本發(fā)明屬于色譜儀技術領域，具體涉及一種高溫全二維液相色譜裝置。

背景技術：

對于復雜組分的分析,僅使用一種色譜模式往往不能提供足夠的分辨率和系統(tǒng)峰容量,難以實現(xiàn)復雜樣品(如中藥提取物、蛋白質(zhì)組學樣品和環(huán)境污染物等)的完全分離，對樣品的定性和定量分成造成了極大的障礙，往往需要離線進行二次分離才能獲得較純的樣品。未實現(xiàn)完全分離的樣品，與后續(xù)質(zhì)譜聯(lián)用也存在樣品離子化效率低，加合物復雜的問題。因此，追求高效分離手段是分析科學的重要發(fā)展方向之一。根據(jù)正交分離的機理，二維液相色譜的靈活性在于能夠便捷地實現(xiàn)不同模式之間的偶聯(lián)。一維分離中反相(RP)、離子交換(IEX，包括陽離子交換和陰離子交換)、體積排阻(SEC)和正相色譜法(NP)等各種機理均可以用于構建二維液相色譜系統(tǒng)，提高分離的選擇性和峰容量。因為與ESI-MS的兼容性較好，RP一般用作第二維。以IEXxRP聯(lián)用較為成熟，因為第一維的流動相為水，不對第二維反相的分離產(chǎn)生影響，可以實現(xiàn)兩種分離機理的偶合，因而獲得了蛋白質(zhì)組學的青睞。但是，IEX柱效較低，因此IEXxRP二維系統(tǒng)的總體峰容量不高，而RPxRP具有非常高的峰容量，但兩維的流動相不匹配問題，使得該體系的進一步使用受到極大限制。流動相不匹配，即第一維的洗脫液經(jīng)過樣品管收集并轉(zhuǎn)移到第二維色譜柱之后，由于分離機理相同，第一維的洗脫液對第二維的分離產(chǎn)生不良影響。這種影響存在于NPxRP，RPxRP，以及HILICxRP等系統(tǒng)中，導致了這些系統(tǒng)的難以獲得實質(zhì)性的應用。

因此，有必要解決二維RPxRP液相中流動相不匹配的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高溫全二維液相色譜裝置及其使用方法，解決兩維溶劑不匹配問題。

本發(fā)明提供一種高溫全二維液相色譜裝置，第一高壓二元液相色譜泵、第二高壓二元液相色譜泵、第一色譜柱、第二色譜柱、柱溫箱、切換閥和檢測器，所述切換閥具有第一閥位、第二閥位、第三閥位、第四閥位、第五閥位、第六閥位、第七閥位和第八閥位，所述第一高壓二元液相色譜泵連接第一色譜柱的輸入端，所述第一色譜柱設置于所述柱溫箱內(nèi)，所述第一色譜柱的輸出端連接第一閥位，樣品管A的輸入端連接第二閥位，樣品管A的輸出端連接所述第三閥位，所述第四閥位連接廢液瓶，樣品管B的輸入端連接所述第七閥位，所述第八閥位連接所述第二高壓二元液相色譜泵，樣品管B的輸出端連接所述第五閥位，所述第六閥位連接所述第二色譜柱的輸入端，所述第二色譜柱的輸出端連接所述檢測器。

進一步的技術方案，所述高溫全二維液相色譜裝置還包括制冷模塊，所述制冷模塊設置于所述第一色譜柱與第一閥位之間的管路上。

進一步的技術方案，所述高溫全二維液相色譜裝置還包括預熱模塊，所述預熱模塊設置于所述第一高壓二元液相色譜泵和第一色譜柱之間的管路上。

進一步的技術方案，所述第一色譜柱為耐高溫的氧化鈦、氧化鋯、石墨化碳或聚合物色譜柱中的任意一種，所述第二色譜柱為硅膠基質(zhì)的C18色譜柱。

進一步的技術方案，所述切換閥為兩個六通閥連接或八通閥、或十通閥。

進一步的技術方案，所述切換閥還具有第九閥位和第十閥位，所述第一閥位、第二閥位、第九閥位、第四閥位、第七閥位、第八閥位、第三閥位、第十閥位、第六閥位和第五閥位按順時針方向排列。

