技術(shù)領(lǐng)域

本公開(kāi)內(nèi)容涉及診斷方法，且特別是用于檢測(cè)體液中病原體的方法和系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

視為作為背景與本發(fā)明公開(kāi)的主題相關(guān)的參考文獻(xiàn)列出如下：

-J.Keiser,J.Utzinger,Z.Premji,Y.Yamagata和B.H.Singer于Annals of Tropical Medicine&Parasitology中,卷96,號(hào)7,643–654(2002)

-美國(guó)專利號(hào)5,470,751

-Centers for Disease Control and Prevention CDC的在線出版物,Diagnostic Procedures,2009“Blood specimens:Microscopic Examination”at http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Frames/DiagnosticProcedures/body_dp_bloodexamin.htm

本文中對(duì)上述參考文獻(xiàn)的承認(rèn)不應(yīng)被推斷為意指這些以任何方式與本發(fā)明公開(kāi)的主題的專利性相關(guān)。

背景

染色是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中常用的技術(shù)以突出生物組織中的結(jié)構(gòu)用于觀察，經(jīng)常借助于不同的顯微鏡。著色劑(stain)可被用于定義和檢查大量組織(bulk tissue)(突出顯示，例如，肌纖維或結(jié)締組織)、細(xì)胞群(例如，分類不同的血細(xì)胞)、或單獨(dú)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器。

使用細(xì)胞染色以在顯微鏡下更好地可視化細(xì)胞和細(xì)胞組分。通過(guò)使用不同的著色劑，人們可優(yōu)先染色某些細(xì)胞組分，諸如核或細(xì)胞壁，或整個(gè)細(xì)胞?？蓪?duì)固定的、或非活細(xì)胞、以及對(duì)活細(xì)胞使用著色劑。

細(xì)胞染色技術(shù)還經(jīng)常被用于檢測(cè)血液樣品中的病原體。一種重要的病原體是瘧疾。

在1876年，合成了用于通過(guò)染色檢測(cè)的第一種染料(dye)亞甲藍(lán)。六年后，其被用于發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌。數(shù)年內(nèi)，采用修飾的MB，包括，與其他染料組合的“成熟的”MB，諸如伊紅，其允許區(qū)分血細(xì)胞和瘧疾寄生物的核，以及MB亞甲基藍(lán)去甲基化與作為穩(wěn)定劑的甘油在甲醇溶劑中的組合，被稱為Malachowski-賴特-姬姆薩著色劑。

J.Keiser等人描述了與姬姆薩著色劑相比，吖啶橙用于瘧疾診斷，包括其診斷性能、其推廣和實(shí)施、以及控制瘧疾的影響。

美國(guó)專利號(hào)5,470,751描述了用于染色瘧疾感染的細(xì)胞的另一種試劑和使用該試劑檢測(cè)瘧疾感染的細(xì)胞的方法，其中試劑是包含金胺類似物，諸如金胺O的至少一種第一染料和稠合的苯衍生物諸如3,3'-二乙基-2,2'-氧雜羰花青碘化物的至少一種第二染料的染色溶液。將試驗(yàn)樣品用試劑處理以染色瘧疾感染的細(xì)胞。然后將染色的瘧疾感染的細(xì)胞進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。

此外，Centers for Disease Control and Prevention CDC,Diagnostic Procedures，2009在“Blood specimens:Microscopic Examination”的標(biāo)題下描述了使用染色核酸的熒光染料用于檢測(cè)血液寄生物，諸如瘧原蟲的Kawamoto技術(shù)。如該出版物中所討論的，在Kawamoto技術(shù)中，將載玻片上的血涂片用吖啶橙(AO)染色，并用熒光顯微鏡或配備有干涉濾光器系統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡來(lái)檢查。這導(dǎo)致核DNA為綠色且細(xì)胞質(zhì)RNA為紅色的差別染色，其允許識(shí)別寄生物。

概述

本公開(kāi)內(nèi)容根據(jù)其各方面的第一個(gè)方面提供了，檢測(cè)樣品中病原體感染的方法，該方法包括：

-用兩種或更多種染料染色所述身體樣品，所述兩種或更多種染料包括主要染色DNA的至少一種染料，由此在DNA和不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分之間提供差別染色；

-如果DNA存在于樣品中，鑒定包含DNA的至少第一染色區(qū)，以及包含其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)；

-提取第一染色區(qū)和至少一個(gè)其他染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，所述結(jié)構(gòu)特征包括以下中的至少一個(gè)：(i)第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的大小和(ii)所述第一染色區(qū)和所述至少一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；以及

-如果第一染色區(qū)被鑒定且所述結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征可疑病原體的結(jié)構(gòu)特征，則確定樣品中可疑病原體的存在。

根據(jù)第二個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容提供了試劑盒，包括：

-第一染料，所述第一染料主要染色DNA；

-第二染料，所述第二染料用于染色不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分；

-說(shuō)明書，所述說(shuō)明書用于所述第一染料和所述第二染料用于確定樣品中可疑病原體的存在的使用。

根據(jù)第三個(gè)方面，本公開(kāi)內(nèi)容提供了系統(tǒng)，包括：

-圖像采集組件，所述圖像采集組件被配置和可操作以獲取樣品中的染色區(qū)的至少一個(gè)光學(xué)圖像，染色區(qū)包括主要相應(yīng)于DNA的第一染色區(qū)和相應(yīng)于不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)；

-圖像處理單元，所述圖像處理單元被配置以

i)提取所述至少第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，所述結(jié)構(gòu)特征包括以下中的至少一個(gè)：(i)所述第一染色區(qū)、和(ii)一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的大??；和所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；以及

ii)如果第一染色區(qū)被鑒定且所述結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征病原體感染的結(jié)構(gòu)特征，則確定身體樣品中可疑病原體的存在。

又，根據(jù)第四方面，本公開(kāi)內(nèi)容提供了用于鑒定樣品中的病原體的處理單元，包括：

-輸入模塊，所述輸入模塊被配置和可操作以接收相應(yīng)于樣品中的染色的對(duì)象的數(shù)據(jù)，該樣品中的染色的對(duì)象包括主要相應(yīng)于DNA的第一染色區(qū)和相應(yīng)于不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)，以及

-圖像處理單元，所述圖像處理單元被配置和可操作以處理相應(yīng)于所述染色的對(duì)象的所述數(shù)據(jù)，所述處理包括：

-提取染色的對(duì)象中的至少第一染色區(qū)和第二染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，所述結(jié)構(gòu)特征包括以下中的至少一個(gè)：(i)第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的面積和(ii)所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；以及

-如果所述結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征可疑病原體的結(jié)構(gòu)特征，則提供指示樣品中可疑病原體的存在或不存在的值或值的組合。

根據(jù)第五方面，本公開(kāi)內(nèi)容提供了計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，所述計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品包括計(jì)算機(jī)可用介質(zhì)，所述計(jì)算機(jī)可用介質(zhì)在其中具有實(shí)現(xiàn)在以兩種或更多種染料染色的樣品中檢測(cè)病原體感染的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼，計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品包括：

用于導(dǎo)致計(jì)算機(jī)鑒定染色的對(duì)象中主要相應(yīng)于DNA的至少第一染色區(qū)和相應(yīng)于不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼；

-用于導(dǎo)致計(jì)算機(jī)提取至少第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼，所述結(jié)構(gòu)特征包括以下中的至少一個(gè)：(i)第一和一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的面積和(ii)所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；

-用于導(dǎo)致計(jì)算機(jī)如果所述結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征可疑病原體感染的結(jié)構(gòu)特征，則確定指示樣品中可疑病原體的存在的值或值的組合的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼。

本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘韵聝?nèi)容：

項(xiàng)目1.一種檢測(cè)樣品中病原體感染的方法，所述方法包括：用兩種或更多種染料染色所述樣品，所述兩種或更多種染料包括主要染色DNA的至少一種染料，以由此在DNA和不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分之間提供差別染色；如果所述DNA存在于樣品中，鑒定包含所述DNA的至少第一染色區(qū)，以及包含所述其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)；提取所述第一染色區(qū)和所述至少一個(gè)其他染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，所述結(jié)構(gòu)特征包括以下中的至少一個(gè)：(i)所述第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的大小和(ii)所述第一染色區(qū)和所述至少一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；如果第一染色區(qū)被鑒定且所述結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征可疑病原體的結(jié)構(gòu)特征，則確定指示所述身體樣品中的所述可疑病原體的存在的值或值的組合。

項(xiàng)目2.如項(xiàng)目1所述的方法，其中至少一種其他染料主要染色除了DNA外的細(xì)胞組分。

項(xiàng)目3.如項(xiàng)目1或2所述的方法，其中所述至少一種其他染料主要染色選自由以下組成的組的細(xì)胞組分：RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、膜、細(xì)胞質(zhì)、核糖體、碳水化合物、葡聚糖、糖蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、或其任何組合。

項(xiàng)目4.如項(xiàng)目1至3的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一種或更多種染料對(duì)細(xì)胞類型是非特異的。

項(xiàng)目5.如項(xiàng)目1至4的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一種或更多種染料選自由以下組成的組：吖啶橙(AO)、Hoechst家族、結(jié)晶紫、DAPI、伊紅、溴化乙錠、碘化丙錠、SYBR家族、YOYO、TOTO、蘇木精、番紅、DRAQ-家族、SYTO家族。

