本發(fā)明屬結(jié)核病診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種區(qū)分活動性及潛伏性結(jié)核感染的試劑盒。

背景技術(shù)：

結(jié)核病是當(dāng)今全球面臨的主要公共健康問題之一，它的病原體是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)，屬分枝桿菌屬。近年來，由于耐藥結(jié)核病、人類免疫缺陷病毒(HIV)合并結(jié)核分枝桿菌感染、大規(guī)模人口流動等問題的出現(xiàn)，結(jié)核病疫情出現(xiàn)加重的趨勢。目前，全球每年約有900萬人發(fā)展成活動性結(jié)核，200萬～300萬人死于結(jié)核病。據(jù)估計，目前全世界約有1/3的人口感染了Mtb，其中絕大多數(shù)為潛伏性結(jié)核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)，即機體的免疫系統(tǒng)能夠控制結(jié)核桿菌的復(fù)制而不發(fā)展成為結(jié)核病，但又不能將其徹底清除的狀態(tài)。此時結(jié)核桿菌處于潛伏狀態(tài)，在在免疫力低下者中，結(jié)核桿菌能夠重新復(fù)制，發(fā)展成為活動性肺結(jié)核從而成為新的傳染源。感染者終生約有5％～10％的風(fēng)險發(fā)展成為活動性結(jié)核病，若同時伴有HIV的感染，這種概率則高達每年10％，遠高于HIV陰性者。流行病學(xué)調(diào)查顯示約有85％～90％新診斷的活動性肺結(jié)核系結(jié)核菌素試驗陽性的LTBI演變而來。因此，對LTBI者的進行早期診斷和預(yù)防性治療，既能夠減少已感染結(jié)核桿菌者的發(fā)病機會，又可以通過影響發(fā)病，來減少結(jié)核桿菌在人群中的傳播。

自1976年Hassau等建立用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測抗結(jié)核分支桿菌抗體的方法以來，結(jié)核病的血清學(xué)診斷方法得到飛速發(fā)展，技術(shù)日益成熟，并得到了越來越廣泛的應(yīng)用。血清學(xué)診斷具有快速、簡便、低廉且不需要活細胞等優(yōu)點。這些年來，在血清學(xué)診斷抗原方面的研究已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進步，確認了幾個很有希望的血清學(xué)抗原，如38kDa,Lipoarabinomannan(LAM)，16kDa(Rv2031c),MTB81(Rv1837c),ESAT-6(Rv3875),Antigen 85B(Rv1886c),Antigen60以及選取不同蛋白的融合蛋白等.目前已有數(shù)種商品化的結(jié)核血清學(xué)診斷試劑盒，包括應(yīng)用結(jié)核抗原Antigen 60的Anda-TB檢測(Anda Biologicals，Strasbourg,France)，應(yīng)用LAM及38kDa抗原的Pathozyme Myco及應(yīng)用38kDa和16kD抗原的Pathozyme TB Complex Plus(Omega Diganostics,Allo,Scotland,UK)及應(yīng)用LAM抗原的MycoDot(Blackstone,Massachusetts,USA)。對現(xiàn)有商品化試劑盒的meta分析表明,無論是在肺結(jié)核還是肺結(jié)核的診斷中，現(xiàn)有的商品化血清學(xué)檢測方法均未達到理想的診斷效果。因此，發(fā)現(xiàn)新的血清學(xué)診斷抗原標(biāo)志物，并建立新的結(jié)核病免疫診斷方法以及相應(yīng)的試劑盒是結(jié)核病診斷所急需的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的一種特異性和敏感性俱佳的結(jié)核快速檢測試劑及相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明的檢測試劑盒檢測只需要單份血清樣品，化驗簡單、快速、不需要專業(yè)實驗室設(shè)備，成本低廉。

為了實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供的技術(shù)措施包括：

本發(fā)明首先公開了一種用于區(qū)分活動性及潛伏性結(jié)核感染的檢測抗原Rv0189c抗原。該抗原是由結(jié)核分枝桿菌基因Rv1985c所編碼的蛋白。結(jié)核桿菌Rv1985c蛋白包含575個氨基酸，分子量59.4kDa。該蛋白具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

本發(fā)明所述的Rv0189c抗原能夠制備結(jié)核性血清學(xué)診斷試劑，用于區(qū)分活動性及潛伏性結(jié)核感染。

本發(fā)明的再一個目的是提供一種快速檢測結(jié)核病的診斷試劑盒。它包含上述重組蛋白Rv0189c和Rv0189c抗體的陽性對照試劑，這類試劑可以是含Rv1985c陽性抗體的動物血清或通過雜交瘤細胞培育出的Rv1985c單克隆抗體。如待測者體液中抗體的滴度超過了陽性對照試劑，則判定為陽性。