進一步的技術方案，所述切換閥具有第一圓周和第二圓周，所述第一圓周和第二圓周的圓心相同，所述第一圓周的直徑大于所述第二圓周的直徑，所述第三閥位、第四閥位、第五閥位和第六閥位在第一圓周上按順時針方向排列，所述第二閥位、第八閥位、第七閥位和第一閥位在所述第二圓周上按順時針方向排列。

本發(fā)明還提供一種高溫全二維液相色譜裝置的使用方法，包括：

步驟一：第一高壓二元液相色譜泵輸送純水至第一色譜柱，對第一色譜柱上的樣品進行洗脫，柱溫箱控制第一色譜柱溫度，即溫度從20-40℃開始，以1-10℃/min的升溫的速率，逐漸升高色譜柱溫度至150-200℃，高溫洗脫第一色譜柱上的樣品；第一色譜柱上洗脫下來的餾分到達第一閥位，經(jīng)第二閥位到達樣品管A，餾分被收集到樣品管A中，多余的餾分或洗脫液到第三閥位，再到第四閥位，最后到達廢液瓶；與此同時，第二維的洗脫液從第二高壓二元液相色譜泵到達第八閥位，再到第七閥位，將樣品管B中收集的餾分沖洗出來，到第五閥位，再到第六閥位，再到第二色譜柱，餾分經(jīng)過第二色譜柱的分離，最后到達檢測器；

步驟二：經(jīng)過1min后，切換閥切換位置，從第一色譜柱洗脫下來的餾分到達第一閥位，經(jīng)第五閥位到達樣品管B，餾分被收集到樣品管B中，多余的餾分或洗脫液到第七閥位，再到第四閥位，最后到達廢液瓶；與此同時，第二維的洗脫液從第二高壓二元液相色譜泵到達第八閥位，再到第三閥位，將樣品管A中收集的餾分沖洗出來，再到第二閥位，再到第六閥位，再到第二色譜柱，餾分經(jīng)過第二色譜柱的分離，最后到達檢測器；

步驟三：以1min為間隔，交替運行步驟一和步驟二，實現(xiàn)連續(xù)全二維分析。

進一步的技術方案，步驟一中：第一色譜柱上洗脫下來的餾分到達第一閥位，經(jīng)第二閥位到達樣品管A，餾分被收集到樣品管A中，多余的餾分或洗脫液到第三閥位后再到第十閥位、再到第九閥位，再到第四閥位，最后到達廢液瓶；步驟二中：第二維的洗脫液從第二高壓二元液相色譜泵到達第八閥位，再到第三閥位，將樣品管A中收集的餾分沖洗出來，再到第二閥位，再到第九閥位、再到第十閥位、再到第六閥位，再到第二色譜柱，餾分經(jīng)過第二色譜柱的分離，最后到達檢測器。

進一步的技術方案，步驟二中：第七閥位與第五閥位的位置調(diào)換，第二閥位與第三閥位的位置調(diào)換。

本發(fā)明的優(yōu)點是：本發(fā)明開發(fā)了一種具有實用和環(huán)保性的高溫全二維液相色譜裝置。其具體優(yōu)點如下：

1、本發(fā)明的第一維引入程序升溫洗脫，而流動相保持等度洗脫，不會對第二維液相流動相造成影響；

2、通過柱溫的改變，可以直接調(diào)整二維液相色譜分離的正交性。隨著柱溫的升高，流動相粘度降低，溶質(zhì)在兩相間的遷移速度加快，可以極大地提高分析速度；

3、本發(fā)明在線操作，具有快速和連續(xù)操作的優(yōu)點；

4、第一維水相隨溫度升高極性降低，因此可以使用低比例有機相，符合綠色化學的要求。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述的一種高溫全二維液相色譜裝置的切換閥為十通閥時，在位置一時的連接圖；

圖2為本發(fā)明所述的一種高溫全二維液相色譜裝置的切換閥為十通閥時，在位置二時的連接圖；

圖3為本發(fā)明所述的一種高溫全二維液相色譜裝置的切換閥為八通閥時，在位置一時的連接圖；

圖4為本發(fā)明所述的一種高溫全二維液相色譜裝置的切換閥為八通閥時，在位置二時的連接圖；

圖5為本發(fā)明所述的一種高溫全二維液相色譜裝置的實施例1中分離肝素寡糖的效果圖。

其中：0為第二閥位、1為第一閥位、2為第五閥位、3為第六閥位、4為第十閥位、5為第三閥位、6為第八閥位、7為第七閥位、8為第四閥位、9為第九閥位、11為第一高壓二元液相色譜泵、12為第二高壓二元液相色譜泵、13為第一色譜柱、14為第二色譜柱、15為柱溫箱、16為切換閥、17為檢測器、18為廢液瓶、19為樣品管A、20為樣品管B、21為制冷模塊、22為預熱模塊。

