本發(fā)明涉及藥品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種同時(shí)鑒別抗菌消炎片中金銀花、黃芩和知母的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

薄層色譜法是一種目前應(yīng)用很廣泛的定性鑒別方法，以2015年版《中國(guó)藥典》一部所收載的復(fù)方中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為例，若除去各品種通則項(xiàng)下所要求的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目，則薄層檢驗(yàn)項(xiàng)目占標(biāo)準(zhǔn)中全部檢驗(yàn)項(xiàng)目比例超過(guò)70％。很多標(biāo)準(zhǔn)中有多個(gè)薄層色譜鑒別項(xiàng)，如達(dá)立通顆粒、正天膠囊、洋參保肺丸、脂脈康膠囊、芪參膠囊、蘇合香丸、通宣理肺片、滑膜炎片、調(diào)經(jīng)活血膠囊和藿香正氣水等標(biāo)準(zhǔn)中有6個(gè)薄層鑒別項(xiàng)，黃連上清膠囊、感冒清熱咀嚼片和糖脈康片等標(biāo)準(zhǔn)中有7個(gè)，活血通脈片標(biāo)準(zhǔn)中有8個(gè)，而在2010年版及以前各版次《中國(guó)藥典》所收載復(fù)方中成藥標(biāo)準(zhǔn)中幾乎沒(méi)有超過(guò)5個(gè)薄層鑒別項(xiàng)的品種，照此發(fā)展趨勢(shì)，2020年版?zhèn)€別品種標(biāo)準(zhǔn)中出現(xiàn)10個(gè)以上薄層鑒別項(xiàng)將不足為怪，標(biāo)準(zhǔn)將越來(lái)越繁雜，使得藥品生產(chǎn)企業(yè)及藥品檢驗(yàn)部門(mén)的日常檢驗(yàn)工作任務(wù)有增無(wú)減。

薄層色譜法之所以在中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用很廣泛，主要原因在于成本非常低，對(duì)實(shí)驗(yàn)室硬件條件要求不高，但其分離能力和檢驗(yàn)效率都比較低，一個(gè)薄層鑒別項(xiàng)只能鑒別復(fù)方中成藥中一味藥材，試驗(yàn)中使用了大量有毒化學(xué)試劑，帶來(lái)了很嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題，也極大危害了檢驗(yàn)人員身體健康，所以有必要采用高效、簡(jiǎn)便、低毒和專屬性更強(qiáng)的方法來(lái)代替薄層色譜法進(jìn)行檢驗(yàn)。

目前高效液相色譜儀已經(jīng)成為藥品實(shí)驗(yàn)室必備的儀器，高效液相色譜法具有很高的色譜分離能力，且試驗(yàn)中不需要使用三氯甲烷、甲苯等薄層色譜法常用的有毒化學(xué)試劑，檢驗(yàn)過(guò)程大部分由儀器來(lái)完成等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在藥品定量研究方面應(yīng)用非常廣泛，但定性研究方面應(yīng)用較少。

抗菌消炎片是由金銀花、黃芩、知母等七味藥組成，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)第七冊(cè)(ws3-b-1339-93)，標(biāo)準(zhǔn)中未收載鑒別項(xiàng)，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，對(duì)抗菌消炎片的鑒別研究除采用顯微鑒別方法外，均采用薄層色譜法對(duì)處方中金銀花、黃芩、知母等藥味進(jìn)行定性鑒別，未見(jiàn)有采用液相色譜法鑒別抗菌消炎片的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中薄層色譜法檢測(cè)中藥中存在的環(huán)境污染問(wèn)題嚴(yán)重、分離能力和檢驗(yàn)效率低的問(wèn)題，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N檢測(cè)友好、效率高的同時(shí)鑒別抗菌消炎片中金銀花、黃芩和知母的檢測(cè)方法。本研究在同一色譜條件下可以同時(shí)鑒別處方中上述三味藥材的11個(gè)特征峰，大大優(yōu)于傳統(tǒng)的薄層鑒別法。

