本發(fā)明屬于化學(xué)品毒性檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試的參照濃度分析方法。

背景技術(shù)：

建立聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試技術(shù)極為復(fù)雜，首先，要解決測(cè)試條件、測(cè)試藻、藻溫測(cè)試方法、藻響應(yīng)藥品的評(píng)價(jià)方法；其次，要解決聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法；最后，要解決藥液配制的標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)處理軟件等問題。由于二元聯(lián)合作用分析是多元聯(lián)合作用分析的基礎(chǔ)，因此，所建立的聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試方法是否可行，首先要通過二元聯(lián)合作用的測(cè)試分析進(jìn)行檢驗(yàn)。目前，國(guó)內(nèi)外用微生物法測(cè)試化學(xué)品聯(lián)合作用的研究主要集中在發(fā)光細(xì)菌上，如利用發(fā)光細(xì)菌研究農(nóng)藥的毒性、農(nóng)藥混合物對(duì)綠藻和發(fā)光細(xì)菌的聯(lián)合毒性、利用發(fā)光細(xì)菌法測(cè)定海水中鎘與氨三乙酸的毒性、六種除草劑對(duì)發(fā)光細(xì)菌的短期和長(zhǎng)期抑制毒性的比較、六種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)發(fā)光細(xì)菌的混合毒性預(yù)測(cè)，用藻紅外測(cè)試化學(xué)品毒性的研究有藻紅外輻射測(cè)試環(huán)境重金屬急性毒性、藻紅外輻射測(cè)試環(huán)境農(nóng)藥殘留急性毒性研究、急性毒性藻紅外測(cè)試中敏感藻的確定方法、有機(jī)毒害物急性毒性與藻紅外輻射變化研究、急性毒性藻紅外測(cè)試中聯(lián)合作用及藻類慢性毒性實(shí)驗(yàn)、藻紅外測(cè)試多元有機(jī)毒物聯(lián)合毒性研究，關(guān)于化學(xué)品聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試方法的研究尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試的參照濃度分析方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試的參照濃度分析方法，包括以下步驟：

(1)藻響應(yīng)藥品濃度梯度的分析

①藻溫測(cè)試

選擇滇池銅綠微囊藻為實(shí)驗(yàn)藻，其藻密度≥3.16×10⁹個(gè)/L；

藻溫測(cè)試過程：空白組3重復(fù)，對(duì)照組3重復(fù)，加藥組3重復(fù)，其中加藥組滴加的藥液按遞減的同藥倍半濃度梯度法，依次設(shè)計(jì)為N、N/2、N/4、N/8、N/16、N/32六組不同濃度，先在每個(gè)測(cè)試杯中分別加入5mL藻液，加完后測(cè)試每個(gè)測(cè)試杯的藻溫；

然后進(jìn)行以下加藥測(cè)試：a、蒸餾水毒性測(cè)試時(shí)，用滴液管分別滴加蒸餾水0.05mL于加藥組和對(duì)照組的測(cè)試杯中，待藻溫穩(wěn)定時(shí)測(cè)試每個(gè)測(cè)試杯的藻溫；b、待測(cè)藥品的毒性測(cè)試時(shí)，用滴液管滴加0.05mL蒸餾水于對(duì)照組的測(cè)試杯中，用滴液管分別滴加0.05mL相應(yīng)濃度的待測(cè)藥液于加藥組的測(cè)試杯中，滴加完后測(cè)試每個(gè)測(cè)試杯的藻溫；

②藻溫處理

藻響應(yīng)溫差計(jì)算方法為：ΔT＝∣ΔT_j∣―∣ΔT_d∣，ΔT＞0

加藥組藻溫差計(jì)算方法為：ΔT_j＝(T_j-ti-T_j-t0)-(T_k-ti-T_k-t0)

對(duì)照組藻溫差計(jì)算方法為：ΔT_d＝(T_d-ti-T_d-t0)-(T_k-ti-T_k-t0)

式中：T_j-ti—加藥后加藥組的藻溫；T_j-t0—加藥前加藥組的藻溫；T_k-ti—加藥后空白組的藻溫；T_k-t0—加藥前空白組的藻溫；T_d-ti—加水后對(duì)照組的藻溫；T_d-t0—加水前對(duì)照組的藻溫；j—加藥組，滴加藥液；d—對(duì)照組，滴加蒸餾水；k—空白組，不滴加藥液或蒸餾水；t_i—測(cè)溫遍數(shù)，i＝0,為加藥前的測(cè)溫；i＝1,2…n,為加藥后第1,2…n遍測(cè)溫；

