本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種腫瘤組織體外病理染色試劑盒。

背景技術(shù)：

目前，腫瘤已是威脅人類健康的一種全球性疾病，研發(fā)高效地用于腫瘤早期、微小轉(zhuǎn)移灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢測藥物對于延長患者的生存周期及生存質(zhì)量至關(guān)重要。

近年來，隨著腫瘤基因組學和分子藥理學的飛速發(fā)展，新型的腫瘤靶向藥物的研發(fā)取得了不錯的研究成果，但是許多靶向藥物的適應癥范圍有限，且價格昂貴，副作用也不是十分明確。Cetuximab，中文稱作“西妥昔單抗”，屬于嵌合型IgG1單克隆抗體，分子靶點為表皮生長因子受體(EGFR)，其中文藥品名通稱為“愛必妥”，是一種主要用于治療晚期結(jié)腸癌的藥物。該藥的抗腫瘤機制主要是其可以以高出內(nèi)源性配體5-10倍的親和力與表皮生長因子受體(EGFR)特異結(jié)合，可阻礙內(nèi)源EGFR配體的結(jié)合，從而抑制受體功能，進一步誘導EGFR內(nèi)吞從而導致受體數(shù)量的下調(diào)，抑制細胞的增殖、血管生成、細胞的入侵及轉(zhuǎn)移等等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤組織體外病理染色試劑盒，以期解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的至少部分技術(shù)問題。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種腫瘤組織體外病理染色試劑盒，其包括：

(1)活性成分Cetuximab；

(2)能夠與Cetuximab偶聯(lián)并保持Cetuximab活性的熒光標記物。

其中，所述的Cetuximab，中文稱作“西妥昔單抗”，屬于嵌合型IgG1單克隆抗體，分子靶點為表皮生長因子受體(EGFR)，其中文藥品名通稱為“愛必妥”，是一種主要用于治療晚期結(jié)腸癌的藥物，常規(guī)市售可得。

其中，所述的腫瘤包括各類良性腫瘤、惡性腫瘤，以及癌前病變組織。所述的腫瘤更優(yōu)選包括肺癌、結(jié)直腸癌以及食管癌中的一種或幾種。

其中，所述的熒光標記物為本領(lǐng)域常規(guī)，只要其能夠與Cetuximab偶聯(lián)并保持Cetuximab的活性即可，優(yōu)選包括FITC(fluorescein isothiocyanate，異硫氰酸熒光素)、IRDye800、ICG(吲哚菁綠)、花菁染料和Cy類熒光染料中的一種或幾種。

其中的Cy類熒光染料為本領(lǐng)域的常規(guī)試劑，包括Cy7、Cy5.5、Cy3及其衍生物等，市售可得。

如本領(lǐng)域常規(guī)，所述的腫瘤組織體外病理染色試劑盒還可以包括用于腫瘤組織體外病理染色的各類常規(guī)試劑和/或儀器，如蘇木-伊紅染色液、組織包埋劑和PBS緩沖液等。

為了增加產(chǎn)品使用的方便性，在本發(fā)明的一較佳實例中，將上述能夠與Cetuximab偶聯(lián)并保持Cetuximab活性的熒光標記物與Cetuximab配制成Cetuximab-FITC溶液，所述腫瘤組織體外病理染色試劑盒包括：

(1)2mg/mL的Cetuximab-FITC；

(2)20mg/mL的磷酸二氫鈉、66mg/mL的磷酸氫二鈉和424mg/mL的氯化鈉。

本發(fā)明公開了Cetuximab的一種新用途，通過實驗驗證，發(fā)現(xiàn)對cetuximab進行一定熒光標記后用于腫瘤組織體外病理染色，可以將正常組織與腫瘤組織進行很好的區(qū)分，在一定程度上可區(qū)分高分化和低分化的腫瘤組織，可以用作腫瘤檢測，實現(xiàn)舊藥新用。

附圖說明

圖1顯示實施例1中流式細胞儀分析不同食管癌細胞系對Cetuximab-FITC的攝取情況的結(jié)果；

圖2顯示實施例1中熒光顯微鏡觀察不同食管癌細胞系對Cetuximab-FITC的攝取情況的結(jié)果；

圖3顯示實施例1中靜脈注射Cetuximab-IRDye800后不同時間點小鼠活體熒光圖像的結(jié)果；

圖4顯示實施例1中靜脈注射Cetuximab-IRDye800后檢測其對微小病灶的檢測能力的結(jié)果；

圖5顯示實施例2中以Cetuximab-FITC染色液對正常組織和腫瘤組織進行體外染色的結(jié)果，其中圖中從左至右依次為食管、肌肉、TE1腫瘤組織和KSYE30腫瘤組織。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，并參照附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應當以此限制本發(fā)明的保護范圍。