本發(fā)明是通過(guò)以下步驟得到的：

一種同時(shí)鑒別抗菌消炎片中金銀花、黃芩和知母的檢測(cè)方法，其特征在包括以下步驟：

(1)對(duì)待檢物進(jìn)行高效液相色譜儀檢測(cè)得到色譜圖，

(2)將步驟(1)得到的色譜圖同標(biāo)準(zhǔn)色譜圖進(jìn)行比對(duì)。

所述的檢測(cè)方法，優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)色譜圖中主色譜峰為黃芩苷，以此作為參照峰，其余10個(gè)色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.30、0.31、0.42、0.84、0.91、1.13、1.16、1.24、1.31和1.33。各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間誤差應(yīng)控制在±5％以內(nèi)。

所述的檢測(cè)方法，優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)色譜圖是金銀花、黃芩和知母的對(duì)照藥材混合后進(jìn)行高效液相色譜儀檢測(cè)后，對(duì)色譜圖進(jìn)行篩選后得到的。

所述的檢測(cè)方法，優(yōu)選色譜條件：色譜柱agilentextendc185μm,4.6×250mm；以乙腈為流動(dòng)相a，以0.5％磷酸溶液為流動(dòng)相b，梯度洗脫，0～5min，5％a，5～20min,5→9％a，20～64min，9→21％a，64～80min，21→30％a，80～95min，30→80％a，得到待檢物的色譜圖，波長(zhǎng)317.5±2nm。

一般的薄層色譜法鑒別金銀花、黃芩和知母三味藥材，需要三個(gè)不同的薄層鑒別試驗(yàn)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。且還需要綠原酸、黃芩苷和芒果苷對(duì)照品方能對(duì)薄層色譜中主斑點(diǎn)進(jìn)行定性確認(rèn)，結(jié)果判定也只關(guān)注主斑點(diǎn)是否存在。而采用該文研究方法，不需要各種價(jià)格不菲的對(duì)照品，僅需要三種價(jià)格非常低廉的對(duì)照藥材，就可以對(duì)上述藥味進(jìn)行非常準(zhǔn)確的定性鑒別，該檢驗(yàn)需要對(duì)11個(gè)特征色譜峰進(jìn)行比對(duì)，且通過(guò)引入相對(duì)保留時(shí)間這一因素，可以確認(rèn)其所含有的九種化學(xué)物質(zhì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于薄層色譜法僅能分別對(duì)3個(gè)主斑點(diǎn)是否存在進(jìn)行評(píng)判的方法。

試驗(yàn)過(guò)程中曾使用了中國(guó)食品藥品檢定研究院提供的多個(gè)批號(hào)的金銀花、黃芩和知母對(duì)照藥材，只需要進(jìn)行等比例取樣，在波長(zhǎng)317.5nm±2nm下，均可保證混合對(duì)照藥材溶液主色譜峰為黃芩苷，均呈現(xiàn)11個(gè)主要特征色譜峰。如果混合對(duì)照藥材溶液不能呈現(xiàn)上述11個(gè)色譜峰，或各色譜峰的分離度小于1.5，則該方法不能用于檢驗(yàn)，應(yīng)更換色譜柱或?qū)φ账幉模⒅匦逻M(jìn)行試驗(yàn)。為保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，三種對(duì)照藥材取樣比例應(yīng)控制在±10％以內(nèi)，即(1±10％)：(1±10％)：(1±10％)。

為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，供試品溶液中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)控制在±5％以內(nèi)，超出該范圍，則判為不合格。供試品溶液中任何色譜峰的缺失，則結(jié)果判為不合格，并應(yīng)根據(jù)缺失色譜峰的藥味歸屬，進(jìn)一步判定具體由哪味藥材引起，并可結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)分析不合格的原因。

本發(fā)明的有益效果：

1、通過(guò)對(duì)抗菌消炎片中存在與金銀花、黃芩和知母混合對(duì)照藥材相應(yīng)的11個(gè)色譜峰進(jìn)行篩選，并對(duì)其中9個(gè)色譜峰進(jìn)行了確認(rèn)，實(shí)現(xiàn)了上述三味藥材的準(zhǔn)確定性鑒別；