③三指標(biāo)法評(píng)價(jià)藻對(duì)藥液的響應(yīng)

當(dāng)藻溫差數(shù)據(jù)同時(shí)滿足下面三個(gè)指標(biāo)時(shí)，表示藻對(duì)藥液有響應(yīng)：

指標(biāo)①—最大藻溫差比較值，︱ΔT_j-max︱＞︱ΔT_d-max︱；

指標(biāo)②—平均藻溫差比較值，∣Δ〒_j∣＞∣Δ〒_d∣；

指標(biāo)③—藻響應(yīng)率(ψ)，∣ΔT_j∣＞∣ΔT_d∣的出現(xiàn)次數(shù)≥6；

其中：ΔT_j-max—加藥組的最大藻溫差，ΔT_d-max—對(duì)照組的最大藻溫差，Δ〒_j—加藥組的平均藻溫差，Δ〒_d—對(duì)照組的平均藻溫差；

通過三指標(biāo)法找出藻響應(yīng)藥品的濃度范圍，如果沒有找到藻響應(yīng)藥品的濃度范圍，需重新設(shè)計(jì)藥液濃度梯度再測(cè)試；

(2)藻響應(yīng)藥品的敏感濃度分析

①同藥倍半關(guān)系濃度的初步分析

通過步驟(1)中的步驟②和③的方法分析各濃度的藻響應(yīng)溫差，然后找出用于聯(lián)合作用指數(shù)分析的聯(lián)合藥液的最大藻響應(yīng)溫差、單藥液的藻響應(yīng)溫差，進(jìn)行聯(lián)合作用指數(shù)θ計(jì)算，根據(jù)聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法分析同藥倍半濃度的相加作用類型，其中，聯(lián)合作用指數(shù)θ的計(jì)算式為：

式中：θ—聯(lián)合作用指數(shù)；△T_ABmax—A、B藥聯(lián)合時(shí)產(chǎn)生的藻最大響應(yīng)溫差；△T_A—△T_ABmax出現(xiàn)的測(cè)溫遍數(shù)時(shí)，A藥的藻響應(yīng)溫差；△T_B—△T_ABmax出現(xiàn)的測(cè)溫遍數(shù)時(shí)，B藥的藻響應(yīng)溫差；

聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法為：

θ＞1+f 協(xié)同作用

1-f≤θ≤1+f 相加作用

當(dāng)θ＜1-f時(shí)：

△T_ABmax＜max(△T_A、△T_B) 拮抗作用

△T_ABmax＞max(△T_A、△T_B) 獨(dú)立作用

式中：f＝0.42；

其中，同藥倍半關(guān)系濃度為同藥的倍濃度與半濃度的聯(lián)合作用為相加作用時(shí)的同藥倍半濃度；

②同藥倍半關(guān)系濃度的再現(xiàn)性分析

如果上一步聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法分析的同藥倍半濃度為相加作用，則進(jìn)行同藥倍半關(guān)系濃度的再現(xiàn)性分析，同藥倍半關(guān)系濃度進(jìn)行2次再現(xiàn)性分析，如有1次測(cè)試結(jié)果為相加作用，則同藥倍半關(guān)系濃度通過再現(xiàn)性分析，通過再現(xiàn)性分析的同藥倍半關(guān)系濃度即為藻響應(yīng)藥品的敏感濃度；

(3)參照濃度的確定

比較兩種藥品的同藥倍半關(guān)系濃度，找出同藥倍半關(guān)系濃度小的藥品，以其倍濃度、半濃度分別作為測(cè)試用的聯(lián)合藥液、單藥液配制的參照濃度。

作為優(yōu)選，測(cè)試藻溫時(shí)，每次每個(gè)測(cè)試杯連測(cè)3個(gè)藻溫，3個(gè)藻溫的平均值即為測(cè)試杯的藻溫。

作為優(yōu)選，測(cè)試藻溫時(shí)，加藥前測(cè)溫1遍，加藥后測(cè)溫10遍，其中，三個(gè)重復(fù)測(cè)溫完成即為測(cè)溫1遍，前一遍測(cè)溫完成后，按相同的測(cè)溫順序進(jìn)行下一遍測(cè)溫。