項(xiàng)目6.如項(xiàng)目5所述的方法，其中所述第一染色區(qū)由Hoechst染色來(lái)提供且所述第二染色區(qū)由AO來(lái)提供。

項(xiàng)目7.如項(xiàng)目6所述的方法，其中所述Hoechst染色由選自由以下組成的組的Hoechst著色劑來(lái)提供：Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、Hoechst S769121。

項(xiàng)目8.如項(xiàng)目1至7的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品為身體樣品。

項(xiàng)目9.如項(xiàng)目8所述的方法，其中所述身體液體樣品選自由以下組成的組：血液、唾液、精液、汗液、痰、陰道分泌物、糞便、乳汁、淚液、鼻涕。

項(xiàng)目10.如項(xiàng)目9所述的方法，其中所述身體液體樣品選自由以下組成的組：全血樣品和紅細(xì)胞樣品。

項(xiàng)目11.如項(xiàng)目1至10的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病原體是攜帶DNA的病原體。

項(xiàng)目12.如項(xiàng)目11所述的方法，其中所述病原體是寄生物。

項(xiàng)目13.如項(xiàng)目12所述的方法，其中所述寄生物是原生動(dòng)物。

項(xiàng)目14.如項(xiàng)目13所述的方法，其中所述原生動(dòng)物選自由以下組成的組：錐蟲屬物種(Trypanosoma species)、利什曼原蟲屬物種(Leishmania species)、瘧原蟲屬物種(Plasmodium species)、弓形蟲(Toxoplasma gondii)、和巴貝斯蟲屬物種(Babesia species)。

項(xiàng)目15.如項(xiàng)目13所述的方法，其中所述原生動(dòng)物為引起人類瘧疾的瘧原蟲屬物種且選自由以下組成的組：惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、卵形瘧原蟲(P.ovale)和三日瘧原蟲(P.malariae)。

項(xiàng)目16.如項(xiàng)目1至15的任一項(xiàng)所述的方法，其中提取結(jié)構(gòu)特征包括選擇所述樣品中包括所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)的染色的對(duì)象，以及對(duì)于所述染色的對(duì)象，如果鑒定了第一染色區(qū)，且以下的至少一個(gè)出現(xiàn)：i)所述第一染色區(qū)鄰接或位于所述一個(gè)其他染色區(qū)的邊界內(nèi)；以及ii)所述第一染色和所述一個(gè)其他染色的至少一個(gè)的大小在預(yù)定的范圍內(nèi)，則確定指示所述樣品中可疑病原體的存在的值或值的組合。

項(xiàng)目17.如項(xiàng)目1至16的任一項(xiàng)所述的方法，其中提取結(jié)構(gòu)特征包括選擇包括所述第一染色區(qū)和所述第二染色區(qū)的染色的對(duì)象，且如果對(duì)于所述染色的對(duì)象，鑒定了第一染色區(qū)且所述第一染色區(qū)的大小滿足關(guān)于所述一個(gè)染色區(qū)的大小的預(yù)定的關(guān)系，則確定指示所述樣品中可疑病原體的存在的值或值的組合。

項(xiàng)目18.如項(xiàng)目1至17的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病原體為瘧原蟲，并且提取結(jié)構(gòu)特征包括選擇包括至少所述第一染色區(qū)的染色的對(duì)象，且如果所述第一染色區(qū)的面積在0.2μm²至20μm²的范圍內(nèi)，則確定指示所述樣品中瘧原蟲的存在的值或值的組合。

項(xiàng)目19.如項(xiàng)目18所述的方法，其中所述病原體為瘧原蟲，并且提取結(jié)構(gòu)特征包括選擇包括所述第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的染色的對(duì)象且如果所述一個(gè)其他染色區(qū)的面積在0.8μm²至65μm²的范圍內(nèi)，則確定所述樣品中瘧原蟲的存在。

項(xiàng)目20.如項(xiàng)目1至19的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病原體為瘧原蟲，并且所述提取結(jié)構(gòu)特征包括選擇包括所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)的染色的對(duì)象，且如果所述第一染色區(qū)占據(jù)所述一個(gè)其他染色區(qū)的12％至60％，則確定所述樣品中瘧原蟲的存在。

項(xiàng)目21.如項(xiàng)目1至20的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述提取結(jié)構(gòu)特征包括選擇包括所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)的染色的對(duì)象，且如果所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)具有預(yù)定的形狀，則確定所述生物樣品中可疑病原體的存在。

項(xiàng)目22.如項(xiàng)目1至21的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述提取結(jié)構(gòu)特征包括選擇包括所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)的染色的對(duì)象，且如果所述第一染色區(qū)包括染色強(qiáng)度中的差異性，則確定所述樣品中可疑病原體的存在。

項(xiàng)目23.如項(xiàng)目1至22的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述提取結(jié)構(gòu)特征包括選擇包括所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)的染色的對(duì)象，且如果所述染色的對(duì)象的運(yùn)動(dòng)模式對(duì)應(yīng)與所述可疑病原體相關(guān)的預(yù)定的模式，則確定所述樣品中可疑病原體的存在。

項(xiàng)目24.如項(xiàng)目1至23的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述提取結(jié)構(gòu)特征包括選擇包括所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)的染色的對(duì)象，以及如果在所述染色的對(duì)象的運(yùn)動(dòng)期間所述第一染色區(qū)維持在所述一個(gè)其他染色區(qū)的邊界內(nèi)，則確定所述樣品中可疑病原體的存在。

項(xiàng)目25.如項(xiàng)目1至24的任一項(xiàng)所述的方法，所述方法包括獲取所述染色的對(duì)象的一個(gè)或更多個(gè)光學(xué)圖像，以及從所述一個(gè)或更多個(gè)光學(xué)圖像提取所述結(jié)構(gòu)特征。

項(xiàng)目26.一種試劑盒，所述試劑盒包括：第一染料，所述第一染料主要染色DNA；第二染料，所述第二染料用于染色不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分；說(shuō)明書，所述說(shuō)明書用于所述第一染料和所述第二染料用于確定樣品中可疑病原體的存在的使用。

項(xiàng)目27.如項(xiàng)目26所述的試劑盒，所述試劑盒用于在進(jìn)行項(xiàng)目1至25的任一項(xiàng)所述的方法中使用。

項(xiàng)目28.如項(xiàng)目26或27所述的試劑盒，其中所述第一染料包括Hoechst染料。

項(xiàng)目29.如項(xiàng)目26至28的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第二染料包括吖啶橙。

項(xiàng)目30.如項(xiàng)目28或29所述的試劑盒，所述試劑盒包括用于為所述身體樣品以50:1至1:1之間的范圍比提供所述第一染料和所述第二染料的說(shuō)明書。

項(xiàng)目31.一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：圖像采集組件，所述圖像采集組件被配置和可操作以獲取樣品中的染色區(qū)的至少一個(gè)光學(xué)圖像，所述染色區(qū)包括主要相應(yīng)于DNA的第一染色區(qū)和相應(yīng)于不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)；圖像處理單元，所述圖像處理單元被配置以i)提取所述至少第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，所述結(jié)構(gòu)特征包括以下中的至少一個(gè)：(i)所述第一染色區(qū)、和(ii)一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的大小；以及所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；以及ii)如果第一染色區(qū)被鑒定且所述結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征病原體感染的結(jié)構(gòu)特征，則確定指示所述身體樣品中可疑病原體的存在的值或值的組合。

項(xiàng)目32.一種用于鑒定樣品中的病原體的處理單元，所述處理單元包括：輸入模塊，所述輸入模塊被配置和可操作以接收相應(yīng)于所述樣品中的染色的對(duì)象的數(shù)據(jù)，所述樣品中的染色的對(duì)象包括主要相應(yīng)于DNA的至少第一染色區(qū)和包括另一種細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)，以及圖像處理單元，所述圖像處理單元被配置和可操作以處理相應(yīng)于所述染色的對(duì)象的所述數(shù)據(jù)，所述處理包括：提取所述染色的對(duì)象中的所述至少所述第一染色區(qū)和第二染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，所述結(jié)構(gòu)特征包括以下中的至少一個(gè)：(i)所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的大小，和(ii)所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；以及如果所述結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征可疑病原體的結(jié)構(gòu)特征，則提供指示所述身體樣品中所述可疑病原體的存在或不存在的值或值的組合。

項(xiàng)目33.一種機(jī)器可讀的程序存儲(chǔ)裝置，所述程序存儲(chǔ)裝置可觸知地實(shí)現(xiàn)由所述機(jī)器可執(zhí)行的指令的程序以進(jìn)行檢測(cè)樣品中的病原體感染的方法，所述方法包括：用一種或更多種染料染色所述身體液體樣品，所述一種或更多種染料提供至少DNA和不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分的差別染色；鑒定主要相應(yīng)于DNA的至少第一染色區(qū)和相應(yīng)于不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)；提取所述至少第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，所述結(jié)構(gòu)特征包括至少(i)所述第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的大小和(ii)所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；如果所述結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征病原體感染的結(jié)構(gòu)特征，則確定指示所述身體樣品中病原體的存在的值或值的組合。

