本發(fā)明屬于中藥化合物篩選技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種香附藥材中天然-葡萄糖苷酶抑制劑的快速篩選方法。

背景技術(shù)：

-葡萄糖苷酶（agh）是一種分布于小腸黏膜刷狀緣的糖苷代謝酶，通過水解低聚糖中的-1,4糖苷鍵，將進(jìn)入小腸的碳水化合物最終轉(zhuǎn)化為葡萄糖，所產(chǎn)生的葡萄糖被機(jī)體吸收進(jìn)入血液即成為血糖。-葡萄糖苷酶抑制劑（aghi）是20世紀(jì)70年代后期開發(fā)出的一類的新型口服降血糖藥物，可延遲葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收，進(jìn)而有效推遲糖尿病人餐后血糖升高的時(shí)間及進(jìn)程，降低糖尿病風(fēng)險(xiǎn)。目前，以阿卡波糖為代表的aghi已成為治療ii型糖尿病的一線藥物。然而這些人工合成的aghi，具有一些較為明顯的副作用（如腸胃脹氣，腹部痙攣等），因此從中藥和天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新型的、副作用較小的天然aghi一直是藥學(xué)工作者們所關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

目前，天然aghi的主流篩選方法有系統(tǒng)分離法、活性追蹤法和高通量篩選法等，然而這些主流篩選方法均存在著一個(gè)重大缺陷，均需要進(jìn)行復(fù)雜的、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的分離工作，才能從天然混合物中分離出單體活性成分。由此可見，制約天然aghi篩選效率的主要因素是繁瑣的分離純化步驟，即使是高通量篩選，也僅僅是加快了活性測試的過程，但它仍需要大量的、經(jīng)過系統(tǒng)分離后的單體化合物作為化合物庫，方能進(jìn)行快速篩選。為了突破這個(gè)瓶頸，一些著眼于簡化化合物分離、純化環(huán)節(jié)的快速篩選新方法迅速發(fā)展起來，其中基于固定化酶親和吸附原理的快速篩選方法最受人們關(guān)注。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種香附藥材中天然-葡萄糖苷酶抑制劑的快速篩選方法。

本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：香附藥材中天然-葡萄糖苷酶抑制劑的快速篩選方法，具體包括以下步驟。

步驟1、固定化酶的合成：將氨基硅膠與戊二醛反應(yīng)，得到醛基硅膠，即為空白基質(zhì)；所得的醛基硅膠再與-葡萄糖苷酶（agh）反應(yīng)，得到agh鍵和硅膠，即固定化酶。

步驟2、固定化酶的親和吸附與解吸：將固定化酶與香附提取液共孵育一段時(shí)間后，離心分離出固定化酶，再將固定化酶上特異性親和吸附的化合物洗脫下來，所述的特異性親和吸附的化合物為aghi候選分子；重新取香附提取液，并將空白基質(zhì)與香附提取液共孵育一段時(shí)間后，離心分離出空白基質(zhì)，再將空白基質(zhì)上特異性親和吸附的化合物洗脫下來，所述的特異性親和吸附的化合物為假陽性分子。

步驟3、香附aghi的結(jié)構(gòu)確定：將aghi候選分子和假陽性分子分別進(jìn)行uhplc-ms分析，測定二者的指紋圖譜，隨后將aghi候選分子的指紋圖譜和假陽性分子的指紋圖譜進(jìn)行扣減（“aghi候選分子的指紋圖譜”的信號減去“假陽性分子的指紋圖譜”的信號），即可得到除去假陽性結(jié)果的香附aghi指紋圖譜；再通過hr-ms技術(shù)即可確定香附aghi的結(jié)構(gòu)。

步驟4、香附aghi的活性驗(yàn)證：將上述篩選出的香附aghi，采用常規(guī)的酶活測定法檢測其agh抑制活性，進(jìn)一步證明親和篩選結(jié)果的可靠性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的篩選方法具有如下優(yōu)勢和特點(diǎn)。