作為優(yōu)選，所述待測(cè)藥品為重金屬、農(nóng)藥、有機(jī)藥品、抗生素。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明通過改進(jìn)的藻溫測(cè)試方法和三指標(biāo)評(píng)價(jià)方法能夠保證藻響應(yīng)溫差和藻響應(yīng)藥品評(píng)價(jià)結(jié)果的質(zhì)量，提出的參照濃度分析方法和二元聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法能夠有效控制聯(lián)合作用分析結(jié)果的質(zhì)量，本發(fā)明測(cè)試結(jié)果具有較好的再現(xiàn)性、再現(xiàn)性的重現(xiàn)率和重現(xiàn)性、重現(xiàn)性的重現(xiàn)率；

2、藻響應(yīng)的有毒有害物都存在敏感濃度，用參照濃度分析方法可以分析出藻響應(yīng)有毒有害無(wú)的參照濃度，因而本發(fā)明方法可以用于測(cè)試重金屬、農(nóng)藥、有機(jī)藥品、抗生素等的二元聯(lián)合作用。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中倍半濃度梯度的測(cè)試杯的布局圖；

圖2為實(shí)施例1中二元聯(lián)合作用的測(cè)試杯布局圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明。

本發(fā)明所采用的原料和設(shè)備若非特指，均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的，實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實(shí)施例1

本實(shí)施例以重金屬為例對(duì)二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試的參照濃度分析方法以及將該方法用于重金屬二元聯(lián)合作用的測(cè)試進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

1試驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用藻：滇池銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa in Dianchi Lake in china)及其培養(yǎng)基配方由中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所提供。該藻具有春化作用，為滇池水華藻種，培養(yǎng)前用10～14℃低溫處理10，培養(yǎng)的藻生長(zhǎng)快、飽和密度高，可早些獲得測(cè)試需要的藻液，本實(shí)施例中測(cè)試用的藻液密度均≥3.16×10⁹個(gè)/L。

測(cè)試藥品：CuSO₄·5H₂O、FeCl₃·6H₂O、MnSO₄·H₂O、AlCl₃·6H₂O、CrCl₃·6H₂O、HgSO₄、Cd(NO₃)₃·H₂O、Pb(NO₃)₂、ZnCl₂，均為國(guó)產(chǎn)分析純，藥液濃度為重金屬濃度(g·L^-1)，藥液均為現(xiàn)測(cè)現(xiàn)配。

儀器設(shè)備：ST60便攜式紅外測(cè)溫儀(靈敏度0.1℃)；HETTICH-EBA離心機(jī)；LRH-250A生化培養(yǎng)箱(靈敏度±0.2℃)；MOTICBA200數(shù)碼顯微鏡；DR/4000U分光光度計(jì)。

測(cè)試杯：直徑4cm、高3cm、厚0.1～0.2cm的透明絕熱塑料容器。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1藻溫測(cè)試方法

藻溫測(cè)試在室內(nèi)條件下進(jìn)行，采用散射日光或燈光采光。實(shí)驗(yàn)的藻液用量為5ml/杯，藻密度≥3.16×10⁹個(gè)/L；測(cè)試杯加藻液前，藻液充分搖均；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)藻增長(zhǎng)率≤0時(shí)，藻液不再用于實(shí)驗(yàn)；測(cè)試一種藥物的聯(lián)合作用時(shí)，使用同一批培養(yǎng)的藻液，滴加藥液前，藥液充分搖勻后。

本實(shí)施例測(cè)試杯布局分為2種，具體如圖1和圖2所示，在每個(gè)測(cè)試杯中分布加入5mL藻液，加完后進(jìn)行加藥前測(cè)溫記錄，每次每杯連測(cè)3個(gè)藻溫。然后，滴加藥液，蒸餾水毒性測(cè)試時(shí)，用滴液管分別滴加蒸餾水1滴(約0.05ml)于加藥組、對(duì)照組的測(cè)試杯中，重金屬毒性測(cè)試時(shí)，用滴液管滴加藥液1滴于加藥組的測(cè)試杯中，用滴液管滴加蒸餾水1滴于對(duì)照組的測(cè)試杯中，立即進(jìn)行加藥后的測(cè)溫記錄，每次每杯連測(cè)3個(gè)藻溫。測(cè)溫時(shí)，紅外測(cè)溫儀頭部距離藻液正上方10～15cm，指示紅色光點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)藻液面中心時(shí)測(cè)溫。每杯每次連測(cè)3個(gè)藻溫，用于計(jì)算平均值。測(cè)溫順序：按如圖1和圖2所示的布局從上到下，從左到右。測(cè)溫遍數(shù)：三個(gè)重復(fù)組測(cè)溫完時(shí)即為測(cè)溫1遍。藥液滴入藻液后到藻產(chǎn)生響應(yīng)有一個(gè)過程，藻對(duì)不同藥液的響應(yīng)過程不同，加藥前測(cè)溫1遍，加藥后測(cè)溫10遍。前一遍測(cè)溫完后接著下一遍測(cè)溫。