具體實施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明的技術方案。但是本發(fā)明不限于所列出的實施例，還應包括在本發(fā)明所要求的權利范圍內(nèi)其他任何公知的改變。

此處所稱的“一個實施例”或“實施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個實現(xiàn)方式中的特定特征、結構或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的“在一個實施例中”并非均指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。

本發(fā)明提供一種高溫全二維液相色譜裝置，包括兩套高效液相色譜系統(tǒng)通過切換閥16連接，其中第一色譜柱13放置于能夠程序升溫的柱溫箱15內(nèi)，在第一色譜柱13前具有預熱模塊22，在第一色譜柱13后具有制冷模塊21。切換閥16上分別連接兩個樣品管，樣品管A19、樣品管B20，同時進行收集或進樣操作。通過第一維采用純水為流動相，以程序升溫進行洗脫，將第一維的洗脫液經(jīng)切換閥16和定量管收集并連續(xù)導入到第二維中分析，實現(xiàn)高溫全二維液相色譜的高效分離。其第一維為耐高溫的氧化鈦、氧化鋯、石墨化碳和聚合物色譜柱，其第二維為硅膠基質(zhì)的C18色譜柱。

上述結構的操作原理為通過第一維采用純水為流動相，以程序升溫進行洗脫，將第一維的洗脫液經(jīng)切換閥16和定量管收集并連續(xù)導入到第二維中分析，實現(xiàn)高溫全二維液相色譜的高效分離。

高溫全二維液相色譜具體其運行方式為：切換閥16位置一時，第一高壓二元液相色譜泵11輸送純水至第一色譜柱13，對第一色譜柱13上的樣品進行洗脫，柱溫箱15控制第一色譜柱13溫度，經(jīng)過程序升溫進行洗脫，即溫度從起始溫度開始，以一定的升溫的速率，逐漸升高色譜柱溫度至最終溫度，高溫洗脫第一色譜柱13上的樣品；第一色譜柱13上洗脫下來的餾分到達第一閥位1，經(jīng)第二閥位0到達樣品管A19，餾分被收集到樣品管A19中，多余的餾分或洗脫液到第三閥位5，再到第四閥位8，最后到達廢液瓶18；與此同時，第二維的洗脫液從第二高壓二元液相色譜泵12到達第八閥位6，再到第七閥位7，將樣品管B20中收集的餾分沖洗出來，到第五閥位2，再到第六閥位3，再到第二色譜柱14，餾分經(jīng)過第二色譜柱14的分離，最后到達檢測器17。經(jīng)過1min后，切換閥16切換到位置二，此時，從第一色譜柱13洗脫下來的餾分到達第一閥位1，經(jīng)第五閥位2到達樣品管B20，餾分被收集到樣品管B20中，多余的餾分或洗脫液到第七閥位7，再到第四閥位8，最后到達廢液瓶18；與此同時，第二維的洗脫液從第二高壓二元液相色譜泵12到達第八閥位6，再到第三閥位5，將樣品管A19中收集的餾分沖洗出來，到第二閥位0，再到第六閥位3，再到第二色譜柱14，餾分經(jīng)過第二色譜柱14的分離，最后到達檢測器17。經(jīng)過1min后，切換閥16切換到位置一，樣品管A19起收集作用，而樣品管B20位于進樣狀態(tài)；間隔1min后，切換閥16切換到位置二，樣品管B20起收集作用，而樣品管A19位于進樣狀態(tài)。以1min為間隔，如此交替運行，實現(xiàn)了連續(xù)全二維分析。

總之，切換16在位置一時，餾分從第一色譜柱13到達第一閥位1，再到第二閥位0，再到第三閥位5，再到第四閥位8，最后到達廢液瓶18；洗脫液從第二高壓二元液相色譜泵12到達第八閥位6，再到第七閥位7，再到第五閥位2，再到第六閥位3，再到第二色譜柱14，最后到達檢測器。