Cetuximab，中文稱作“西妥昔單抗”，屬于嵌合型IgG1單克隆抗體，分子靶點為表皮生長因子受體(EGFR)，其中文藥品名通稱為“愛必妥”，是一種主要用于治療晚期結(jié)腸癌的藥物。該藥的抗腫瘤機制主要是其可以以高出內(nèi)源性配體5-10倍的親和力與表皮生長因子受體(EGFR)特異結(jié)合，可阻礙內(nèi)源EGFR配體的結(jié)合，從而抑制受體功能，進一步誘導EGFR內(nèi)吞從而導致受體數(shù)量的下調(diào)，抑制細胞的增殖、血管生成、細胞的入侵及轉(zhuǎn)移等等。但是，截止目前，本領(lǐng)域尚沒有關(guān)于將Cetuximab作為腫瘤篩查或診斷藥物應用的報道。

本發(fā)明的發(fā)明人通過整合癌癥組學Cosmic version72數(shù)據(jù)庫的癌癥基因譜Cancer Gene Census以及蛋白質(zhì)相互作用STRING version10數(shù)據(jù)庫和Drug Bank version4.2中FDA批準的藥物數(shù)據(jù)庫，獲得的候選重定位藥物，對腫瘤細胞系進行了篩查實驗，篩選出新的抗腫瘤藥物。做腫瘤細胞系篩選的候選腫瘤抑制藥物如下：

Cetuximab,Trasruzumab,Lidocaine,Gefitinib,Erlotinib,Lapatinib,Panitumumab,Vandetanib,Afatinib,Osimertinib,Nacitumumab,Bevacizumab,Minocyxline,Gliclazide,Carvedilol,Ranibizumab,Vandetanib,Dalteparin,Aflibercept.

在研究的過程中，本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，對cetuximab進行一定熒光標記后用于腫瘤組織體外病理染色，可以將正常組織與腫瘤組織進行很好的區(qū)分，在一定程度上可區(qū)分高分化和低分化的腫瘤組織，可以用作腫瘤檢測，實現(xiàn)舊藥新用，遂欲申請專利進行保護。

本發(fā)明的技術(shù)方案不局限于以下所列舉的具體實施方式，可以是各種實施方式之間的任意組合。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的儀器、材料、試劑等，如無特殊說明，均為可從常規(guī)商業(yè)途徑獲得。

下述實施例中待測藥物的活性成分為Cetuximab(即西妥昔單抗，中文藥品名通稱為“愛必妥”)，其化學式為：C₆₄₈₄H₁₀₀₄₂N₁₇₃₂O₂₀₂₃S₃₆，其重鏈為QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(如序列表中SEQ IDNO.1所示)，其輕鏈為DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(如序列表中SEQ ID NO.2所示)；其為drug bank產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為DB00002。

下述實施例中的人食管癌細胞系TE-1、人食管鱗癌細胞系KYSE30的出處如下：

TE-1購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，資源編號為3131C0001000700089；

KYSE30購自上?？瓢凵镉邢薰?，貨號為CBP60457。

下述實施例中的動物出處如下：

Balb/c裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

下述實施例中的主要儀器及耗材的來源如下：

12-well白色底透細胞培養(yǎng)板(Costar產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為No.3513)；

Fetal Bovine Serum(Gibco產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為10099141)；

100mm培養(yǎng)皿(Corning產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為430167)；

RPMI-1640medium(Gibco產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為A1049101)；

DMSO(Sigma產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為No.D4540)；

流式細胞儀(BD產(chǎn)品，產(chǎn)品型號為Accuri C6，USA)；

熒光倒置顯微鏡(Leica，DMI3000B，German)；

高檢測靈敏度的光學成像系統(tǒng)(PerkinElmer，IVIS Spectrum，USA)。

實施例1 Cetuximab的靶向性及特異性檢測

一、待測孔板的制備

1、細胞鋪板

a)配制各細胞所需的完全培養(yǎng)基。

具體地，基本培養(yǎng)基RPMI或DMEM占80％-90％，胎牛血清占10％-20％，按1％的體積分數(shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使用青霉素和鏈霉素的終濃度分別是100U/mL和100μg/mL。