1.3藻溫處理

1.3.1藻溫處理方法：

T＝(T_n1+T_n2+T_n3)÷3 (1)

T_ni＝(T_b1+T_b2+T_b3)÷3 (2)

T_bi＝(T₁+T₂+T₃)÷3 (3)

(1)、(2)、(3)中：T—每遍測(cè)溫的處理藻溫；T_n1、T_n2、T_n3—分別為重復(fù)一、二、三的平均藻溫；T_ni—重復(fù)組的平均藻溫，i＝1,2,3；T_bi—每個(gè)測(cè)試杯的平均藻溫,i＝1,2,3；T_b1、T_b2、T_b3—分別為空白、對(duì)照、加藥的測(cè)試杯的平均藻溫；T_i—每個(gè)測(cè)試杯連續(xù)測(cè)試的藻溫(3個(gè)藻溫)，i＝1,2,3。

1.3.2、藻溫差計(jì)算方法

藻響應(yīng)溫差計(jì)算：藻響應(yīng)溫差是指加藥組藻溫差的絕對(duì)值與對(duì)照組藻溫差的絕對(duì)值的差值，該差值大于零，其計(jì)算方法為：

ΔT＝∣ΔT_j∣―∣ΔT_d∣，ΔT＞0

加藥組藻溫差計(jì)算：ΔT_j＝(T_j-ti-T_j-t0)-(T_k-ti-T_k-t0)

對(duì)照組藻溫差計(jì)算：ΔT_d＝(T_d-ti-T_d-t0)-(T_k-ti-T_k-t0)

式中：T_j-ti—加藥后加藥組的藻溫；T_j-t0—加藥前加藥組的藻溫；T_k-ti—加藥后空白組的藻溫；T_k-t0—加藥前空白組的藻溫；T_d-ti—加水后對(duì)照組的藻溫；T_d-t0—加水前對(duì)照組的藻溫；j—加藥組，滴加藥液；d—對(duì)照組，滴加蒸餾水；k—空白組，不滴加藥液或蒸餾水；t_i—測(cè)溫遍數(shù)，i＝0,為加藥前的測(cè)溫；i＝1,2…n,為加藥后第1,2…n遍測(cè)溫。

1.3.3、藻對(duì)藥液響應(yīng)的三指標(biāo)評(píng)價(jià)法

當(dāng)藻溫差數(shù)據(jù)同時(shí)滿足下面三個(gè)指標(biāo)時(shí)，表示藻對(duì)藥液有響應(yīng)：

指標(biāo)①—最大藻溫差比較值，︱ΔT_j-max︱＞︱ΔT_d-max︱；

指標(biāo)②—平均藻溫差比較值，∣Δ〒_j∣＞∣Δ〒_d∣；

指標(biāo)③—藻響應(yīng)率(ψ)，∣ΔT_j∣＞∣ΔT_d∣的出現(xiàn)次數(shù)≥6；

其中：ΔT_j-max—加藥組的最大藻溫差，ΔT_d-max—對(duì)照組的最大藻溫差，Δ〒_j—加藥組的平均藻溫差，Δ〒_d—對(duì)照組的平均藻溫差。

1.3.4首測(cè)結(jié)果的再現(xiàn)性、最終測(cè)試結(jié)果的重現(xiàn)性

首測(cè)結(jié)果的再現(xiàn)性用于分析第一次測(cè)試結(jié)果的可信性，最終測(cè)試結(jié)果的重現(xiàn)性用于分析最終測(cè)試結(jié)果的可靠性。