項(xiàng)目34.一種計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，所述計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品包括計(jì)算機(jī)可用介質(zhì)，所述計(jì)算機(jī)可用介質(zhì)在其中具有實(shí)現(xiàn)的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼，所述計(jì)算機(jī)可讀程序代碼用于在以一種或更多種染料染色的樣品身體樣品中檢測(cè)病原體感染，所述計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品包括：導(dǎo)致所述計(jì)算機(jī)鑒定所述樣品內(nèi)的染色的對(duì)象的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼；導(dǎo)致所述計(jì)算機(jī)鑒定所述染色的對(duì)象中主要相應(yīng)于DNA的至少第一染色區(qū)和相應(yīng)于不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼；導(dǎo)致所述計(jì)算機(jī)提取所述至少第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼，所述結(jié)構(gòu)特征包括以下中的至少一個(gè)：(i)所述第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的面積和(ii)所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；導(dǎo)致所述計(jì)算機(jī)如果所述結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征可疑病原體感染的結(jié)構(gòu)特征，則確定指示所述身體樣品中所述可疑病原體的存在的值或值的組合的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼。

附圖簡(jiǎn)述

為了更好地理解本文公開(kāi)的主題并舉例說(shuō)明其可如何在實(shí)踐中進(jìn)行，現(xiàn)將通過(guò)僅非限制性實(shí)例的方式，參考附圖，描述實(shí)施方案，其中：

圖1A-1F顯示了三種不同曝光下獲得的圖像；白細(xì)胞(圖1A-1C)和瘧疾感染的紅細(xì)胞(圖1D-1F)的明場(chǎng)(圖1A、1D)、藍(lán)色熒光(365nm，圖1B和1E)和UV熒光(475nm，圖1C、1F)的圖像。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明是基于用于血液樣品中的不同組分的差別染色從而允許幾乎即時(shí)檢測(cè)血液中的感染的方法的開(kāi)發(fā)。

具體地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用吖啶橙(AO)試劑染色血液樣品允許區(qū)分包含DNA的病原體和，例如，血小板、網(wǎng)織紅細(xì)胞、豪-喬小體、以及細(xì)菌諸如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。

還發(fā)現(xiàn)了，用AO和Hoechst試劑染色血液樣品，并通過(guò)采用包括兩個(gè)不同的染色區(qū)(對(duì)象是包括所檢查的染色區(qū)的視野中的圖像)的染色的對(duì)象的圖像分析，允許檢測(cè)血液樣品中的瘧疾感染。在這方面，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了，除了檢測(cè)在(樣品的)觀察的染色的對(duì)象中的兩個(gè)不同的染色區(qū)，考慮到染色區(qū)的一些空間特征，諸如每個(gè)染色區(qū)的大小或維度和/或其之間的空間位置關(guān)系有時(shí)也是重要的。

本發(fā)明人還確定了，為檢測(cè)血液樣品中的病原體，至少一種染料應(yīng)優(yōu)先于染色其他細(xì)胞組分染色脫氧核糖核酸(DNA)。

本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用兩種染料，一種主要染色DNA，所獲得的診斷的靈敏度在95％以上，且甚至在97％或99％以上。

此外，已發(fā)現(xiàn)并還顯示于以下實(shí)施例中，本文公開(kāi)的方法允許鑒定低計(jì)數(shù)/μl的病原體的存在。例如，本文提供的實(shí)施例顯示了，寄生物，諸如瘧原蟲可甚至在低于1,000個(gè)寄生物/μl的計(jì)數(shù)且甚至以約20個(gè)寄生物/μl的低計(jì)數(shù)在血液中檢測(cè)到。

因此，本公開(kāi)內(nèi)容根據(jù)第一個(gè)方面提供了，檢測(cè)樣品中病原體感染的方法，方法包括：

-用兩種或更多種染料染色所述身體樣品，其中至少一種染料主要染色DNA，由此在DNA和不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分之間提供差別染色；

-如果DNA存在于樣品中，鑒定包含DNA的至少第一染色區(qū)，以及包含其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)；

-提取所述第一染色區(qū)和至少一個(gè)其他的染色區(qū)的空間特征，所述空間特征包括以下中的至少一個(gè)：(i)所述第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的大??；以及(ii)第一染色區(qū)和至少一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；

-如果第一染色區(qū)被鑒定且所述空間特性符合(即，匹配、相應(yīng)于、屬于、與其相關(guān))預(yù)定為表征可疑病原體感染的值或值的組合，確定樣品中的病原體的存在。

如所理解的，雖然本發(fā)明在以下的詳細(xì)描述中關(guān)于檢測(cè)樣品諸如血液樣品中病原體感染的方法來(lái)描述，應(yīng)理解，本公開(kāi)內(nèi)容還包括，用于執(zhí)行本發(fā)明的試劑盒、系統(tǒng)、處理單元以及其他方面，如本文中公開(kāi)的，

本發(fā)明的方法適用于各種樣品。在一些實(shí)施方案中，樣品是身體樣品。在一些實(shí)施方案中，身體樣品是液體身體樣品，諸如，但不限于此，血液、唾液、精液、汗液、痰、陰道分泌物(vaginal fluid)、糞便、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、洗胃液、淚液和鼻涕。

在一些實(shí)施方案中，身體樣品是血液樣品。

在一些實(shí)施方案中，血液樣品選自全血樣品、紅細(xì)胞樣品、血沉棕黃層樣品、血漿樣品、血清樣品、來(lái)自任何其他血液級(jí)分的樣品、或其任何組合。

身體樣品可以來(lái)自任何生物，但優(yōu)選地來(lái)自溫血?jiǎng)游铩?/p>

在一些實(shí)施方案中，身體樣品是來(lái)自哺乳動(dòng)物的樣品。

在一些實(shí)施方案中，身體樣品是取自人體的樣品。

在其他一些實(shí)施方案中，樣品取自任何家養(yǎng)動(dòng)物、動(dòng)物園動(dòng)物和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，包括但不限于狗、貓、馬、牛和綿羊。

在一些實(shí)施方案中，身體樣品可取自作為疾病媒介物的動(dòng)物，包括鹿或大鼠。

在一些其他實(shí)施方案中，樣品是環(huán)境樣品，諸如，但不限于此，水(例如地下水)樣品、表面拭子、土壤樣品、空氣樣品、或其任何組合。

在一些其他實(shí)施方案中，樣品是血液樣品，諸如，但不限于此，肉樣品、乳樣品、水樣品、洗滌液樣品(wash-liquid sample)、飲料樣品、和其任何組合。

作為在本文中公開(kāi)的方法的第一階段，在適合的條件下，將樣品用在樣品中提供兩種不同染色區(qū)的至少兩種染料染色。

除了其他以外，可相對(duì)于例如背景或并行的染色(collateral staining)定義染色區(qū)。例如，基于強(qiáng)度的閾值、基于對(duì)比的閾值、邊緣檢測(cè)、背景減除、標(biāo)準(zhǔn)化、或其組合可被應(yīng)用于限定染色區(qū)。此外，染色區(qū)的限定可允許，除了其他以外，發(fā)散邊界(diffuse boundaries)，例如，通過(guò)使用亮度加權(quán)的總和/積分。

在一些實(shí)施方案中，諸如在膜染色的情況下，存在于第二染色區(qū)內(nèi)的第一染色區(qū)可被定義為包括第一區(qū)域存在于第二區(qū)域內(nèi)外切的區(qū)域(the area circumscribed within the second area)內(nèi)的情況。例如，紅細(xì)胞的膜染色，可導(dǎo)致類似于圍繞細(xì)胞圓周的細(xì)線條的第二染色區(qū)(如在二維顯微鏡圖像中觀察的)；在這樣的情況下，如果其落入染色的細(xì)胞圓周內(nèi)，則可確定第一區(qū)存在于所述第二區(qū)域內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，染色樣品可需要標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡樣品制備。例如，樣品制備可利用用于血涂片制備的熟知的薄涂片或厚涂片法。作為替代的實(shí)例，與放置染料一起、之前或之后將一滴樣品置于干凈的載玻片的中間，并將蓋玻片以一定角度，首先使邊緣接觸載玻片，輕輕地放置在滴上。然后允許液體在兩片玻璃之間散開(kāi)而不施加壓力。

當(dāng)提及染料時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解為包括能夠染色生物細(xì)胞的組分，以增強(qiáng)對(duì)比和突出是細(xì)胞或細(xì)胞的一部分的染色對(duì)象的結(jié)構(gòu)的任何化學(xué)或生物物質(zhì)。染料可具有類偏好或特異性，例如可具有對(duì)染色核酸，以及在核酸之間對(duì)DNA或RNA的偏好或特異性，對(duì)氨基酸、對(duì)脂質(zhì)、碳水化合物等的偏好或特異性。

當(dāng)提及偏好或主要染色時(shí)，應(yīng)理解，染料以其強(qiáng)度比以相同顏色或熒光光譜對(duì)另一種細(xì)胞組分的染色強(qiáng)度大至少兩倍、三倍、四倍或甚至10倍的特定顏色或熒光染色一種其他細(xì)胞組分。

在一些實(shí)施方案中，當(dāng)提及偏好或主要染色時(shí)，應(yīng)理解，染料對(duì)一種細(xì)胞組分(以特定的顏色或熒光光譜)具有的親和力(分子引力)是其對(duì)另一種細(xì)胞組分的親和力(以相同的顏色或熒光光譜)的至少兩倍、三倍、四倍、甚至10倍大。