本發(fā)明是在我們的前期研究成果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入研究，前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥香附提取物具有很強(qiáng)的agh抑制活性，很有希望從中發(fā)現(xiàn)天然aghi活性單體，因此我們將香附提取物作為待篩選化合物庫，采用固定化agh酶親和篩選方法進(jìn)行天然aghi的快速發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的方法是先將固定化agh酶與待篩選化合物庫共孵育，利用酶和抑制劑間的特異性親和作用力，形成“酶-抑制劑”復(fù)合體，隨后將這種復(fù)合體從孵育體系中分離出來，再從復(fù)合體上解吸出抑制劑，并進(jìn)一步鑒定出抑制劑結(jié)構(gòu)。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于無需復(fù)雜耗時(shí)的分離工作，可在較短時(shí)間內(nèi)（數(shù)小時(shí)）篩選出天然產(chǎn)物混合物中的活性抑制劑單體。

本發(fā)明的篩選方法相對于傳統(tǒng)的天然aghi篩選方法而言，本技術(shù)具有快速（篩選周期由數(shù)天至數(shù)周縮短至數(shù)小時(shí)），高效經(jīng)濟(jì)（無需消耗大量藥材、試劑、人力和場地），實(shí)用可靠（可消除假陽性，另包含活性驗(yàn)證環(huán)節(jié)）等突出特點(diǎn)；相對于目前已建立的一些aghi親和篩選方法而言，本方法的特點(diǎn)在于：首次將基于固定化酶親和技術(shù)的天然-葡萄糖苷酶抑制劑的快速篩選方法應(yīng)用于香附藥材的活性成分篩選中，并成功完成了快速篩選，命中了三種強(qiáng)效的天然aghi；引入平行對照實(shí)驗(yàn)，有效的消除了由于固定化基質(zhì)的非特異性吸附引起的假陽性結(jié)果；引入化合物抑制活性驗(yàn)證環(huán)節(jié)，驗(yàn)證了本篩選方法的可靠性。

附圖說明

圖1固定化酶的制備過程原理示意圖。

圖2固定化酶的親和吸附與解吸過程原理示意圖；其中1為固定化酶，2為空白基質(zhì)，3為香附提取物，4為親和解析，5為aghi候選分子，6為假陽性分子。

圖3香附aghi的結(jié)構(gòu)確定過程的原理示意圖；其中1為aghi候選分子，2為非特異性吸附的假陽性分子，3為注入uhplc-ms進(jìn)行指紋圖譜分析，4為aghi候選分子的指紋圖譜，5為假陽性分子的指紋圖譜，6為圖譜扣減，7為扣除假陽性結(jié)果后得到的香附aghi的指紋圖譜。

圖4香附藥材提取液的uhplc-ms指紋圖譜。

圖5aghi候選分子（實(shí)線）及假陽性分子（虛線）的uhplc-ms指紋圖譜。

圖6扣減后所得香附aghi的uhplc-ms指紋圖譜。

圖7峰1的hr-ms圖譜及分子結(jié)構(gòu)。

圖8峰2的hr-ms圖譜及分子結(jié)構(gòu)。

圖9峰3的hr-ms圖譜及分子結(jié)構(gòu)。

圖10峰4的hr-ms圖譜及分子結(jié)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1。

一、固定化酶的合成。

將0.2g氨丙基硅膠（10m,120,sepaxtechnologies,inc）加入到2.5％的10ml戊二醛水溶液中，室溫磁力攪拌3h，可見反應(yīng)液由黃色變成紅色，由于氨基與醛基形成c=n的席夫堿結(jié)構(gòu)造成的；隨后去離子水充分洗滌除去過量的戊二醛，去離子水中保存，得到醛基硅膠（即空白基質(zhì)）。

將0.1g醛基硅膠加入到2.5ml濃度為5.25mg/ml的agh緩沖液中（緩沖液為：50mmna2hpo4溶液，ph7.0），室溫振蕩反應(yīng)1h，再于4℃冰箱中反應(yīng)24h；反應(yīng)結(jié)束后，用緩沖液（50mmna2hpo4緩沖液，ph7.0）、含0.2mkcl的緩沖液、h2o依次洗滌，除去未反應(yīng)的酶，最后在緩沖液中保存，得agh鍵和硅膠，即固定化酶。

固定化酶的制備過程原理，如圖1所示。

二、香附藥材提取液的制備。

取香附藥材粉末0.2g，過80目篩；用20ml80%甲醇水溶液在室溫下超聲提取30min；提取液過濾，凍干，再用10ml親和緩沖液（親和緩沖液為：67mmkh2po4（含5%甲醇），ph6.8）復(fù)溶，然后0.45m微孔濾膜過濾，即得。