首測(cè)結(jié)果的再現(xiàn)性＝(與首測(cè)結(jié)果相同的結(jié)果數(shù)÷實(shí)驗(yàn)數(shù))×100％

再現(xiàn)性的出現(xiàn)率＝(具有再現(xiàn)性的結(jié)果數(shù)÷總結(jié)果數(shù))×100％

最終測(cè)試結(jié)果的重現(xiàn)性＝(相同結(jié)果數(shù)÷實(shí)驗(yàn)數(shù))×100％

重現(xiàn)性的出現(xiàn)率＝(具有重現(xiàn)性的結(jié)果數(shù)÷總結(jié)果數(shù))×100％

1.3.5聯(lián)合作用最終測(cè)試結(jié)果的確認(rèn)

在3次相同測(cè)試中，具有重現(xiàn)性的結(jié)果即為聯(lián)合作用最終測(cè)試結(jié)果。

1.4聯(lián)合作用的評(píng)價(jià)

1.4.1聯(lián)合作用指數(shù)偏差法

二元聯(lián)合作用采用聯(lián)合作用指數(shù)偏差法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

①聯(lián)合作用指數(shù)(θ)的計(jì)算式：

式中：θ—聯(lián)合作用指數(shù)；△T_ABmax—A、B藥聯(lián)合時(shí)產(chǎn)生的藻最大響應(yīng)溫差；△T_A—△T_ABmax出現(xiàn)的測(cè)溫遍數(shù)時(shí)，A藥的藻響應(yīng)溫差；△T_B—△T_ABmax出現(xiàn)的測(cè)溫遍數(shù)時(shí)，B藥的藻響應(yīng)溫差。

②聯(lián)合作用偏差(f)

聯(lián)合作用偏差f是聯(lián)合作用指數(shù)的波動(dòng)值，f＝0.42(為修正后的數(shù)值)。

1.4.2評(píng)價(jià)方法：

θ＞1+f 協(xié)同作用

1-f≤θ≤1+f 相加作用

當(dāng)θ＜1-f：

△T_ABmax＜max(△T_A、△T_B) 拮抗作用

△T_ABmax＞max(△T_A、△T_B) 獨(dú)立作用

1.4.3用于聯(lián)合作用指數(shù)分析的藻響應(yīng)溫差

①聯(lián)合藥液的藻響應(yīng)溫差確定：藻對(duì)聯(lián)合藥液的藻響應(yīng)必須通過三指標(biāo)法，然后，在聯(lián)合藥液的10遍測(cè)溫分析結(jié)果中，選擇最大的藻響應(yīng)溫差(△T_ABmax)用于聯(lián)合作用指數(shù)θ分析。

②單藥藥液的藻響應(yīng)溫差確定：先找到①中最大藻響應(yīng)溫差(△T_ABmax)所在的測(cè)溫遍數(shù)，該測(cè)溫遍數(shù)時(shí)單藥的藻響應(yīng)溫差(△T_A、△T_B)用于聯(lián)合作用指數(shù)θ分析。單藥的藻響應(yīng)溫差小于或等于0時(shí)，以0計(jì)。當(dāng)△T_A＝0、△T_B＝0同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，需要重新測(cè)試藻溫。

1.5聯(lián)合作用測(cè)試

測(cè)試一次兩個(gè)藥品的聯(lián)合作用應(yīng)使用同一批培養(yǎng)的藻液。

測(cè)試步驟為參照濃度分析→聯(lián)合作用測(cè)試→測(cè)試結(jié)果的重現(xiàn)性分析。

1.5.1參照濃度的分析

參照濃度是指聯(lián)合作用測(cè)試時(shí)藥液濃度的配制標(biāo)準(zhǔn)，它是聯(lián)合作用測(cè)試的關(guān)鍵一步。

參照濃度確定步驟：藻響應(yīng)藥品濃度梯度分析→藻響應(yīng)藥品的敏感濃度分析→參照濃度分析。

①藻響應(yīng)藥品濃度梯度的分析

Ⅰ藥液(重金屬以離子計(jì))濃度梯度設(shè)計(jì)為：N、N/2、N/4、N/8、N/16、N/32(N—g·L-¹)，即遞減的同藥倍半濃度梯度法。

Ⅱ測(cè)試杯布局：見圖1。

Ⅲ藻溫測(cè)試：見1.2.1。

Ⅳ測(cè)試藻溫分析：

將測(cè)試的藻溫，用1.3.2、1.3.3方法分析藻響應(yīng)藥品濃度范圍。

藻響應(yīng)藥品濃度范圍確定：根據(jù)上面的分析結(jié)果，找出藻響應(yīng)藥品濃度范圍，如果沒有找到藻響應(yīng)藥品濃度范圍，重新設(shè)計(jì)藥液濃度梯度再測(cè)試。

