吸收光譜曲線下面積則能很好地進(jìn)行判斷。無一例外的是，這四種中藥注射劑在60℃烘烤15天時(shí)，均可見沉淀，表明內(nèi)在質(zhì)量發(fā)生了明顯變化，但增加的可見吸收光譜曲線下面積均在10％以下，而用包含紫外區(qū)的吸收光譜曲線下面積來衡量，增加率均在30％以上。這也說明，在中藥注射劑顏色性狀的改變中，紫外區(qū)的改變?cè)缬诳梢妳^(qū)，包含紫外區(qū)的檢測(cè)更靈敏。

對(duì)于大多儀器而言，吸光度或光密度(OD)的理論最大值為4，接近該值即表示出現(xiàn)飽和吸收。為了能真實(shí)地反映光譜吸收，光譜吸收中最好不要出現(xiàn)較多接近4的值。因此，有必要對(duì)檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專♂尯蟮娜芤涸谖展庾V中應(yīng)存在有超過1但小于3的值，這樣有利于提高檢測(cè)的靈敏性。對(duì)于結(jié)果的判斷，可以用絕對(duì)值或相對(duì)值。用絕對(duì)值，就是規(guī)定待測(cè)樣品某個(gè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜曲線下面積不得大于某個(gè)值，或不得大于對(duì)照樣品的值。用相對(duì)值的話，就是規(guī)定待測(cè)樣品某個(gè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜曲線下面積不得高出一定的比例。

對(duì)于具有總提取物特征的中藥注射劑，一般紫外區(qū)吸收光譜曲線下面積和可見區(qū)具有較好的相關(guān)性。但是，如果只采用可見區(qū)吸收光譜曲線下面積，檢測(cè)的靈敏性則較差，絕對(duì)值變化小，相對(duì)值變化也小，導(dǎo)致結(jié)果不好判斷。為了讓吸收曲線下面積具有更大的應(yīng)用范圍，本發(fā)明用創(chuàng)造性的勞動(dòng)發(fā)現(xiàn)，如果光譜區(qū)間包含紫外區(qū)則可以大大提高檢測(cè)靈敏性，甚至單用紫外區(qū)的吸收光譜曲線下面積也能很大程度地提高相對(duì)值和絕對(duì)值評(píng)判的靈敏度，而用紫外-可見吸收光譜的曲線下面積則能進(jìn)一步提高絕對(duì)值評(píng)判的靈敏度。

檢測(cè)紫外-可見吸收光譜的儀器是實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器，除酶標(biāo)儀外，在實(shí)驗(yàn)室廣為普及的國產(chǎn)75-2分光光度計(jì)等也可方便地實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。計(jì)算紫外-可見吸收光譜曲線下面積也容易實(shí)現(xiàn)，光譜掃描時(shí)，如果以1nm步進(jìn)，則將各吸收值(當(dāng)光經(jīng)為1cm時(shí))或OD值(當(dāng)光經(jīng)不為1cm時(shí)，如用多孔板檢測(cè))加起來則可認(rèn)定為是吸收光譜曲線下面積。

對(duì)于具有總提取物特征的單方或復(fù)方中藥注射劑而言，由于顏色變深是反映中藥注射劑穩(wěn)定問題的共性現(xiàn)象，但顏色加深的程度可能因不同中藥注射劑品種而不同。針對(duì)具體的中藥注射劑溶液，可以規(guī)定在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜曲線下面積為某個(gè)值，大于該值則可以判定為不符合規(guī)定。

除了用于總提取物特征的單方或復(fù)方中藥注射劑，對(duì)于以單體或有效部位為特征的中藥注射劑而言，吸收光譜變化也能反映其內(nèi)在質(zhì)量變化。這類中藥注射劑的活性成分相對(duì)清楚，多為同系物，具有一定的共性光譜吸收，這些區(qū)域則構(gòu)成活性成分主吸收區(qū)，這些區(qū)域以外的吸收則為非活性成分吸收區(qū)。針對(duì)具體的中藥注射劑溶液，可以規(guī)定在某一特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜曲線下面積為某個(gè)值，大于該值則可以判定為不符合規(guī)定(相當(dāng)于監(jiān)控有色雜質(zhì)的吸收光譜)；也可規(guī)定在某一特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜曲線下面積為某個(gè)值，小于該值則可以判定為不合格(相當(dāng)于監(jiān)控活性成分的吸收光譜)。在判定時(shí)也可根據(jù)需要設(shè)定相應(yīng)的具體范圍。