在一些另外的實(shí)施方案中，當(dāng)提及偏好或主要染色時(shí)，應(yīng)理解，通過(guò)染料染色DNA是穩(wěn)定的，或與其染色其他組分相比具有更高的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性可被理解為意指，在用對(duì)DNA具有偏好的染料染色樣品后，在接觸到染料后至少30分鐘，有時(shí)至少1小時(shí)、2小時(shí)或甚至5小時(shí)后，由染料產(chǎn)生的染色保持基本上一致。另外，穩(wěn)定性可被理解為意指，由染料所產(chǎn)生的染色，在曝光(例如用于熒光激發(fā)的光)至少0.25秒、1秒、或甚至15秒的曝光期間保持基本上一致。

在此背景下，應(yīng)理解，對(duì)DNA具有偏好的染料還可染色其他細(xì)胞組分，但以較低的引力或較低強(qiáng)度或以不同的熒光響應(yīng)(激發(fā)光譜和/或發(fā)射光譜)，使得其允許染料對(duì)其具有偏好的DNA的更大增強(qiáng)。例如，如將在以下進(jìn)一步討論的，在某些條件下，染料可主要染色DNA，然而，在一些其他條件下，相同染料可染色RNA。

類似地，一種其他細(xì)胞組分的染色，應(yīng)理解為包括除了DNA之外一種或更多種細(xì)胞組分的染色。這還可包括除了DNA之外的一種或更多種細(xì)胞組分的染色，但對(duì)DNA的染色沒(méi)有偏好或較低偏好。

在一些實(shí)施方案中，染料不是細(xì)胞類型特異性的。換言之，染料不特異于特定病原體或特定病原體的生命周期的特定階段或由其感染的宿主的特定細(xì)胞，并且將染色細(xì)胞組分，不論其起源，例如DNA序列或結(jié)構(gòu)本身、RNA序列或結(jié)構(gòu)本身、蛋白本身等。

第一染色區(qū)的存在基于各種因素確定，所述因素可涉及，除了其他以外，染色強(qiáng)度、染色形狀、染色的差異性或一致性等。一旦第一染色區(qū)被確定存在，則歸因于DNA的存在。

方法還提供了不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分的染色區(qū)。染色區(qū)可從不同的條件下相同的染料或通過(guò)使用不同的染料獲得。

不限于此，至少一種其他細(xì)胞組分選自由以下組成的組：RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、膜、細(xì)胞質(zhì)、核糖體、碳水化合物、葡聚糖、糖蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、或其任何組合。

在一些實(shí)施方案中，至少一種其他細(xì)胞組分為RNA。

存在可根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容使用的各種染料。在一些實(shí)施方案中，染料是發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)。

染料諸如姬姆薩著色劑被稱為發(fā)色的—其效應(yīng)是對(duì)樣品提供顏色或不透明度并且是可見(jiàn)的，例如，以亮視野顯微鏡。

在一些實(shí)施方案中，染料提供樣品的熒光染色。熒光通過(guò)用導(dǎo)致以光的不同光譜“發(fā)光”的“激發(fā)”光的光譜照射樣品來(lái)可視化。熒光染料的潛在優(yōu)勢(shì)是，未染色的樣品區(qū)域顯示為黑色或近黑，因此通常在染色和未染色區(qū)之間比發(fā)色斑提供更大的對(duì)比。吖啶橙(AO)是用于生物樣品的熒光染色的染料的實(shí)例。

在一些實(shí)施方案中，染料是細(xì)胞滲透染料。

不限于此，主要染色DNA的染料可以是由以下組成的組的任何成員：吖啶橙(AO，N,N,N',N'-四甲基吖啶-3,6-二胺，綠色染色)、Hoechst家族、DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、溴化乙錠(3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴化物)、碘化丙錠(2,7-二氨基-9-苯基-10(二乙基氨基丙基)-菲啶碘化物甲碘化物)、SYBR家族、YOYO、DRAQ家族、SYTO家族、TOTO家族、或其任何組合。此外，染料包括保留其DNA偏好的任何前述染料的化學(xué)改性。

不限于此，不主要染色DNA的染料可以是由以下組成的組的任何成員：結(jié)晶紫(三(4-(二甲基氨基)苯基)甲基氯)、蘇木精著色劑、伊紅著色劑、番紅(對(duì)稱的2,8-二甲基-3,7-二氨基吩嗪的氮鎓化合物)、吖啶橙(AO，N,N,N',N'-四甲基吖啶-3,6-二胺，紅染色)、酸-希夫著色劑、Masson著色劑、普魯士藍(lán)、或其任何成分或組合。不主要染色DNA的更多染料是本領(lǐng)域已知的。

染料諸如AO對(duì)不同的細(xì)胞組分提供不同的熒光光譜。當(dāng)AO在中性pH下染色DNA時(shí)，其具有502nm下的激發(fā)峰(青色)和525nm下的發(fā)射峰(綠色)；當(dāng)其在中性pH下染色RNA時(shí)，激發(fā)峰移至460nm(藍(lán)色)和發(fā)射峰偏移到650nm(紅色)。因此，取決于激發(fā)波長(zhǎng)和樣品的條件，其允許在DNA和RNA之間的差別染色。

Hoechst家族染料由化學(xué)式C₂₅H₂₆N₆R來(lái)已知，其中R代表各種可能的取代基，諸如，不限于此，-OH(Hoechst 33258)、-CH₂CH₃(Hoechst 33342)、-N(CH₃)₂(Hoechst 34580)、-SO₂NH₂(Hoechst S769121)。

在一些實(shí)施方案中，方法包括用至少兩種染料組合染色，第一染料為Hoechst家族的成員且第二染料是吖啶橙。

當(dāng)提及兩種或更多種著色劑的組合時(shí)，應(yīng)理解，可將兩種或更多種染料同時(shí)或依次地添加至樣品。類似地，只要存在允許觀看同一樣品中兩種或更多種不同的染色區(qū)的時(shí)間點(diǎn)，可以同時(shí)或依次得到各自的染色區(qū)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，方法采用AO與本質(zhì)上特異于核DNA的膜滲透性染料(例如Hoechst 33342，產(chǎn)生藍(lán)色的發(fā)光)的組合。

根據(jù)本實(shí)施方案，AO允許使用紅色發(fā)射或綠色和紅色發(fā)射的組合，以染色病原體的細(xì)胞質(zhì)(并且還可能細(xì)胞核，但基本上不干擾Hoechst染色)。

在一些實(shí)施方案中，AO和Hoechst的組合允許檢測(cè)寄生物。根據(jù)本實(shí)施方案并不限于此，對(duì)于檢測(cè)寄生物，諸如瘧原蟲屬(Plasmodium)物種的成員,Hoechst試劑諸如Hoechst 33342的濃度可以是10μg/mL，但還可使用其他可能的值，例如在3μg/mL和250μg/mL之間的范圍內(nèi)；并且可以以1.5μg/mL使用AO，但還可使用其他可能的值，例如在0.2μg/mL和125μg/mL之間的范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，確定所用的AO和Hoechst試劑的量，以便在生物樣品中提供其間的比。因此，Hoechst:AO比可在50:1至1:1之間的范圍內(nèi)，有時(shí)約7.5:1。

相同或相似的比還可適用于其他染料組合，第一染料主要染色DNA且其他染料主要染色一種其他組分，如所定義的，即，在第一染料和其他染料之間50:1至1:1之間的范圍的比。

AO可以另外地或替代地被用于染色,例如，瘧原蟲屬細(xì)胞質(zhì)和/或食物泡，但不是寄生物可在其內(nèi)的紅細(xì)胞(RBC)的細(xì)胞質(zhì)，允許寄生物的身體被觀察到而不被RBC掩蓋，即使寄生物存在于RBC內(nèi)。

合適的濃度可相對(duì)于因素，諸如特定的染料組合、染色溫育的期望持續(xù)時(shí)間、得到的顏色或熒光的亮度、以及得到的染色的特性來(lái)優(yōu)化。

在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法可適用于檢測(cè)由攜帶DNA的病原體的感染。如此，如果DNA存在于樣品中的話，至少第一染料染色至少DNA，由此提供指示樣品中攜帶DNA的病原體的存在的第一染色區(qū)。

病原體可以是任何傳染性微生物。在一些實(shí)施方案中，病原體是真核寄生物。在本公開(kāi)內(nèi)容的上下文中，當(dāng)提及真核寄生物時(shí)，應(yīng)理解為包含單細(xì)胞寄生物和多細(xì)胞寄生物，還有真菌，諸如酵母(例如假絲酵母屬(Candida))和曲霉屬(Aspergillus)。

在一些實(shí)施方案中，病原體是細(xì)菌。這包括，例如并不限于此，大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、結(jié)核棒狀桿菌(Microbacterium tuberculosis)、沙門氏菌屬物種(Salmonella species)、疏螺旋體屬物種(Borrelia species)和蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)以及其他已知的細(xì)菌。

在一些實(shí)施方案中，病原體是真核寄生物。根據(jù)該實(shí)施方案，寄生物可以是單細(xì)胞的寄生物，諸如原生動(dòng)物。這包括生殖器原生動(dòng)物，例如陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)，神經(jīng)系統(tǒng)原生動(dòng)物，例如福氏耐格里阿米巴原蟲(Naegleria fowleri)，糞便原生動(dòng)物，例如蘭伯賈第蟲(Giardia lamblia)，血液原生動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，病原體可以是多細(xì)胞的寄生物，諸如班氏絲蟲(Wuchereria bancrofti)、馬來(lái)絲蟲(Brugia malayi)、帝紋絲蟲(Brugia timori)、鏈尾絲蟲(Mansonella streptocerca)、或盤尾絲蟲(Onchocerca volvulus)。