②藻響應(yīng)藥品的敏感濃度分析

藻響應(yīng)藥品的敏感濃度(簡(jiǎn)稱敏感濃度)是指藥液濃度增減引起藻響應(yīng)溫差增減的藥品濃度。

Ⅰ同藥倍半關(guān)系濃度的初步分析

同藥倍半關(guān)系濃度是指引起藻響應(yīng)溫差倍半變化的同一種藥的倍半濃度。因此，可用同藥倍半關(guān)系濃度分析敏感濃度：將同藥一分為二，2個(gè)半份藥物所產(chǎn)生的藻響應(yīng)溫差之和等于整藥產(chǎn)生的藻響應(yīng)溫差，也即同藥的二元聯(lián)合作用為相加作用。如果同藥的倍濃度與半濃度的聯(lián)合作用為相加作用，這時(shí)的同藥倍半濃度就是同藥倍半關(guān)系濃度。同藥倍半關(guān)系濃度是相對(duì)的。

將測(cè)試的各濃度的藻溫，用1.3.2、1.3.3方法分析各濃度的藻響應(yīng)溫差，再用1.4.3的方法，找出用于聯(lián)合作用指數(shù)分析的聯(lián)合藥液的最大藻響應(yīng)溫差、單藥藥液的藻響應(yīng)溫差，進(jìn)行聯(lián)合作用指數(shù)θ計(jì)算(由于只有1個(gè)單藥的藻響應(yīng)溫差，計(jì)算時(shí)，單藥的藻響應(yīng)溫差需要乘以2)，根據(jù)聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法(1.4.2)分析同藥倍半關(guān)系濃度的相加作用。

如果分析結(jié)果為相加作用，即可進(jìn)行下一步分析。

Ⅱ同藥倍半關(guān)系濃度的再現(xiàn)性分析

初步分析的同藥倍半關(guān)系濃度進(jìn)行2次再現(xiàn)性測(cè)試，如有1次測(cè)試結(jié)果為相加作用，即為初步分析的同藥倍半關(guān)系濃度通過再現(xiàn)性分析。通過再現(xiàn)性分析的同藥倍半關(guān)系濃度就是藻響應(yīng)藥品的敏感濃度，此時(shí)，可進(jìn)行聯(lián)合作用測(cè)試時(shí)藥液配制的參照濃度分析。

a.測(cè)試杯布局：見圖2。

b.藻溫測(cè)試：見1.2.1。

c.相加作用分析

將測(cè)得的藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析各濃度的藻響應(yīng)溫差，再用1.4.3的方法，找出用于聯(lián)合作用指數(shù)分析的聯(lián)合藥液的最大藻響應(yīng)溫差、單藥藥液的藻響應(yīng)溫差，進(jìn)行聯(lián)合作用指數(shù)θ計(jì)算，根據(jù)聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法(1.4.2)分析相加作用。

如果分析結(jié)果為相加作用，表明分析的同藥倍半關(guān)系濃度為藻響應(yīng)藥品的敏感濃度，即可進(jìn)行參照濃度分析。

③參照濃度的確定

a.原則：在聯(lián)合的兩種藥品中，以毒性大的藥品的同藥倍半關(guān)系濃度的倍濃度、半濃度分別作為聯(lián)合藥液、單藥液配制的參照濃度。聯(lián)合藥液[A+B]＝單藥液[A]+單藥液[B],其中，單藥液[A]＝單藥液[B]，在[A+B]中，[A]＝[B]。

b.方法：比較兩種藥品的同藥倍半關(guān)系濃度，找出同藥倍半關(guān)系濃度小的藥品(即毒性大的藥品)，以其倍濃度、半濃度分別作為測(cè)試用的聯(lián)合藥液、單藥液配制的參照濃度。

例子：測(cè)試的同藥倍半關(guān)系濃度(g·L^-1)：A為4:2，B藥為2:1，B藥的小于A藥的，即B藥毒性大于A藥，根據(jù)參照濃度確定原則，以B藥的同藥倍半關(guān)系濃度作為測(cè)試藥液配制的參照濃度，聯(lián)合藥液的參照濃度；單藥液的參照濃度＝2:1。