本發(fā)明涉及的試劑盒中，除了有重組抗原Rv0189c和其特異性抗體外，還應(yīng)用用于檢測的各種試劑和器具，包括各種緩沖液、稀釋液、反應(yīng)液和終止液。

本發(fā)明中所述的蛋白除了通常所指的一種氨基酸聚合物，還應(yīng)該包括其類似物如多肽。多肽可與上述蛋白序列同源，這個類似物能夠與蛋白同樣結(jié)合到相同的抗體分子上，且類似物中處于等價位置上的氨基酸與原始肽中的那些抗原序列相同或保守。

本發(fā)明所述的蛋白和多肽可以通過天然分離獲得，也可以通過人工合成。一種具有代表性的方法是用較長的融合蛋白制備上述肽段，次融合蛋白包含上述代表性的肽段序列。所述肽也可由多肽經(jīng)過物理或化學(xué)裂解所產(chǎn)生。

本發(fā)明中所涉及的可用于檢測的免疫反應(yīng)包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked ImmunosorbentAssay,ELISA)，免疫沉淀實驗，免疫凝集實驗，免疫熒光實驗，膠體金免疫層析法等。

在本發(fā)明中，采用多孔塑料或聚酯板作為反應(yīng)界面，由于抗原蛋白可以與之非特異性結(jié)合，樣本中的抗原特異性抗體能夠與包被Rv0189c抗原的多孔板相互作用，形成的抗原抗體復(fù)合物與酶聯(lián)的第二抗體進行反應(yīng)，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，加入底物后產(chǎn)生帶有顏色的產(chǎn)物，在檢測儀上測得增加的光吸收值。

本發(fā)明的另一重要目的是提供一種快速檢測并區(qū)分活動性及潛伏性結(jié)核感染的方法，即本發(fā)明的試劑盒的使用方法，主要包括以下步驟:

a)使用Rv0189c抗原包被96孔板或其他吸附蛋白介質(zhì)；

b)采集待測樣品，通常是受試者的血清，稀釋一定倍數(shù)；

c)將稀釋后樣品加入介質(zhì)中與Rv0189c反應(yīng)；

d)加入酶聯(lián)或膠體金等染料偶聯(lián)試劑，該試劑能與Rv0189c抗原抗體復(fù)合物特異反應(yīng)。典型的試劑如:酶聯(lián)Rv0189c多膚，Protein A，抗IgG,IgM二抗等；

e)直接顯色或加入顯色劑顯色；

f)肉眼或儀器讀取顏色的改變，以超過一定域值的顏色改變判定為陽性檢測。

值得注意的是，該方法至少使用Rv0189c一種抗原用于檢測相應(yīng)抗體，但不局限于該種抗原。與其他有較高診斷價值的結(jié)核抗原，如LAM,38kDa,30kDa,16KDa,A60等抗原一起使用，可以提高檢測的陽性檢出率。

本發(fā)明提供了一種特異性和敏感性俱佳的結(jié)核快速檢測試劑，可應(yīng)用受試者的血液或體液標(biāo)本進行檢測，并區(qū)分活動性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染，具有較高臨床應(yīng)用價值。本發(fā)明的檢測只需要單份血清樣品，化驗簡單、快速、不需要專業(yè)實驗室設(shè)備，成本低廉，當(dāng)天可得到結(jié)果，非常適合基層地區(qū)大規(guī)模的結(jié)核感染檢測。

附圖說明

圖1為活動性結(jié)核患者(ATB)和潛伏性結(jié)核感染者(LTBI)血清樣本中Rv0189c特異性IgG抗體的檢測含量。

圖2為血清樣本中Rv0189c特異性IgG抗體診斷活動性結(jié)核患者(ATB)和潛伏性結(jié)核感染者(LTBI)的受試者工作曲線(ROC曲線)。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。

實施例1.重組Rv0189c抗原作為檢測試劑用于區(qū)分活動性及潛伏性結(jié)核感染

1.收集臨床標(biāo)本

(1)病史資料采集：

采用問卷調(diào)查表形式，由?？漆t(yī)務(wù)人員分別調(diào)查入選病例的性別、年齡、BCG接種史、既往結(jié)核病病史、近期活動性結(jié)核密切接觸史、慢性風(fēng)濕性疾病診斷、入組前3個月免疫抑制劑治療情況等相關(guān)病史。對排除新發(fā)活動性結(jié)核、慢性風(fēng)濕性疾病及HIV感染可能，無免疫抑制劑治療史及既往結(jié)核病史的26例健康對照者收集其性別、年齡、BCG接種史等基本情況。入組時對所有研究對象均拍攝胸片以排除新發(fā)活動性結(jié)核，并記錄有無陳舊性肺結(jié)核病灶或其他非正常影像學(xué)表現(xiàn)。