切換閥16位置二時，餾分從第一色譜柱13到達第一閥位1，再到第五閥位2，再到第七閥位7，再到第四閥位8，最后到達廢液瓶18；洗脫液從第二高壓二元液相色譜泵12到達第八閥位6，再到第三閥位5，再到第二閥位2，再到第六閥位3，再到第二色譜柱14，最后到達檢測器17。

為了便于理解上述使用方法，其使用方法主要由以下兩種，分為下述兩個實施例來描述。

實施例1

請參閱圖1和圖2，圖1為本發(fā)明所述的一種高溫全二維液相色譜裝置的切換閥為十通閥時，在位置一時的連接圖；圖2為本發(fā)明所述的一種高溫全二維液相色譜裝置的切換閥為十通閥時，在位置二時的連接圖。

本實施例的準備階段：

如圖1所示，切換閥16位置一時，高溫全二維液相色譜具體其運行方式為：第一高壓二元液相色譜泵11輸送純水至第一色譜柱13，對第一色譜柱13上的樣品進行洗脫，柱溫箱15控制第一色譜柱13溫度，經(jīng)過程序升溫進行洗脫，即溫度從25℃開始，以2℃/min的升溫的速率，30min內(nèi)逐漸升高色譜柱溫度至85℃，接著以4℃/min的升溫的速率，27min內(nèi)逐漸升高第一色譜柱13溫度至193℃，高溫洗脫第一色譜柱上的樣品；第一色譜柱13上洗脫下來的餾分到達第一閥位1，經(jīng)第二閥位0到達樣品管A19，餾分被收集到樣品管A19中，多余的餾分或洗脫液到第三閥位5，再到第十閥位4，再到第九閥位9，再到第四閥位8，最后到達廢液瓶18；與此同時，第二維的洗脫液從第二高壓二元液相色譜泵12到達第八閥位6，再到第七閥位7，將樣品管B20中收集的餾分沖洗出來，到第五閥位2，再到第六閥位3，再到第二色譜柱2，餾分經(jīng)過第二色譜柱2的分離，最后到達檢測器17。經(jīng)過1min后，如圖2所示，切換閥16切換到位置二，此時，從第一色譜柱13洗脫下來的餾分到達第一閥位1，經(jīng)第五閥位2到達樣品管B20，餾分被收集到樣品管B20中，多余的餾分或洗脫液到第七閥位7，再到第四閥位8，最后到達廢液瓶18；與此同時，第二維的洗脫液從第二高壓二元液相色譜泵12到達第八閥位6，再到第三閥位5，將樣品管A19中收集的餾分沖洗出來，到達第二閥位0，再到第九閥位9，再到第十閥位4，再到第六閥位3，再到第二色譜柱14，餾分經(jīng)過第二色譜柱14的分離，最后到達檢測器17。經(jīng)過1min后，切換閥16切換到位置一，樣品管A19起收集作用，而樣品管B20位于進樣狀態(tài)；間隔1min后，切換閥16切換到位置二，樣品管B20起收集作用，而樣品管A19位于進樣狀態(tài)。以1min為間隔，如此交替運行，實現(xiàn)了連續(xù)全二維分析。

第一維：石墨化碳反相色譜柱。

流動相：純水；流量：0.2mL/min，等度運行。程序升溫為：0—30min(25-85℃)；30-57min(85-193℃)

第二維：C18(Phenomenex Kinetex C18，2.6μm,4.6x50mm)

流動相A：0.1％TFA水溶液；流動相B：甲醇；流量:2mL/min；梯度為：0-15-45-50-51-60s(5％-30％-90％-90％-5％-5％B)

樣品：秦皮提取物；濃度：5mg/mL進樣量:5μL

本實施例的試驗階段：

系統(tǒng)按圖1連接后，兩維同時開始運行。第二維每1min一個分析周期，及切換閥16每1min切換一次，將定量環(huán)上捕集到的組分進樣到第二維色譜柱14進行分析。在本實施例中，第一維使用純水為流動相，程序升溫法進行洗脫。