在一些實(shí)施方案中，寄生物是選自由以下組成的屬的血液原生動(dòng)物：錐蟲屬(Trypanosoma)(導(dǎo)致加斯病(Chagas disease)和非洲昏睡病)；瘧原蟲屬(導(dǎo)致瘧疾)；弓形蟲屬(導(dǎo)致弓形體病)；巴貝斯蟲(Babesia)(導(dǎo)致巴貝斯蟲病(Babesiosis))。

具體地說(shuō)，當(dāng)提及瘧原蟲屬時(shí)，應(yīng)理解為至少包含由以下組成的組的任何成員：惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)(P.falciparum)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)(P.vivax)、卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)(P.ovale)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)(P.malariae)、和諾氏瘧原蟲(Plasmodium knowlesi)(P.knowlesi)。

在一些實(shí)施方案中，病原體被理解為意指特定病原體或其組的生命周期的特定階段。例如，可具體應(yīng)用本文中公開(kāi)的本發(fā)明以檢測(cè)瘧原蟲屬物種或特別是惡性瘧原蟲的滋養(yǎng)體、裂殖體或配子母細(xì)胞。

如可理解的，本文中公開(kāi)的方法可適用于使用相同條件和/或在同一樣品中，例如，染料的相同組合，相同測(cè)試條件等，檢測(cè)多種病原體，以及檢測(cè)病原體在其生活周期的多個(gè)階段。在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法可確定所懷疑的多種病原體(或生命階段)的哪一種或更多種。

在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法用于檢測(cè)人血液樣品中的瘧原蟲感染，方法包括：

-用至少兩種染料在允許至少染色DNA和不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分的條件下染色人血樣品；

-如果DNA存在于血液樣品中，鑒定血液樣品中包含DNA的至少第一染色區(qū)，以及包含一種其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)；

-提取第一染色區(qū)和至少一個(gè)其他染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，所述空間特征包括第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的大小以及第一染色區(qū)和至少一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；

-如果第一染色區(qū)被鑒定并且所述結(jié)構(gòu)特征落入預(yù)定為表征病原體感染的限定之內(nèi)，則確定指示血液中可疑瘧原蟲的存在的值或值的組合。

在涉及確定血液中瘧原蟲的存在的一些實(shí)施方案中，通過(guò)用吖啶橙(AO)和Hoechst染料，特別是Hoechst 33342，以在1:50和1:1的范圍內(nèi)，有時(shí)，甚至在1:7.5的范圍內(nèi)的AO和Hoechst 33342之間的濃度比的組合染色血液樣品獲得染色的對(duì)象。

根據(jù)上述實(shí)施方案，方法適用于檢測(cè)人類血液樣品中的瘧疾感染。

一旦用一種或更多種染料染色樣品，則獲得至少一個(gè)染色的對(duì)象，并且然后方法包括選擇樣品中的至少一個(gè)染色的對(duì)象，以及獲得染色的對(duì)象的結(jié)構(gòu)或空間特征。

當(dāng)提及染色的對(duì)象的空間或結(jié)構(gòu)特征時(shí)，應(yīng)理解為包含選擇的染色的對(duì)象中的染色區(qū)的任何可測(cè)量的特征。特征可以呈現(xiàn)為表征染色區(qū)的離散值或值的范圍。

在一些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)特征包括以下的至少一個(gè)：染色區(qū)的大小(例如，維度、長(zhǎng)度、周長(zhǎng)、最小寬度、最大寬度、或面積)和/或第一染色區(qū)相對(duì)于其他一個(gè)或更多個(gè)染色區(qū)的位置的位置。換言之，方法可基于至少一個(gè)決定性維度，例如染色區(qū)的面積，或第一染色區(qū)相對(duì)于其他一個(gè)或更多個(gè)染色區(qū)的位置的位置來(lái)進(jìn)行。這些特征還可與一個(gè)或更多個(gè)另外的特征組合。

另外的結(jié)構(gòu)特征可包括，但不限于此，染色區(qū)的形狀、染色區(qū)的運(yùn)動(dòng)模式、染色區(qū)的強(qiáng)度、染色區(qū)的顏色、染色區(qū)的質(zhì)地(texture)(輪廓(contour))、染色區(qū)的邊界清晰度、染色強(qiáng)度或顏色的模式、染色區(qū)與其他染色區(qū)或圖形特征的重疊、染色區(qū)與其他染色區(qū)或圖形特征的相對(duì)大小、染色區(qū)與其他染色區(qū)或圖形特征的接近或接觸。

在一些實(shí)施方案中，身體樣品是血液樣品。

在一些實(shí)施方案中，病原體是血液寄生物。

在一些實(shí)施方案中，身體樣品是人血液且病原體是引起人類瘧疾的瘧原蟲屬物種，諸如選自由以下組成的組的那些：惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲。

當(dāng)身體樣品是血液樣品時(shí)，結(jié)構(gòu)特征的提取包括選擇血液樣品中包括第一染色區(qū)和至少一個(gè)其他染色區(qū)的染色的對(duì)象。

基于染色區(qū)和結(jié)構(gòu)特征的分析，確定樣品感染可疑病原體的高可能性。因此，在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的上下文中，當(dāng)提及病原體或可疑病原體的存在的確定時(shí)，應(yīng)理解確定了以下的任何一種：

-一種或更多種可疑病原體存在于樣品中；

-一種或更多種可疑病原體以高于預(yù)定的閾值的置信區(qū)間存在于樣品中；置信區(qū)間可增加或最終確定可疑病原體的存在可需要一個(gè)或更多個(gè)另外的分析步驟。

-一種或更多種可疑病原體可以確定的或評(píng)估的置信評(píng)分或?qū)α硗夥治霾襟E可獲得的可能性存在于樣品中。

根據(jù)一些實(shí)施方案，如果鑒定了第一染色區(qū)(指示樣品中DNA的存在)，且第一染色區(qū)鄰接、接近、或位于一個(gè)其他染色區(qū)內(nèi)并且第一染色區(qū)即包含DNA的區(qū)域，以及一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的大小在預(yù)定的范圍內(nèi)，則確定可疑病原體存在于樣品中。例如，包含DNA的區(qū)域常常位于對(duì)存在于細(xì)胞質(zhì)中的RNA染色的區(qū)域的附近。

根據(jù)一些其他的實(shí)施方案，如果鑒定了第一染色區(qū)(再次，指示樣品中DNA的存在)且第一染色區(qū)的大小滿足關(guān)于一個(gè)染色區(qū)的大小的預(yù)定的關(guān)系，則確定可疑病原體存在于樣品中。這一標(biāo)準(zhǔn)可以被用于，例如，從細(xì)菌中區(qū)分靶真核寄生物：在真核細(xì)胞中，主要染色DNA的區(qū)域應(yīng)該比染色細(xì)胞質(zhì)的更小，指示不存在于細(xì)菌中的明顯的細(xì)胞核。

根據(jù)還一些實(shí)施方案，如果鑒定了第一染色區(qū)且第一染色區(qū)的維度或面積在與特定病原體或特定病原體的生命周期的特定階段相關(guān)的預(yù)定的值的范圍內(nèi)，則確定可疑病原體的存在。例如，如果病原體是引起瘧疾的病原體(即瘧原蟲屬)，則第一染色區(qū)的面積通常將不低于0.2μm²或高于20μm²或?qū)⒃?.2μm²至20μm²的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，在檢測(cè)瘧原蟲屬時(shí)第一染色區(qū)的面積將不低于0.8μm²或高于13μm²或?qū)⒃?.8μm²至13μm²的范圍內(nèi)。

根據(jù)一些其他實(shí)施方案，如果鑒定了第一染色區(qū)且一個(gè)其他染色區(qū)的面積在與特定病原體或特定病原體的生命周期的特定階段相關(guān)的預(yù)定的值的范圍內(nèi)，則確定樣品中可疑病原體的存在。例如，如果病原體是引起瘧疾的病原體(即瘧原蟲屬)，則其他染色區(qū)例如細(xì)胞質(zhì)的面積通常將不低于0.8μm²或高于65μm²或?qū)⒃?.8μm²至65μm²的范圍內(nèi)。在用于檢測(cè)瘧疾感染的一些實(shí)施方案中，其他染色區(qū)的面積不低于1.6μm²或不超過(guò)40μm²或在1.6μm²至40μm²的范圍內(nèi)。

考慮以上特征，應(yīng)理解，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的一些實(shí)施方案，第一染色區(qū)的特定面積不可超過(guò)一個(gè)其他染色區(qū)的特定面積。類似地，第一染色區(qū)的維度應(yīng)該比其他染色區(qū)的維度統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(例如通過(guò)t-檢驗(yàn))更小。

在一些其他的實(shí)施方案中，如果鑒定了第一染色區(qū)且第一染色區(qū)占據(jù)所有其他染色區(qū)的預(yù)定的％體積，則確定樣品中可疑病原體的存在。例如，當(dāng)提及瘧疾時(shí)，第一染色區(qū)通常將占據(jù)所述一個(gè)其他染色區(qū)的12％至60％之間。

根據(jù)一些其他的實(shí)施方案，如果鑒定了第一染色區(qū)且第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)具有預(yù)定的形狀，則確定樣品中可疑病原體的存在。例如，已知布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)的錐鞭毛體階段具有細(xì)長(zhǎng)的、桿狀的形狀。其他的形狀可包括，不限于此，螺旋形、橢圓形、細(xì)長(zhǎng)的和球形的特性。