(2)活動性結(jié)核病人及潛伏性結(jié)核感染者的入選：

活動性結(jié)核組(ATB group)：入選活動性結(jié)核患者28例，要求入選者年齡在18歲以上，HIV(-)，排除腫瘤、自身免疫性疾病及其他慢性感染(如慢性HBV/HCV感染等)；且尚未接受抗結(jié)核治療。潛伏性結(jié)核組(LTBI group)：在活動性肺結(jié)核患者的家庭接觸者中篩選LTBI者，入選34例。要求結(jié)核特異QuantiFERON或T-SPOT.TB檢測為陽性。所有入選者簽署知情同意書。抽取入選者的外周血，同時記錄相關(guān)臨床資料。

(3)標(biāo)本采集與處理：

每個入選研究對象用肝素抗凝的真空采血管采集外周血4ml。血漿標(biāo)本為將全血200g，離心15min，吸取上清，保存在凍存管內(nèi)，-80℃凍存

2.使用重組蛋白Rv0189c制備區(qū)分活動性及潛伏性結(jié)核感染的診斷試劑盒

(1)利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測活動性結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者

兩組人群血清標(biāo)本中IgG的免疫應(yīng)答。

具體檢測步驟為

1)包被：抗原為100ul/孔，濃度為5ug/ml；

2)洗板：PBST 300ul/孔，3min，洗3次；

3)封閉：1％BSA/PBS，300ul/孔，37℃孵育1h；

4)洗板：PBST 300ul/孔，3min，洗3次；

5)加入稀釋的待測血清(除Rv1985c IgG 1：500稀釋，其他均以1：100稀釋)，100ul/孔，37℃孵育1h；

6)洗板：PBST 300ul/孔，5min，洗5次；

7)加酶標(biāo)二抗：加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(1:2000稀釋)100ul/孔，37℃孵育1h；

8)洗板：PBST 300ul/孔，5min，洗5次；

9)顯色：加入現(xiàn)配的底物溶液100ul/孔，37℃30min；

10)終止：2M H₂SO₄，50ul/孔；

11)測定：492nm，670nm，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值。

(2)統(tǒng)計方法

對于Rv0189c抗原的ELISA結(jié)果，以健康對照者血清的平均OD值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)方差作為判定閾值，若大于此閾值，即判斷為陽性，反之則為陰性。采用單尾ANOVA測試對三組人群之間OD值的差異進行統(tǒng)計分析。

3.檢測結(jié)果

在實施例中，有四種商品化診斷試劑盒作為對照，分別為The PATHOZYME-MYCO IgG(Myco G),The PATHOZYME TB complex plus(TB complex),The IBL M.tuberculosis IgG ELISA(IBL)和The Anda Biologicals TB(Anda-TB)試劑盒。他們被作為一種血清學(xué)診斷對照方法與我們研究的Rv0189c抗原作比較。

結(jié)果表明，Rv0189c特異性的IgG抗體水平在活動性結(jié)核病人中顯著高于潛伏性結(jié)核感染組(p<0.001)(圖1)。應(yīng)用ROC分析，可以得到它的曲線下面積AUC為0.8213，得到最佳診斷閾值為157U/ml(圖2)。在這一閾值下，Rv0189c抗原在活動性及潛伏性結(jié)核感染組中的陽性率分別為62.4％和11.6％(表1)。Rv0189c抗原作為標(biāo)志物區(qū)分活動及潛伏性結(jié)核感染的敏感性為62.4％，特異性為88.4％。盡管Rv0189c抗原蛋白單獨用于區(qū)分活動性及潛伏性結(jié)核診斷，其診斷的準(zhǔn)確性有不足，但如果與其它血清學(xué)診斷試劑盒如Anda-TB或TB complex聯(lián)用，能夠明顯的提高診斷效果。如Rv0189c聯(lián)合TB complex試劑盒，其敏感性可達82.7％，特異性為87.4。

表1.Rv0189c蛋白區(qū)分活動性及潛伏性結(jié)核感染的敏感性和特異性

通過上述實施例的7組對比實驗?zāi)軌蛑?，Rv0189c蛋白區(qū)分活動性及潛伏性結(jié)核感染的敏感性明顯優(yōu)于四組對照試劑，同時特異性也較好。Rv0189c蛋白作為結(jié)核快速檢測試劑，可應(yīng)用受試者的血液或體液標(biāo)本進行檢測，并區(qū)分活動性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染，具有較高臨床應(yīng)用價值。本發(fā)明的檢測只需要單份血清樣品，化驗簡單、快速、不需要專業(yè)實驗室設(shè)備，成本低廉，當(dāng)天可得到結(jié)果，非常適合基層地區(qū)大規(guī)模的結(jié)核感染檢測。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