三、固定化酶的親和吸附與解吸。

將400l所得的香附藥材提取液與0.1g固定化酶在37°c下震蕩孵育吸附20min；孵育吸附結(jié)束后，800rpm離心處理5min，分離得到固定化酶，用400l親和緩沖液清洗四次，以除去未親和結(jié)合的小分子化合物；隨后加入200l親和洗脫液（親和洗脫液為：2mol/lnacl溶液（20%甲醇水溶液配制））進(jìn)行解吸，37°c下振蕩10min，收集上清液，即為與固定化酶具有強(qiáng)吸附作用的化合物（aghi候選分子）溶液。

將上述過程中的固定化酶替換為空白基質(zhì)，即可得到只在基質(zhì)上有非特異性吸附的假陽性分子溶液。

固定化酶的親和吸附與解吸過程原理，如圖2所示。

四、香附aghi的結(jié)構(gòu)確定。

香附aghi的結(jié)構(gòu)確定過程的原理，如圖3所示。

將所得的aghi候選分子溶液和假陽性分子溶液，分別在氮吹儀上濃縮至10l（40℃），隨后分別注入uhplc-ms（agilent1290infinitylc-6520accurate-massqtof-ms）進(jìn)行指紋圖譜分析，見圖4和圖5；將二者所得指紋圖譜相扣減，即可得到除去假陽性結(jié)果（sugetriol，峰4）的香附aghi的指紋圖譜，見圖6；進(jìn)一步通過hr-ms技術(shù)，即可初步確定香附aghi的結(jié)構(gòu)，分別為以下三種化合物：scirpusinsb（峰1）、cyperusphenola（峰2）、mesocyperusphenola（峰3），峰1-峰4的hr-ms圖譜及分子結(jié)構(gòu)見圖7-10，該結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步通過與其對照品的出峰時(shí)間和hr-ms圖譜比對得以證實(shí)。

三種香附aghi對照品的制備方法可參見文獻(xiàn)（中國專利：cn104910172a）。

五、香附aghi的活性驗(yàn)證。

對三種香附aghi（scirpusinsb、cyperusphenola、mesocyperusphenola）和陽性對照（阿卡波糖）進(jìn)行常規(guī)的agh抑制活性實(shí)驗(yàn)，以證明篩選結(jié)果的可靠性。

采用對硝基酚--d-吡喃葡萄糖苷（pnpg）為底物的酶-抑制藥篩選模型進(jìn)行活性篩選。

三種香附aghi的分離純化：純化方法參見文獻(xiàn)（中國專利：cn104910172a）。

樣品的配制：將0.48ml磷酸緩沖液（67mm，ph6.8），0.02ml谷胱甘肽（3mm），0.05mlpnpg（10mm）和0.02ml待測樣品溶液（三種香附aghi（scirpusinsb、cyperusphenola、mesocyperusphenola）和阿卡波糖）混合均勻后，于37℃孵育10min，然后加入0.02mlα-葡萄糖苷酶（0.3u/ml），混合均勻后，于37℃孵育20min，所有的試劑均用磷酸緩沖液（67mm，ph6.8）配制；用2.4ml碳酸鈉水溶液（100mm）終止酶解反應(yīng)，隨即于410nm波長下檢測吸光度（as）。

對照樣品的配制方法與上述樣品的配制方法基本相同，僅將待測樣品溶液替換為等量的磷酸緩沖液（67mm，ph6.8）。

空白樣品和空白對照的配制方法也分別與上述樣品和對照樣品的配制方法基本相同，僅分別將樣品和對照樣品中的-葡萄糖苷酶溶液替換為磷酸緩沖液即可。

樣品抑制活性（%）計(jì)算公式為：抑制率（%）=100%×[(as-asb)/(ac-acb)]。

其中，as、asb、ac及acb分別代表樣品、空白樣品、對照樣品和空白對照組的吸光度；所有數(shù)據(jù)重復(fù)測定三次；4個(gè)樣品在不同濃度點(diǎn)的具體抑制率，見表1；三種香附aghi及陽性對照（阿卡波糖）的agh抑制活性，見表2。

表1三種香附aghi及陽性對照的agh抑制率。

表2三種香附aghi及陽性對照的agh抑制活性。

由表2結(jié)果可知，本發(fā)明所篩選得到的三種香附aghi（scirpusinsb、cyperusphenola、mesocyperusphenola）均為agh的強(qiáng)效抑制劑，進(jìn)一步證明和驗(yàn)證了本篩選方法的可靠性。