1.5.2聯(lián)合作用的分析

①藥液配制

按參照濃度確定的原則和方法配制測(cè)試藥液的濃度(1.5.1之③)。

②藻溫測(cè)試

a.測(cè)試杯布局：見圖2。

b.藻溫測(cè)試：見1.2.1。

③測(cè)試藻溫分析：

將測(cè)試的藻溫用1.3.2、1.3.3方法分析各濃度的藻響應(yīng)溫差，再用1.4.3的方法，找出用于聯(lián)合作用指數(shù)分析的聯(lián)合藥液的最大藻響應(yīng)溫差、單藥藥液的藻響應(yīng)溫差，進(jìn)行聯(lián)合作用指數(shù)θ計(jì)算，根據(jù)聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法(1.4.2)分析相加作用類型。

1.5.3測(cè)試結(jié)果的重現(xiàn)性分析

首次聯(lián)合作用測(cè)試完成后，再進(jìn)行2次相同測(cè)試，以有重現(xiàn)性的聯(lián)合作用類型作為最終測(cè)試結(jié)果。

2結(jié)果分析

聯(lián)合作用分析需要定量測(cè)出藥品參照濃度(敏感濃度)引起的藻響應(yīng)溫差，因此，測(cè)試聯(lián)合作用最重要的是藥液配制的標(biāo)準(zhǔn)，而參照濃度就是藥液配制的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)，沒有參照濃度便沒有可控的、可信的測(cè)試結(jié)果，參照濃度在聯(lián)合作用測(cè)試中非常重要。參照濃度分析方法就是用來(lái)分析參照濃度的，因此，它是聯(lián)合作用測(cè)試的關(guān)鍵技術(shù)。

2.1參照濃度分析結(jié)果

2.1.1藻響應(yīng)的重金屬濃度梯度

由表1可知，藻響應(yīng)的重金屬濃度(g·L^-1)梯度是：Cu(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅲ)和Pb(Ⅱ)為8、4、2、1、0.5、0.25；Fe(Ⅲ)為8、4、2、1；Al(Ⅲ)為8、1、0.5、0.25；Cr(Ⅲ)為8、4、2、0.25；Zn(Ⅱ)為8、4、2、0.5、0.25。

表1藻響應(yīng)重金屬的測(cè)試結(jié)果

2.1.2初步分析的同藥(重金屬)倍半關(guān)系濃度

由表2可知，初步分析的同藥倍半關(guān)系濃度(g·L^-1)是，Cd(Ⅲ)、Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)、Pb(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)為2:1，Al(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)為1:0.5，Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)為0.5:0.25。

表2同藥倍半關(guān)系濃度初步分析結(jié)果

2.1.3同藥倍半關(guān)系濃度的驗(yàn)證分析

由表3可知，同藥倍半關(guān)系濃度初步分析結(jié)果的再現(xiàn)性測(cè)試中，8種首測(cè)結(jié)果為相加作用都具有再現(xiàn)性，首測(cè)結(jié)果相加作用的出現(xiàn)率為89％，表明首測(cè)結(jié)果的可信性高。1種首測(cè)結(jié)果為拮抗作用的沒有再現(xiàn)性，但最終結(jié)果相加作用具有重現(xiàn)性。

通過再現(xiàn)性分析的同藥倍半關(guān)系濃度(g·L^-1)是，Cd(Ⅲ)、Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)、Pb(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)均為2:1；Al(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)為1:0.5，Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)為0.5:0.25。根據(jù)敏感濃度定義，這些重金屬倍半關(guān)系濃度就是藻響應(yīng)的敏感濃度。

表3同藥倍半關(guān)系濃度的再現(xiàn)性分析結(jié)果

2.1.4藥液配制的參照濃度

由表4可知：

①聯(lián)合藥液參照濃度:單藥液參照濃度＝0.5:0.25(g·L^-1)的二元組合是：Cu²⁺+Fe³⁺、Cu²⁺+Mn²⁺、Cu²⁺+Hg²⁺、Cu²⁺+Cd²⁺、Cu²⁺+Pb²⁺、Cu²⁺+Zn²⁺、Fe³⁺+Hg²⁺、Mn²⁺+Hg²⁺、Al³⁺+Hg²⁺、Cr³⁺+Hg²⁺、Cu²⁺+Al³⁺、Cu²⁺+Cr³⁺、Hg²⁺+Cd²⁺、Hg²⁺+Pb²⁺、Hg²⁺+Zn²⁺。