<110> 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院

<120> 一種區(qū)分活動性及潛伏性結(jié)核感染的試劑盒

<160> 1

<210> 1

<211> 575

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Pro Gln Thr Thr Asp Glu Ala Ala Ser Val Ser Thr Val Ala Asp

1 5 10 15

Ile Lys Pro Arg Ser Arg Asp Val Thr Asp Gly Leu Glu Lys Ala Ala

20 25 30

Ala Arg Gly Met Leu Arg Ala Val Gly Met Asp Asp Glu Asp Phe Ala

35 40 45

Lys Pro Gln Ile Gly Val Ala Ser Ser Trp Asn Glu Ile Thr Pro Cys

50 55 60

Asn Leu Ser Leu Asp Arg Leu Ala Asn Ala Val Lys Glu Gly Val Phe

65 70 75 80

Ser Ala Gly Gly Tyr Pro Leu Glu Phe Gly Thr Ile Ser Val Ser Asp

85 90 95

Gly Ile Ser Met Gly His Glu Gly Met His Phe Ser Leu Val Ser Arg

100 105 110

Glu Val Ile Ala Asp Ser Val Glu Val Val Met Gln Ala Glu Arg Leu

115 120 125

Asp Gly Ser Val Leu Leu Ala Gly Cys Asp Lys Ser Leu Pro Gly Met

130 135 140

Leu Met Ala Ala Ala Arg Leu Asp Leu Ala Ala Val Phe Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Gly Ser Ile Leu Pro Gly Arg Ala Lys Leu Ser Asp Gly Ser Glu Arg

165 170 175

Asp Val Thr Ile Ile Asp Ala Phe Glu Ala Val Gly Ala Cys Ser Arg

180 185 190

Gly Leu Met Ser Arg Ala Asp Val Asp Ala Ile Glu Arg Ala Ile Cys

195 200 205

Pro Gly Glu Gly Ala Cys Gly Gly Met Tyr Thr Ala Asn Thr Met Ala

210 215 220

Ser Ala Ala Glu Ala Leu Gly Met Ser Leu Pro Gly Ser Ala Ala Pro

225 230 235 240

Pro Ala Thr Asp Arg Arg Arg Asp Gly Phe Ala Arg Arg Ser Gly Gln

245 250 255

Ala Val Val Glu Leu Leu Arg Arg Gly Ile Thr Ala Arg Asp Ile Leu

260 265 270

Thr Lys Glu Ala Phe Glu Asn Ala Ile Ala Val Val Met Ala Phe Gly

275 280 285

Gly Ser Thr Asn Ala Val Leu His Leu Leu Ala Ile Ala His Glu Ala

290 295 300

Asn Val Ala Leu Ser Leu Gln Asp Phe Ser Arg Ile Gly Ser Gly Val

305 310 315 320

Pro His Leu Ala Asp Val Lys Pro Phe Gly Arg His Val Met Ser Asp

325 330 335

Val Asp His Ile Gly Gly Val Pro Val Val Met Lys Ala Leu Leu Asp

340 345 350

Ala Gly Leu Leu His Gly Asp Cys Leu Thr Val Thr Gly His Thr Met

355 360 365

Ala Glu Asn Leu Ala Ala Ile Thr Pro Pro Asp Pro Asp Gly Lys Val

370 375 380

Leu Arg Ala Leu Ala Asn Pro Ile His Pro Ser Gly Gly Ile Thr Ile

385 390 395 400

Leu His Gly Ser Leu Ala Pro Glu Gly Ala Val Val Lys Thr Ala Gly

405 410 415

Phe Asp Ser Asp Val Phe Glu Gly Thr Ala Arg Val Phe Asp Gly Glu

420 425 430

Arg Ala Ala Leu Asp Ala Leu Glu Asp Gly Thr Ile Thr Val Gly Asp

435 440 445

Ala Val Val Ile Arg Tyr Glu Gly Pro Lys Gly Gly Pro Gly Met Arg

450 455 460

Glu Met Leu Ala Ile Thr Gly Ala Ile Lys Gly Ala Gly Leu Gly Lys

465 470 475 480

Asp Val Leu Leu Leu Thr Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Thr Thr Gly

485 490 495

Leu Cys Val Gly His Ile Ala Pro Glu Ala Val Asp Gly Gly Pro Ile

500 505 510

Ala Leu Leu Arg Asn Gly Asp Arg Ile Arg Leu Asp Val Ala Gly Arg

515 520 525

Val Leu Asp Val Leu Ala Asp Pro Ala Glu Phe Ala Ser Arg Gln Gln

530 535 540

Asp Phe Ser Pro Pro Pro Pro Arg Tyr Thr Thr Gly Val Leu Ser Lys

545 550 555 560

Tyr Val Lys Leu Val Ser Ser Ala Ala Val Gly Ala Val Cys Gly

565 570 575