b)實驗開始前，確認標記在100mm培養(yǎng)皿上的細胞系的名字、培養(yǎng)基以及傳代時間、代次等信息，確保實驗無誤。

c)利用無菌吸管吸取細胞培養(yǎng)基。

d)用3-5mL的無菌PBS溶液潤洗細胞表層，再用無菌吸管吸出PBS廢液。

e)向培養(yǎng)基中加入1mL 0.25％(w/v)含0.04％(w/v)EDTA的胰酶溶液用于消化細胞，輕輕混勻，使溶液覆蓋住細胞表層，在顯微鏡下觀察，等細胞完全脫離培養(yǎng)皿底部且細胞連接較松散時加入5-10mL完全培養(yǎng)基并進行吹打。

f)將細胞分離成單個后，將此細胞懸液轉(zhuǎn)移到15mL無菌離心管中，800rpm離心5min。

g)利用無菌吸管吸出上清培養(yǎng)基，并加入5mL新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，輕輕吹打混勻，

h)用細胞計數(shù)板對細胞懸液進行計數(shù)，調(diào)整細胞懸液的濃度并接種到12孔培養(yǎng)板中進行鋪板實驗，細胞密度為2×10⁵個細胞/孔。

2、待測藥物Cetuximab-FITC的配制和加藥

1)Cetuximab-FITC的制備

將Cetuximab分散到pH為8.5的PBS中，并按照摩爾比1:1～1:3的比例加入FITC，在35℃的條件下反應2h。Cetuximab-FITC復合物用PD10脫鹽柱進行分離純化。其具體濃度及連接效率通過HPLC進行分析。

2)取上述配制好的1mg/mL的待測藥物Cetuximab-FITC用培養(yǎng)基分別稀釋到5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，其中5，10，20，50，100μg/mL的藥物用于流式細胞儀的檢測，50，100，200μg/mL的藥物用于熒光倒置顯微鏡的觀察。不加任何藥物的孔作為對照孔。每個濃度設置3-5個復孔。

3、流式細胞儀檢測待測藥物的靶向性和特異性

1)利用無菌吸管將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸除。

2)步驟1中配制好的待測藥物加入到12孔培養(yǎng)板中，放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。

3)利用無菌吸管吸出培養(yǎng)基廢液，并加入1-2mL無菌PBS/孔清洗細胞表層，再用無菌吸管吸出PBS廢液。

4)向培養(yǎng)板中加入0.2mL 0.25％(w/v)含0.04％(w/v)EDTA的胰酶溶液用于消化細胞，輕輕混勻，使溶液覆蓋住細胞表層，在顯微鏡下觀察，等細胞完全脫離培養(yǎng)皿底部且細胞連接較松散時加入1-2mL完全培養(yǎng)基并進行吹打。

5)將上述細胞懸液分別置于1.5mL離心管中，800rpm離心5min，并用無菌PBS洗滌2-3次。

6)用0.5mL無菌PBS重懸細胞沉淀，吹打均勻，用流式細胞儀進行檢測。

結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出，腫瘤細胞TE-1(圖1a)和KYSE30(圖1b)對待測藥物具有很好的攝取且隨著藥物濃度增加其細胞攝取量也逐漸增加，為了更直觀地顯示這種關(guān)系，我們以藥物濃度為橫坐標，細胞的平均熒光強度為縱坐標作圖(圖1c)，從圖中可以看出待測藥物的攝取不僅僅與濃度有關(guān)，且在不同細胞間存在很大差異，其攝取量與細胞表面EGFR的表達水平成正相關(guān)(EGFR水平TE-1<KYSE30)。

4、熒光倒置顯微鏡觀察細胞對待測藥物的攝取情況

1)利用無菌吸管將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸除。

2)步驟1中配制好的待測藥物加入到12孔培養(yǎng)板中，放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。

3)利用無菌吸管吸出培養(yǎng)基廢液，并加入1-2mL無菌PBS/孔清洗細胞表層2-3次，再用無菌吸管吸出PBS廢液。

4)將細胞置于熒光倒置顯微鏡中進行觀察。

結(jié)果如圖2所示，從結(jié)果圖中可以看出與流式細胞儀的結(jié)果保持了高度的一致性。

二、動物實驗檢測待測藥物的在體靶向性和精確性

1、荷瘤小鼠模型的建立

取KYSE30腫瘤細胞，800轉(zhuǎn)離心5min，再用無菌PBS洗滌腫瘤細胞3次，并做適當稀釋，用血球計數(shù)板進行計數(shù)制成濃度為6×10⁷個/ml的腫瘤細胞懸液，每只小鼠背部偏左后肢皮下接種腫瘤細胞懸液0.1mL。