2、該方法環(huán)保、高效，重現(xiàn)性好，可用于抗菌消炎片的定性質(zhì)量控制。

附圖說(shuō)明

圖1金銀花對(duì)照藥材溶液的hplc色譜圖，

圖2黃芩對(duì)照藥材溶液的hplc色譜圖，

圖3知母對(duì)照藥材溶液的hplc色譜圖，

圖4混合對(duì)照藥材溶液的hplc色譜圖,

圖5供試品的溶液的hplc色譜圖，樣4，批號(hào)1511002，合格，

圖6金銀花、黃芩和知母的陰性對(duì)照溶液的hplc色譜圖,

圖7混合對(duì)照品的溶液hplc色譜圖,

圖8供試品的溶液的hplc色譜圖，樣1，批號(hào)20150510，不合格,

圖9供試品的溶液的hplc色譜圖，樣6，批號(hào)215001079，不合格，

其中附圖中各峰1.新芒果苷；2.綠原酸；3.芒果苷；4.異綠原酸b；5.異綠原酸c；6.黃芩苷；7.未知；8.漢黃芩苷；9.黃芩素；10.漢黃芩素；11.未知。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例1

1.儀器與試藥

waters2695高效液相色譜儀，waters2448dad檢測(cè)器；sartoriuscp225d電子天平；bk-600c超聲波清洗儀(巴克超聲設(shè)備有限公司)

綠原酸(批號(hào)110753-201415)、黃芩苷(批號(hào)110715-201117)、黃芩素(批號(hào)111595-201306)、新芒果苷(成都曼斯特生物科技有限公司，純度大于98％)，

芒果苷(批號(hào)111607-200301)、漢黃芩苷批號(hào)071114(純度≥98％，上海同田生物技術(shù)有限公司)、漢黃芩素(批號(hào)111514-200403)、金銀花對(duì)照藥材(批號(hào)121060-201107)、黃芩對(duì)照藥材(批號(hào)120955-201309)、知母對(duì)照藥材(批號(hào)121070-200503)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；異綠原酸b、異綠原酸c批號(hào)分別為ps100623-03、ps100623-01，純度≥98％，均購(gòu)自成都普思生物科技有限公司；抗菌消炎片均為市售樣品；乙腈為色譜純。

2.方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1供試品溶液的制備

取本品(糖衣片除去包衣)，研細(xì)，混勻，取約0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，超聲處理(功率250w，頻率40khz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用70％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2對(duì)照藥材溶液的制備

取金銀花對(duì)照藥材、黃芩對(duì)照藥材和知母對(duì)照藥材各約0.20g，精密稱定，照供試品溶液的制備方法，分別制得對(duì)照藥材溶液。

2.1.3混合對(duì)照藥材溶液的制備

取金銀花對(duì)照藥材、黃芩對(duì)照藥材和知母對(duì)照藥材各約0.10g，精密稱定，照供試品溶液的制備方法，制得混合對(duì)照藥材溶液。

2.1.4混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取新芒果苷、綠原酸、芒果苷、異綠原酸b、異綠原酸c、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素上述九種對(duì)照品適量，加70％甲醇制成每ml各含50μg、0.1mg、60μg、50μg、40μg、0.2mg、45μg、50μg、和50μg的混合溶液。

2.1.5陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例及工藝制備了缺金銀花、黃芩和知母三味藥材的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用如下色譜條件：色譜柱agilentextendc18(5μm,4.6×250mm)；以乙腈為流動(dòng)相a，以0.5％磷酸溶液為流動(dòng)相b，梯度洗脫，0～5min，5％a，5～20min,5→9％a，20～64min，9→21％a，64～80min，21→30％a，80～95min，30→80％a，dad檢測(cè)器。理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算不得少于10000。

2.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別精密吸取上述對(duì)照藥材溶液、混合對(duì)照藥材溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，進(jìn)行定性分析，圖譜分別見(jiàn)圖1～5。發(fā)現(xiàn)在波長(zhǎng)317.5nm條件下，金銀花對(duì)照藥材溶液色譜中有3個(gè)主要特征峰，黃芩對(duì)照藥材溶液色譜中有6個(gè)主要特征峰，知母對(duì)照藥材溶液色譜中有2個(gè)主要特征峰，供試品溶液色譜與混合對(duì)照藥材溶液色譜中也呈現(xiàn)上述相應(yīng)的11個(gè)主要特征色譜峰，各色譜峰的分離度均大于1.5，說(shuō)明在該波長(zhǎng)條件下可以同時(shí)檢測(cè)上述三味藥材，故選擇317.5nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4專屬性試驗(yàn)