上述實施例結果，請參閱圖5，圖5為本發(fā)明所述的一種高溫全二維液相色譜裝置的實施例1中分離肝素寡糖的效果圖。如圖5所示，與一維分離相比，高溫二維液相色譜系統(tǒng)獲得了更大的峰容量和更多的待鑒定組份。由于組份純度更高，使得后續(xù)質(zhì)譜或光譜檢測更準確和靈敏。

實施例2

請參閱圖3和圖4，圖3為本發(fā)明所述的一種高溫全二維液相色譜裝置的切換閥為八通閥時，在位置一時的連接圖；圖4為本發(fā)明所述的一種高溫全二維液相色譜裝置的切換閥為八通閥時，在位置二時的連接圖。

本實施例的準備階段：

第一維：ZirChrom氧化鋯反相色譜柱。流動相：純水；流量：0.1mL/min，等度運行。程序升溫為：0—103min(25-180℃)；103-120min(180℃)

第二維：C18(Waters Acquity UPLC peptide BEH C18,300A,1.7μm,4.6x50mm)

流動相A：0.2％戊胺和0.15％六氟異丙醇水溶液；流量:0.4mL/min；梯度為：0-32-47-50-51-60s(5％-12％-95％-95％-5％-5％B)

樣品：肝素寡糖濃度：5mg/mL進樣量:5μL

本實施例的試驗階段：

系統(tǒng)按圖3連接后，兩維同時開始運行。如圖3所示，切換閥16位置一時其運行方式為：第一高壓二元液相色譜泵11輸送純水至第一色譜柱13，對第一色譜柱13上的樣品進行洗脫，柱溫箱15控制色譜柱溫度，經(jīng)過程序升溫進行洗脫，即溫度從25℃開始，以5℃/min的速率，逐漸升高色譜柱溫度至180℃，高溫洗脫第一色譜柱13上的樣品；第一色譜柱13上洗脫下來的餾分到達第一閥位1，經(jīng)第二閥位0到達樣品管A19，餾分被收集到樣品管A19中，多余的餾分或洗脫液到第三閥位5，再到第四閥位8，最后到達廢液瓶18；與此同時，第二維的洗脫液從第二高壓二元液相色譜泵12到達第八閥位6，再到第七閥位7，將樣品管B20中收集的餾分沖洗出來，到第五閥位2，再到第六閥位3，再到第二色譜柱14，餾分經(jīng)過第二色譜柱14的分離，最后到達檢測器17。經(jīng)過1min后，如圖4所示，切換閥16切換到位置二，此時，從第一色譜柱13洗脫下來的餾分到達第一閥位1，經(jīng)第七閥位7到達樣品管B20，餾分被收集到樣品管B20中，多余的餾分或洗脫液到第五閥位2，再到第四閥位8，最后到達廢液瓶18；與此同時，第二維的洗脫液從第二高壓二元液相色譜泵12到達第八閥位6，再到第二閥位0，將樣品管A19中收集的餾分沖洗出來，到第三閥位5，再到第六閥位3，再到第二色譜柱14，餾分經(jīng)過第二色譜柱14的分離，最后到達檢測器17。經(jīng)過1min后，切換閥16切換到位置一，樣品管A19起收集作用，而樣品管B20位于進樣狀態(tài)；間隔1min后，切換閥16切換到位置二，樣品管B20起收集作用，而樣品管A19位于進樣狀態(tài)。以1min為間隔，如此交替運行，實現(xiàn)了連續(xù)全二維分析。

在本實施例中，第一維使用純水為流動相，通過程序升溫進行洗脫。

兩個六通閥的連接模式與操作方法與上述實施例1和2相似，所以在此不再贅述。

在液相色譜分離參數(shù)中，色譜柱柱溫對分離選擇性的影響可能有很大差別。隨著柱溫的升高，流動相粘度降低，溶質(zhì)在兩相間的遷移速度加快，可以極大地提高分析速度。以程序升溫運行的高溫液相色譜，使用亞臨界水為流動相，以耐高溫的液相色譜柱為固定相，可以實現(xiàn)樣品的有效分離。其流動相為純水，對第二維反相分離而言是弱溶劑，所以不會對第二維的分離產(chǎn)生不良影響。本發(fā)明開發(fā)了一種具有實用和環(huán)保性的高溫全二維液相色譜裝置實現(xiàn)了RPxRP的高效分離。并且，第一維采用純水為流動相，減少了有機溶劑的使用和消耗，實現(xiàn)了綠色化學。

應說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。