接種完成后，逐日觀察接種部位有無感染，腫瘤生長后有無自然消退，用游標卡尺，每3天測量腫瘤長徑a和短徑b，并計算腫瘤體積，即V＝(a×b²)/2，每3天稱量小鼠體重和腫瘤并記錄，繪制曲線。

2、靶向性驗證

先制備Cetuximab-IRDye800溶液：將IRDye800分散到pH7.4的PBS中，并加入10倍摩爾量的EDC和NHS，活化反應10-20min，之后加入一定量的Cetuximab(其摩爾量是染料的1/3～1倍)，在35℃的條件下反應2h。Cetuximab-IRDye800復合物用PD10脫鹽柱進行分離純化。其具體濃度及連接效率通過HPLC進行分析。

待腫瘤體積達～100mm³時，靜脈注射1mg/mL的Cetuximab-IRDye800溶液0.1mL，用高檢測靈敏度的光學成像系統(tǒng)監(jiān)測不同時間點小鼠體內(nèi)的熒光分布情況。

結(jié)果如圖3所示，隨著時間的延長待測藥物在腫瘤部位的富集在24h時達到峰值，時間繼續(xù)增加雖腫瘤部位熒光強度減弱，但與周圍組織的區(qū)分度越來越明顯，說明待測藥物具有很好的腫瘤靶向性。

3、精確性驗證

在同一小鼠上接種兩個腫瘤，一大一小，大腫瘤的直徑約12mm，小腫瘤的直徑<2mm,靜脈注射1mg/mL的Cetuximab-IRDye800溶液0.1mL，用高檢測靈敏度的光學成像系統(tǒng)監(jiān)測不同時間點小鼠體內(nèi)的熒光分布情況。

結(jié)果如圖4所示，圖4中，左側(cè)顯示注射前觀察結(jié)果，右邊顯示注射后24小時觀察結(jié)果(實際上在注射后6小時即能顯示腫瘤位置，24小時時顯示更為精確)，圖4中不僅僅大腫瘤能夠顯現(xiàn)，<2mm的小腫瘤也能明確顯現(xiàn)出來，說明了待測藥物具有很好的精確性。

綜合上述實驗結(jié)果，說明cetuximab與染料的復合物無論在細胞水平還是動物水平都體現(xiàn)了很好的靶向性，而且可以檢測到直徑小于2mm的腫瘤，在腫瘤早期診斷中具有很大的臨床應用潛力。

實施例2 Cetuximab用于腫瘤組織體外病理染色

1、待測藥物Cetuximab-FITC的配制

Cetuximab-FITC的制備

將Cetuximab分散到pH為8.5的PBS中，并按照摩爾比1:1～1:3的比例加入FITC，在35℃的條件下反應2h。Cetuximab-FITC復合物用PD10脫鹽柱進行分離純化。其具體濃度及連接效率通過HPLC進行分析。

2、腫瘤組織體外病理染色的具體實施步驟如下：

1)將待檢測組織從動物或人體上取下浸泡在10％的中性福爾馬林溶液中，浸泡1-2天；

2)對組織進行石蠟包埋，并用病理切片機切成5μm厚度的薄片，切片脫蠟，蒸餾水洗；

3)0.001～0.005mg/mL的Cetuximab-FITC染色液室溫染色10-15分鐘；

4)pH7.4的PBS洗滌3-5次，每次5分鐘；

5)切片脫水，樹膠封片；

6)熒光顯微鏡觀察。

為了驗證本發(fā)明的試劑盒具有很好的特異性，我們選擇了正常的食管、肌肉組織進行對比，以TE1和KYSE30兩種腫瘤組織作為實驗組，進行觀察，實驗結(jié)果通過Matlab軟件進行了處理，更易于觀察，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明通過上述試劑進行染色后，可以將正常組織與腫瘤組織進行很好的區(qū)分，在一定程度上可區(qū)分高分化(KYSE30)和低分化(TE1)的腫瘤組織，可以用作腫瘤檢測。

以上所述的具體實施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進行了進一步詳細說明，應理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 中國科學院自動化研究所

<120> 一種腫瘤組織體外病理染色試劑盒

<130> IB177102

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cetuximab重鏈

<400> 1

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cetuximab輕鏈

<400> 2

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210