根據(jù)一些實(shí)施方案，如果鑒定了第一染色區(qū)且第一染色區(qū)具有高于預(yù)定的閾值的強(qiáng)度的差異性，則確定樣品中可疑病原體的存在。強(qiáng)度的差異性可表現(xiàn)為用第一染色劑染色的多于一個(gè)區(qū)域的簇(cluster)(多個(gè)第一染色區(qū))或?yàn)榫哂蓄伾驘晒獾牟煌幱暗牟灰?guī)則形狀的第一染色區(qū)。這可反映，例如原生動(dòng)物的發(fā)育中的多核階段，諸如瘧原蟲屬的裂殖體。

還此外，根據(jù)一些實(shí)施方案，如果鑒定了第一染色區(qū)且染色的對(duì)象的運(yùn)動(dòng)的模式(方向性和/或速度)符合與可疑病原體相關(guān)的預(yù)定的模式，則確定可疑病原體的存在。例如，當(dāng)考慮布氏錐蟲時(shí)，預(yù)計(jì)其運(yùn)動(dòng)(運(yùn)動(dòng)性)以典型模式發(fā)生。如此，當(dāng)用AO和Hoechst染色劑染色樣品時(shí)，可分析AO染色區(qū)的運(yùn)動(dòng)以證實(shí)與預(yù)計(jì)的模式匹配或預(yù)計(jì)的相關(guān)性。

在還一些其他實(shí)施方案中，如果在染色的對(duì)象的運(yùn)動(dòng)期間，第一染色區(qū)維持在一個(gè)其他染色區(qū)的邊界內(nèi)，則確定可疑病原體的存在。因此，當(dāng)提及具有布氏錐蟲的以上實(shí)例時(shí)，可分析Hoechst染色區(qū)的運(yùn)動(dòng)以確保推定的核在所有時(shí)間保持在移動(dòng)的AO染色區(qū)內(nèi)。

可通過(guò)簡(jiǎn)單觀察樣品確定結(jié)構(gòu)特征，然而在一些實(shí)施方案中，其優(yōu)選地基于樣品的一個(gè)或更多個(gè)光學(xué)圖像被確定。因此，根據(jù)一些實(shí)施方案，方法包括捕獲染色的對(duì)象的至少一個(gè)光學(xué)圖像以及從至少一個(gè)光學(xué)圖像中提取結(jié)構(gòu)特征。

有時(shí)，特別是當(dāng)結(jié)構(gòu)參數(shù)包括染色的對(duì)象的移動(dòng)或運(yùn)動(dòng)時(shí)，捕獲多于一個(gè)的光學(xué)圖像，且基于按時(shí)間的一系列圖像確定移動(dòng)的結(jié)構(gòu)參數(shù)。

不必要陳述，染色的對(duì)象的結(jié)構(gòu)參數(shù)的累積(或收集)的信息越多，樣品中的病原體的確定和鑒定可越精確。

結(jié)構(gòu)參數(shù)可手動(dòng)地，或通過(guò)使用允許自動(dòng)化的專用系統(tǒng)來(lái)分析，且因此，允許相對(duì)快速檢測(cè)和/或鑒定身體樣品中的病原體。分析的結(jié)果可檢索是/否指示病原體的存在、概率性指示病原體的存在，可疑病原體的圖像用于進(jìn)一步分析(手工或自動(dòng)的)和/或可提供更具體的結(jié)果，包括本發(fā)明的病原體的類型、水平等(計(jì)數(shù)/μl)。

自動(dòng)的系統(tǒng)的使用可以是有意義的，不僅用于克服分析樣品中染色的對(duì)象中的人為錯(cuò)誤且節(jié)省時(shí)間和勞動(dòng)力，而且由于身體樣品的某些組分可能不立即染色和/或染色的程度可隨時(shí)間顯著地變化，如有時(shí)用Hoechst33342染色被血液污染的細(xì)胞的情況。因此，圖像特征可取決于如何快速地分析樣品而變化。因此，存在具有允許快速、或甚至幾乎瞬時(shí)成像和分析染色的樣品的自動(dòng)化系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。

因此，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的另外方面，提供了系統(tǒng)，包括：

-圖像采集組件，所述圖像采集組件被配置和可操作以捕獲樣品中的染色區(qū)的至少一個(gè)光學(xué)圖像，染色區(qū)包括主要相應(yīng)于DNA的第一染色區(qū)和相應(yīng)于不同于DNA的至少一個(gè)其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)；

-圖像處理單元，所述圖像處理單元被配置以提取所述至少第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，所述結(jié)構(gòu)特征包括至少所述第一染色區(qū)、和一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的大小；以及第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；以及，如果鑒定了第一染色區(qū)且結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征病原體感染的結(jié)構(gòu)特征，則確定病原體存在于樣品中。

在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)還包括用于提供輸出的輸出單元，該輸出包括指示樣品中可疑病原體的存在或不存在的值或值的組合。

在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)優(yōu)選地是基于計(jì)算機(jī)的，使用儲(chǔ)存于其中并相應(yīng)于除了其他以外，與至少一種限定的病原體相關(guān)的結(jié)構(gòu)特征的參數(shù)的集合。參數(shù)，例如，可包括與病原體相關(guān)的結(jié)構(gòu)特征的預(yù)期的值或值的范圍，或控制執(zhí)行機(jī)器學(xué)習(xí)或數(shù)據(jù)分析算法的參數(shù)。參數(shù)可源自在基于參考樣品，包括預(yù)確定的病原體獲得之前或同時(shí)收集的信息。

參數(shù)還可包括涉及病原體，或感染了病原體的細(xì)胞的行為的信息，諸如運(yùn)動(dòng)性和取決于特定病原體的生命周期的特定階段的特征的變化。

參數(shù)還可包括有關(guān)對(duì)一種類型的身體樣品，例如對(duì)血液樣品檢測(cè)病原體使用的條件的信息，有關(guān)對(duì)特定身體液體使用的一組染料的染色質(zhì)量和差異性、另外的染料組合或條件組合等的統(tǒng)計(jì)學(xué)信息。

在一些實(shí)施方案中，儲(chǔ)存的參數(shù)的集合包括與多種病原體相關(guān)的參數(shù)。在一些實(shí)施方案中，儲(chǔ)存的參數(shù)的集合包括與確定哪一種或更多種病原體可疑相關(guān)的參數(shù)。

在一些實(shí)施方案中，參數(shù)的集合與血液負(fù)荷病原體相關(guān)。在一些其他實(shí)施方案中，參數(shù)的集合與血液寄生物相關(guān)。在一些特定的實(shí)施方案中，參數(shù)的集合與隱匿于人血液的病原體，特別是，引起人類瘧疾的瘧原蟲屬物種，諸如選自由以下組成的組的那些相關(guān)：惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲。

本公開(kāi)內(nèi)容還提供了用于鑒定樣品中的病原體的圖像處理單元，包括：

-輸入模塊，所述輸入模塊被配置和可操作以接收相應(yīng)于樣品中的染色對(duì)象的(圖像)數(shù)據(jù)，該樣品中的染色對(duì)象包括主要相應(yīng)于DNA的至少第一染色區(qū)和相應(yīng)于不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)，以及

-圖像處理單元，所述圖像處理單元被配置和可操作以處理相應(yīng)于染色的對(duì)象的數(shù)據(jù)，處理包括：

-提取染色的對(duì)象中的至少第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，所述結(jié)構(gòu)特征包括以下中的至少一個(gè)：(i)第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的大小和(ii)所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；以及

-如果所述結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征可疑病原體的結(jié)構(gòu)特征，則提供指示樣品中病原體的存在或不存在的值或值的組合。

可使用關(guān)于系統(tǒng)和圖像處理單元的多種操作模式?？墒褂米詣?dòng)以及手動(dòng)和半自動(dòng)的系統(tǒng)。

關(guān)于系統(tǒng)，圖像捕獲組件可以是被配置和可操作以獲取被選擇的染色的對(duì)象的至少一個(gè)光學(xué)圖像的任何裝置，例如CCD或CMOS照相機(jī)。圖像捕獲組件可配備有常規(guī)功能，諸如聚焦功能。圖像捕獲組件還可包括鏡頭、光圈和快門。

圖像捕獲組件提供圖像數(shù)據(jù)用于通過(guò)圖像處理單元處理。在圖像分析的上下文中的圖像數(shù)據(jù)是基于基本覆蓋一個(gè)或更多個(gè)感興趣的區(qū)域(ROI)的像素信息的集合。

通常包括像素信息的圖像數(shù)據(jù)可展示為任何可用格式，包括，不限于此，標(biāo)簽圖像文件格式(TIFF)、聯(lián)合圖像專家組(JPEG)、圖形圖像格式(GIF)、便攜式網(wǎng)絡(luò)圖形(PNG)、便攜式文檔格式(PDF)、位圖(BMP)、和原始圖像傳感器數(shù)據(jù)。圖像數(shù)據(jù)可呈壓縮的數(shù)據(jù)格式或非壓縮的數(shù)據(jù)格式；可涉及任何灰度或色度；可包括位圖數(shù)據(jù)、或包含位圖數(shù)據(jù)的位圖文件的部分。