②聯(lián)合藥液參照濃度:單藥液參照濃度＝2.0:1.0(g·L^-1)的二元組合是：Cr³⁺+Cd²⁺、Cd²⁺+Zn²⁺、Pb²⁺+Zn²⁺、Cr³⁺+Pb²⁺、Fe³⁺+Cd²⁺、Fe³⁺+Cr³⁺、Fe³⁺+Pb²⁺、Fe³⁺+Zn²⁺、Cr³⁺+Zn²⁺、Cd²⁺+Pb²⁺。

③聯(lián)合藥液參照濃度:單藥液參照濃度＝1.0:0.5(g·L^-1)的二元組合是：Fe³⁺+Mn²⁺、Fe³⁺+Al³⁺、Mn²⁺+Cd²⁺、Al³⁺+Cr³⁺、Al³⁺+Cd²⁺、Al³⁺+Pb²⁺、Al³⁺+Zn²⁺、Mn²⁺+Al³⁺、Mn²⁺+Cr³⁺、Mn²⁺+Pb²⁺、Mn²⁺+Zn²⁺。

表4重金屬二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試分析結(jié)果

2.2同藥倍半關(guān)系濃度的再現(xiàn)性和重現(xiàn)性

由表3可知，在9種重金屬的同藥倍半關(guān)系濃度分析中：8種重金屬的首測(cè)結(jié)果為相加作用，其中6種首測(cè)結(jié)果的再現(xiàn)性為100％，另2種為再現(xiàn)性為50％，全部首測(cè)結(jié)果再現(xiàn)性的出現(xiàn)率為89％；9種相加作用結(jié)果中，6種的重現(xiàn)性為100％，3種的重現(xiàn)性為67％；9種相加作用結(jié)果重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100％。分析表明，二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試方法的測(cè)試效果較好。

2.3測(cè)試結(jié)果的多樣性、再現(xiàn)性、重現(xiàn)性

由表4可知，在36組的聯(lián)合作用測(cè)試結(jié)果中，出現(xiàn)拮抗、相加、協(xié)同三種聯(lián)合作用類型，測(cè)試結(jié)果出現(xiàn)多樣性；14組拮抗作用中單組的再現(xiàn)性為50～100％、多組的再現(xiàn)性的出現(xiàn)率為93％，單組的重現(xiàn)性為67～100％、多組的重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100％，21組相加作用中單組的再現(xiàn)性為50～100％、多組的再現(xiàn)性的出現(xiàn)率為86％，單組的重現(xiàn)性為67～100％、多組的重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100％，1組協(xié)同作用的重現(xiàn)性為100％、重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100％；36組聯(lián)合作用測(cè)試結(jié)果的再現(xiàn)性為50～100％、再現(xiàn)性的出現(xiàn)率為86％，重現(xiàn)性為67～100％、重現(xiàn)性的出現(xiàn)率為100％。分析表明，二元聯(lián)合作用藻紅外測(cè)試方法的測(cè)試效果良好。

在聯(lián)合作用測(cè)試結(jié)果中出現(xiàn)了相加、拮抗、協(xié)同三種聯(lián)合作用類型，占4種聯(lián)合作用的75％，表現(xiàn)出一定的多樣性。當(dāng)有多種聯(lián)合作用類型出現(xiàn)時(shí)，并且每一種類型具有較好的再現(xiàn)性、重現(xiàn)性，表明聯(lián)合作用評(píng)價(jià)法的f值＝0.42是恰當(dāng)?shù)?。?dāng)測(cè)試結(jié)果沒有多樣性時(shí)，表明f值過小或過大，f值過大或過小都是不好的。

通過以上的測(cè)試結(jié)果表明二元聯(lián)合作用測(cè)試結(jié)果具有較好的多樣性、再現(xiàn)性、重現(xiàn)性，這是由于本發(fā)明采用的測(cè)試條件、藻溫測(cè)試方法、藻響應(yīng)溫差評(píng)價(jià)方法能夠保證藻響應(yīng)溫差的質(zhì)量，參照濃度分析方法、聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法等能夠控制聯(lián)合作用測(cè)試結(jié)果的質(zhì)量，參照濃度作為藥液配制的標(biāo)準(zhǔn)是可行的，在聯(lián)合作用分析中不可或缺，藻紅外技術(shù)測(cè)試重金屬二元聯(lián)合作用是可行的。

最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。