精密吸取陰性對(duì)照溶液10μl，注入液相色譜儀，進(jìn)行分析，圖譜見(jiàn)圖6。在波長(zhǎng)317.5nm下，在混合對(duì)照藥材溶液和供試品溶液色譜中呈現(xiàn)的11個(gè)主要特征色譜峰在陰性對(duì)照溶液色譜相應(yīng)的位置處沒(méi)有干擾峰出現(xiàn)，說(shuō)明本方法具有很高的專屬性。

2.5色譜峰的確認(rèn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，進(jìn)行分析，圖譜見(jiàn)圖7。金銀花對(duì)照藥材溶液色譜中的3個(gè)主要特征峰為峰2(綠原酸)、峰4(異綠原酸b)和峰5(異綠原酸c)，黃芩對(duì)照藥材溶液色譜中的6個(gè)主要特征峰為峰6(黃芩苷)、峰7(未知1)、峰8(漢黃芩苷)、峰9(黃芩素)、峰10(漢黃芩素)和峰11(未知2)，知母對(duì)照藥材溶液色譜中的2個(gè)主要特征峰為峰1(新芒果苷)和峰3(芒果苷)。

2.6參照色譜峰的選擇

混合對(duì)照藥材溶液呈現(xiàn)11個(gè)主要的特征色譜峰，中間6號(hào)色譜峰為黃芩苷，在波長(zhǎng)317.5nm下，黃芩苷色譜峰為主峰，其峰面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他十個(gè)色譜峰，在保證金銀花、黃芩和知母對(duì)照藥材等比例取樣的條件下，按照本研究供試品溶液制備方法，則該混合溶液的主色譜峰一定是黃芩苷，而且該色譜峰恰好在十一個(gè)色譜正中央，故可以利用該主色譜峰作為參照峰，來(lái)計(jì)算其他十個(gè)色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，這樣計(jì)算所得相對(duì)保留時(shí)間偏差較小。其余10個(gè)色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.30、0.31、0.42、0.84、0.91、1.13、1.16、1.24、1.31和1.33。各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)控制在±5％以內(nèi)。

實(shí)施例2相對(duì)保留時(shí)間的精密度試驗(yàn)考察

精密吸取混合對(duì)照藥材溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，以所得混合對(duì)照藥材溶液主色譜峰黃芩苷峰為參照峰，計(jì)算11個(gè)主要的特征色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間。

表111個(gè)主要的特征色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的精密度試驗(yàn)考察結(jié)果

上述結(jié)果可知，11個(gè)色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的rsd均小于3％，提示本方法的精密度試驗(yàn)良好。

實(shí)施例3樣品的測(cè)定

抗菌消炎片全國(guó)共有6家生產(chǎn)企業(yè)，本實(shí)驗(yàn)選取全部6家不同企業(yè)樣品進(jìn)行考察，批號(hào)分別為20150510、150504、150606、1511002、20151101和215001079。

表211個(gè)主要的特征色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的不同企業(yè)樣品的考察結(jié)果

(“/”表示未檢出該色譜峰)

上表結(jié)果可知，樣1和樣2中均未能檢出峰1(知母-新芒果苷)、峰5(金銀花-異綠原酸c)和峰11(黃芩-未知物)，圖譜見(jiàn)圖8(樣1)，判為不合格。經(jīng)進(jìn)一步含量測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)樣1和樣2所含綠原酸、芒果苷和黃芩苷的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均含量水平，提示該兩批樣品可能存在知母、金銀花和黃芩三味藥材少投料現(xiàn)象；樣3、樣4和樣5均能檢出上述11個(gè)特征峰，判定為合格，圖譜見(jiàn)圖5(樣4)；樣6中未能檢出峰1(知母-新芒果苷)和峰3(知母-芒果苷)，圖譜見(jiàn)圖9(樣6)，判為不合格，該批樣品可能存在知母未投料現(xiàn)象。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡(jiǎn)化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。