捕獲一個(gè)或更多個(gè)圖像后，其通過(guò)圖像處理單元來(lái)處理。通過(guò)處理單元的處理被配置和可操作以提供染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征的一個(gè)或更多個(gè)值。換言之，基于圖像分析技術(shù)，確定涉及染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征的各種輸出值，其可允許鑒定樣品中可疑病原體的存在或不存在或評(píng)估其中存在的可能性。值可包括ROI中一個(gè)或更多個(gè)其他染色區(qū)的維度，在染色區(qū)之間的關(guān)系，和/或關(guān)于結(jié)構(gòu)特征的值的平均值、組合或統(tǒng)計(jì)值。在一些實(shí)施方案中，處理可包括，分析相應(yīng)于結(jié)構(gòu)特征的一個(gè)或更多個(gè)值或值的組合，該值或值的組合關(guān)于已被先驗(yàn)確定表征一個(gè)或更多個(gè)病原體，或其間的差異的參數(shù)(例如值或值的范圍或適當(dāng)?shù)臋C(jī)器學(xué)習(xí)權(quán)重)。

圖像分析可基于一個(gè)或更多個(gè)常規(guī)實(shí)踐諸如輪廓檢測(cè)、圖像參數(shù)導(dǎo)數(shù)、形狀檢測(cè)、圖形重建、分割、圖像差分、模式匹配、匹配濾波、機(jī)器學(xué)習(xí)和幾何散列法。

通過(guò)圖像處理單元的數(shù)據(jù)處理可使用分類模塊。分類模塊可裝備有先前對(duì)病原體確定的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)參數(shù)。分類模塊可分析提供的結(jié)構(gòu)特征并推斷一系列被鑒定的可能病原體。通過(guò)說(shuō)明的方式，分類器可鑒定多個(gè)可能的病原體或單一類型的病原體。

在特定的實(shí)施方案中，確定的結(jié)構(gòu)特征與預(yù)期的病原體相關(guān)，且關(guān)于預(yù)定義的參數(shù)分析這些。

應(yīng)該注意，單一病原體的鑒定可以是包括不同特征組合的復(fù)雜過(guò)程。因此，在使用染料的特定組合后確定的結(jié)構(gòu)特征可被用作用于隨后分析染料的進(jìn)一步組合的標(biāo)準(zhǔn)。例如，在先前分析中鑒定的結(jié)構(gòu)特征可被用于繼續(xù)鑒定方法，而聚焦染料的可能的組合的子集。例如，在鑒定病原體的生物學(xué)家族水平中，先前分析的結(jié)果可提供可能的最佳過(guò)濾選擇表以用于下一輪分析。

在一些實(shí)施方案中，可疑病原體的存在、或指示可疑病原體的存在的一個(gè)或更多個(gè)值的圖像分析和確定可利用對(duì)多個(gè)結(jié)構(gòu)特征或相關(guān)的值操作的一個(gè)或更多個(gè)機(jī)器學(xué)習(xí)算法。此類算法包括不限于，支持向量機(jī)(SVM)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、樸素貝葉斯分類器、貝葉斯網(wǎng)絡(luò)、決策樹(shù)、最近鄰居算法(Nearest Neighbor Algorithms)、隨機(jī)森林、Boosting、回歸分析、線性分類器、二次分類器、k-最近鄰居、隱馬爾可夫模型以及其任何組合。一個(gè)或更多個(gè)機(jī)器學(xué)習(xí)算法的結(jié)果可包括一個(gè)或更多個(gè)置信評(píng)分、可能性和/或是/否決定。

如認(rèn)識(shí)到的，在分析中確定的特征越多-鑒定方法越精確。通過(guò)使用多種染料誘導(dǎo)多個(gè)結(jié)構(gòu)特征，錯(cuò)誤檢測(cè)或錯(cuò)誤分類的風(fēng)險(xiǎn)降低。然而，增加的特征還可相應(yīng)于增加的計(jì)算或操作負(fù)荷。一些實(shí)施方案力求平衡增加的特征的增加的好處與相關(guān)負(fù)荷缺點(diǎn)。

基于通過(guò)分析獲得的值或值的組合，通過(guò)處理單元做出關(guān)于樣品中病原體的存在或不存在，包括，有時(shí)，樣品中病原體的類型(定性鑒定)和/或病原體的量(定量鑒定)的各種決定。

處理單元還配置為與輸出單元進(jìn)行通信。因此，基于通過(guò)處理單元確定的結(jié)構(gòu)特征的一個(gè)或更多個(gè)輸出值，指示獲得的圖像中至少一個(gè)病原體的存在或不存在，并且在一些實(shí)施方案中，病原體的類型的一個(gè)或更多個(gè)輸出信號(hào)通過(guò)輸出單元來(lái)提供。

輸出可以以任何可接受的形式來(lái)提供，包括，在控制單元的監(jiān)視器上顯示的圖表、圖形或文本，打印輸出，作為語(yǔ)音信息，或用戶的智能手機(jī)顯示，用于從處理功用接收處理的數(shù)據(jù)并使用列表、表格、圖表等展示涉及確定病原體感染的存在和任選地其身份的獲得的結(jié)構(gòu)特征和/或相關(guān)的值的信息。監(jiān)視器可與打印機(jī)相連以打印輸出。

處理單元還可包括用戶界面模塊，例如鍵盤、或觸摸屏，用于允許從業(yè)者進(jìn)行本發(fā)明的一些實(shí)施方案的方法以控制系統(tǒng)的操作，包括，除了其他以外，關(guān)于檢查的身體液體來(lái)源、日期、地點(diǎn)等)，操作系統(tǒng)的條件、使用的染料的類型、將拍攝圖像的數(shù)量、圖像之間的時(shí)間間隔等的輸入數(shù)據(jù)。

有時(shí)，圖像分析還可包括在樣品的染色的程度的基礎(chǔ)上調(diào)整或標(biāo)準(zhǔn)化圖像亮度。這些可基于，例如鑒定圖像或一組圖像中一種或更多種最亮和/或最昏暗的像素值(例如，相應(yīng)于特定樣品)，最亮和/或最昏暗區(qū)域的平均亮度，和/或圖像直方圖。此類特征可從代表性圖像(不必是被標(biāo)準(zhǔn)化的圖像)或從多個(gè)圖像的統(tǒng)計(jì)分析中提取。用于標(biāo)準(zhǔn)化的特征可基于單一或多個(gè)圖像，所述單一或多個(gè)圖像可使用不同激發(fā)波長(zhǎng)捕獲(如AO在不同的發(fā)光波長(zhǎng)下提供不同的顏色)。

圖像亮度還可使用其他控制手段，諸如圖像捕獲組件曝光時(shí)間和/或發(fā)光的亮度來(lái)調(diào)整。

此外，操作系統(tǒng)的條件可允許定時(shí)圖像采集，例如允許與一種或更多種染料的足夠的溫育時(shí)間以及以激發(fā)和/或發(fā)射波長(zhǎng)的不同光學(xué)配置操作，以在各種顏色或熒光光譜下成像染色的樣品。

為了以各種顏色或熒光光譜成像染色的樣品，可通過(guò)轉(zhuǎn)換照明的顏色實(shí)現(xiàn)激發(fā)中的變化。這可，例如，通過(guò)提供兩種或更多種光源(例如對(duì)于AO，365nm下的UV LED照明燈以及475nm下的藍(lán)色LED照明燈)以及其光學(xué)上組合它們(例如，使用分色鏡或光柵)來(lái)進(jìn)行。

在另一個(gè)實(shí)例中，單一照明光源(例如365nm下的UV LED照明燈)可被用于同時(shí)激發(fā)兩種染料，且將一種或更多種光學(xué)濾波器移進(jìn)或移出光路以選擇相關(guān)的發(fā)射波長(zhǎng)。其他染料組可使用如此處描述的相同入射光同時(shí)激發(fā)，即使一種或更多種染料非最佳地被激發(fā)。作為一個(gè)實(shí)例，AO可類似地連同Hoechst著色劑、DAPI和DRAQ著色劑被共激發(fā)。

在又另一個(gè)實(shí)例中，單一照明光源(例如365nm下的UV LED照明燈)可被用于同時(shí)激發(fā)兩種或更多種染料，且發(fā)射光路被分開(kāi)使得在兩個(gè)或更多個(gè)圖像捕獲組件上捕獲兩種或更多種發(fā)射。

在又另一個(gè)實(shí)例中，彩色圖像傳感器被用于同時(shí)捕獲兩種或更多種熒光信號(hào)。彩色圖像傳感器的使用可，例如，排除對(duì)被移進(jìn)或移出光路以選擇相關(guān)波長(zhǎng)的一個(gè)或更多個(gè)光學(xué)濾波器的需要。

在本公開(kāi)內(nèi)容的上下文中，可使用各種照明光源，這些包括，不限于此，提供白光(如明亮光顯微鏡)、UV光、藍(lán)光、綠光、黃光、紅光、其組合的那些，或適合于激發(fā)用于染色的一種或更多種染料的任何光。

系統(tǒng)的組件，即圖像捕獲組件、處理單元、輸出單元等，可直接彼此連接(例如通過(guò)導(dǎo)線直接地)或一個(gè)或更多個(gè)組件可遠(yuǎn)離一個(gè)或更多個(gè)其他組件。例如，圖像捕獲裝置可在內(nèi)部網(wǎng)或互聯(lián)網(wǎng)上發(fā)送數(shù)據(jù)至處理單元，以允許在遠(yuǎn)程位置進(jìn)行處理。

可被用于進(jìn)行本公開(kāi)內(nèi)容的方法的系統(tǒng)的實(shí)例描述于PCT專利申請(qǐng)公布號(hào)WO 2012/090198中，其內(nèi)容通過(guò)引用以其整體并入本文。

處理單元通?？赏ㄟ^(guò)運(yùn)行進(jìn)行輸入數(shù)據(jù)的分析和存儲(chǔ)的指令的專用程序(例如軟件應(yīng)用程序)來(lái)操作。軟件應(yīng)用程序可在機(jī)器可讀的程序存儲(chǔ)裝置，諸如CD或存儲(chǔ)磁盤中來(lái)實(shí)現(xiàn)。

根據(jù)上述，本發(fā)明還提供了機(jī)器可讀的程序存儲(chǔ)裝置，所述程序存儲(chǔ)裝置可觸知地實(shí)現(xiàn)由機(jī)器可執(zhí)行的指令的程序以進(jìn)行本文公開(kāi)的方法，即檢測(cè)樣品中病原體感染的方法，方法包括：

-用兩種或更多種染料染色所述液體樣品，所述兩種或更多種染料提供至少DNA和不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分的差別染色；

-鑒定主要相應(yīng)于DNA的至少第一染色區(qū)和相應(yīng)于至少一種其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)；

-提取至少第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，所述結(jié)構(gòu)特征包括第一和一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的至少大小和所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；

-如果所述結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征病原體感染的結(jié)構(gòu)特征，則確定指示樣品中病原體的存在的值或值的組合。

又此外，本公開(kāi)內(nèi)容提供了計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，包括計(jì)算機(jī)可用介質(zhì)，所述計(jì)算機(jī)可用介質(zhì)在其中具有實(shí)現(xiàn)的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼，所述計(jì)算機(jī)可讀程序代碼用于在以兩種或更多種染料染色的身體樣品中檢測(cè)身體樣品中的病原體感染，計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品包括：

-導(dǎo)致計(jì)算機(jī)鑒定身體樣品內(nèi)的染色的對(duì)象的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼；

-導(dǎo)致計(jì)算機(jī)鑒定染色的對(duì)象中主要相應(yīng)于DNA的至少第一染色區(qū)和相應(yīng)于不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分的至少一個(gè)其他染色區(qū)的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼；

-導(dǎo)致計(jì)算機(jī)提取至少第一染色區(qū)和一個(gè)其他染色區(qū)的結(jié)構(gòu)特征的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼，所述結(jié)構(gòu)特征包括第一和一個(gè)其他染色區(qū)的至少一個(gè)的至少大小和所述第一染色區(qū)和所述一個(gè)其他染色區(qū)關(guān)于彼此的位置；

-導(dǎo)致計(jì)算機(jī)如果所述結(jié)構(gòu)特征符合預(yù)定為表征病原體感染的結(jié)構(gòu)特征，則確定指示樣品中可疑病原體的存在的值或值的組合的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼。

最后，本公開(kāi)內(nèi)容提供了試劑盒，包括：

-第一染料，所述第一染料主要染色DNA；

-第二染料，所述第二染料用于染色不同于DNA的至少一種其他細(xì)胞組分；

-說(shuō)明書，所述說(shuō)明書用于所述第一染料和第二染料用于確定身體樣品中可疑病原體的存在的使用。

根據(jù)該方面，第一和第二染料可在單一組合物或在包含該第一染料的第一組合物以及包含該第二染料的第二組合物中來(lái)提供。除了染料之外，第一和第二組合物還各自包含，在用各自的染料染色身體樣品時(shí)適合使用的載體。

本文中公開(kāi)的試劑盒被用于進(jìn)行本文中公開(kāi)的方法的步驟和條件的每一個(gè)。

在一些實(shí)施方案中，第一染料包括Hoechst染料。在一些實(shí)施方案中，第二染料包括吖啶橙。

在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括用于為身體樣品以50:1至1:1之間的范圍比提供第一染料和第二染料的說(shuō)明書。

在一些實(shí)施方案中，第一染料包括Hoechst染料，特別是Hoechst 33342且第二染料包括AO，第一染料的濃度在3μg/mL和250μg/mL之間的范圍內(nèi)；且AO的濃度在0.2μg/mL和125μg/mL之間的范圍內(nèi)。

在一些其他實(shí)施方案中，第一染料包括Hoechst染料，特別是Hoechst33342且第二染料包括AO，Hoechst 33342的濃度為約10μg/mL；且AO的濃度為約1.5μg/mL。

在一些實(shí)施方案中，第一染料和第二染料可與適合的緩沖液，諸如，不限于此，包含1％Tris-EDTA緩沖液、4.5％DDW和92.5％鹽水的緩沖液組合。

不希望受理論束縛，AO/Hoechst染色提供更穩(wěn)健并穩(wěn)定的染色是可能的，這使得染色的樣品的快速和有效的機(jī)器視覺(jué)(machine vision)。這允許成像比在顯微鏡下可用常規(guī)方法檢查更大量的血液，這反而在低寄生物下提供較高的靈敏度。(另外或替代地)分析的一個(gè)或更多個(gè)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)提供不取決于人為因素的可靠的結(jié)果也是可能的。

本公開(kāi)內(nèi)容的一些實(shí)施方案現(xiàn)將以根據(jù)公開(kāi)的方法進(jìn)行的非限制性實(shí)施例的以下說(shuō)明來(lái)例證。應(yīng)理解這些實(shí)施例旨在是說(shuō)明性質(zhì)的而非限制性的。顯然，根據(jù)以上教導(dǎo)，這些實(shí)施例的許多修改和變化是可能的。因此，可以理解，在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，除了如下文具體地描述外，本發(fā)明可以以無(wú)數(shù)可能的方式不同地被實(shí)踐。

一些非限制性實(shí)施例的描述

血液樣品中的瘧原蟲的檢測(cè)

獲自被鑒定為具有瘧疾感染的人受試者的血液樣品用包含2μg/ml吖啶橙、15μg/ml Hoechst 33342、1％Tris-EDTA緩沖液、4.5％DDW和92.5％鹽水的染色溶液來(lái)染色。

染色后，將樣品使用不同顏色的照明成像，使用365nm下的UV LED光成像AO染色，且使用475nm下的藍(lán)色LED光成像Hoechst染色)。將樣品還在明視場(chǎng)(用白色光照射)中成像。

所得到的圖像提供于圖1A-1F中，圖1A-1F獲自白細(xì)胞樣品，且圖1D-1F獲自瘧疾感染的紅細(xì)胞樣品。

具體地，圖1A顯示了明亮光場(chǎng)圖像，其顯示了白細(xì)胞的邊界(由圖1A中的箭頭所示的膜)，和DNA染色區(qū)(圖1B中的箭頭)以及其他組分染色區(qū)(在本情況下是由圖1C中箭頭所示的細(xì)胞質(zhì))具有對(duì)白細(xì)胞是典型的維度(DNA和RNA兩者染色比瘧原蟲寄生物典型的更大)。

然而，圖1D-1F顯示了，第一染色區(qū)(DNA，由圖1E箭頭所示)和第二染色區(qū)(RNA，圖1F中的白點(diǎn))比細(xì)胞的邊界(如由圖1D中的箭頭所示)小得多，指示無(wú)核紅細(xì)胞的感染。

特別地，在未感染的樣品中，未獲得相應(yīng)于圖1E和圖1F中顯示的那些的染色區(qū)。

這些結(jié)果顯示，通過(guò)用至少兩種染料染色，一種主要染色DNA(在這種特定情況下是Hoechst 33342)，鑒定紅細(xì)胞中的瘧原蟲感染是可能的。

檢測(cè)的置信水平

在本研究中，200個(gè)血液樣品的組根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案來(lái)測(cè)試。使用基于標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡方法學(xué)的姬姆薩染色確定了這些血液樣品中的100個(gè)為瘧疾陽(yáng)性，且確定100個(gè)為陰性。200個(gè)樣品的每個(gè)的重復(fù)用具有在測(cè)試的樣品中2μg/ml吖啶橙和15μg/ml Hoechst 33342的終濃度的染料溶液來(lái)染色，并且然后使用自動(dòng)化機(jī)器視覺(jué)在光場(chǎng)、UV光和藍(lán)光下進(jìn)行分析，基本上如以上描述的。這些結(jié)果顯示，在常規(guī)方法下被鑒定為感染的樣品的多于97％使用AO/Hoechst染色也鑒定為如此。使用常規(guī)姬姆薩染色認(rèn)為健康的100個(gè)樣品中，93個(gè)使用AO/Hoechst染色被證實(shí)，但七個(gè)樣品被鑒定為感染。然后使用姬姆薩試劑再一次分析這七個(gè)(通過(guò)以來(lái)自相同供體的新樣品重復(fù)染色和顯微鏡檢查兩者，或通過(guò)引起陰性結(jié)果的原來(lái)的制備物的進(jìn)一步顯微鏡檢查)。在所有七個(gè)病例中，證實(shí)確實(shí)其被感染，但表面上以低于1,000個(gè)寄生物/μl的低寄生物血癥。

以上顯示了，本文公開(kāi)的方法不僅允許以高置信水平(97％以上)檢測(cè)(即使由機(jī)器視覺(jué))感染，而且還允許在寄生物計(jì)數(shù)為很低(低寄生物血癥)，甚至低于1,000個(gè)寄生物/μl，或低于500個(gè)寄生物/μl以及甚至以20個(gè)寄生物/μl時(shí)檢測(cè)感染。