本發(fā)明屬于生物檢測領域，具體涉及一種acpa陰性的ra診斷標志物及其應用。
背景技術(shù)：
：類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,ra)是一種慢性的自身免疫性疾病，主要是以引起全身多處小關(guān)節(jié)局部滑膜的炎癥反應，進而造成關(guān)節(jié)局部的骨質(zhì)破壞為一組臨床表現(xiàn)的疾病。在發(fā)展中國家，類風濕性關(guān)節(jié)炎影響了近0.5％-1％左右的人群?？傮w來說，ra在女性中的發(fā)病率要高于男性，在老年人中的發(fā)病率要高于年輕人。類風濕性關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)差異很大，可以是輕微癥狀的自限性疾病，也可以是快速進展的炎癥伴關(guān)節(jié)破壞及嚴重身體殘疾。由于疾病表現(xiàn)的差異性，人們制定了分類標準作為疾病定義、標準化臨床試驗入選人群選擇以及多中心研究比較的基礎。因此1987誕生了由年美國風濕病學會(acr)制定的ra的分類標準。但在實際應用過程中，由于該分類標準對于關(guān)節(jié)炎的定義要求嚴格，致使它對于ra診斷的敏感性不高，有相當一部分早期的ra并沒有從中被識別出來。但同時，尤為重要的是新發(fā)ra病例有可能從早期的有效干預中獲益，以避免進展為慢性、侵蝕狀態(tài)ra，進一步導致殘疾，影響長期生活質(zhì)量，增加疾病死亡率。因此，對于類風濕性關(guān)節(jié)炎來說，早期的診斷和治療是阻止不可逆性關(guān)節(jié)破壞的關(guān)鍵。于是2009年，acr/eular標準更新，該標準診斷ra的敏感性較高，能夠在疾病早期診斷ra并進行治療，缺點是特異性較差。在2009年最新的ra的分類標準中，血清中acpa(抗瓜氨酸多肽抗體)的陽性被納入診斷標準。這一抗瓜氨酸化的蛋白抗體被認為是類風濕性關(guān)節(jié)炎的血清特異性的標志物，它的出現(xiàn)也增加了我們對ra發(fā)病機制的理解。但是直至現(xiàn)在，ra的確切病因仍然未知，環(huán)境因素和遺傳因素被公認為是引起ra臨床癥狀的“扳機”。同時，臨床上也存在著一類acpa抗體陰性的ra患者，并且隨著研究者對疾病的認識不斷加深，他們逐漸認識到acpa抗體陽性的ra患者和acpa抗體陰性的ra患者存在一定的臨床異質(zhì)性。但是由于目前臨床上對于acpa抗體陰性的ra患者缺乏特異性的生物標志物，這使得這類患者的診斷難度大大增加。ra患者的血清中發(fā)現(xiàn)自身抗體已經(jīng)超過70年。類風濕因子以人類igg的fc片段為靶點，是發(fā)現(xiàn)的第一組自身抗體，包括igg和igm等各類亞型。遺憾的是rf并不是針對ra的特異性抗體，在其他自身免疫病和高齡人群中也會有rf的出現(xiàn)。更重要的是，在高達15％的健康人群中也可以檢測到rf。隨著研究的深入，1964年和1979年，人們分別發(fā)現(xiàn)了ra患者中存在的其它抗體，即抗核周因子抗體(apf)和抗角蛋白抗體(aka)。盡管這兩種抗體對診斷ra的特異性很高，但這些自身抗體很難測到。因此，在日常實踐中，rf仍被輔助用于ra的診斷。為此，rf陽性被納入1987年acr的ra標準。直到1995年人們才發(fā)現(xiàn)抗核周蛋白和抗角蛋白抗體是相同的自身抗體，它們共同的靶點都來自精氨酸殘基的去亞胺化所形成的的瓜氨酸殘基。于是，2002年通過研發(fā)瓜氨酸化肽(ccp)-2技術(shù)出現(xiàn)了首個測定acpa的商業(yè)化測試，使acpa能夠作為ra常規(guī)檢查的生物標志物。對這個獨特的自身抗體系統(tǒng)進行深入研究，加深了人們對ra的理解和分類，因此，rf和acpa都成為acr/eular2010分類標準的一部分。最近，有文獻報道了ra患者血清識別氨基甲?；鞍?抗carp)的新的自身抗體亞型。這個抗體系統(tǒng)獨立于acpa，因為ra患者的血清抗體能夠區(qū)分瓜氨酸化和氨基甲酰化抗原。相應的，有相當部分acpa陰性患者存在抗carp抗體。在過去的數(shù)年，由于ra特異性針對瓜氨酸化蛋白和氨基甲?；鞍鬃陨砜贵w的發(fā)現(xiàn)，人們對ra的發(fā)病及病因?qū)W有了深入的認識。氨基甲?；凸习彼峄际欠g后修飾，分別引起蛋白氨基甲?；凸习彼峄箮д姾傻陌被釣橹行园被崴娲?。瓜氨酸化蛋白由pad酶產(chǎn)生，而氨基甲?；鞍资前被豳嚢彼嵬ㄟ^化學反應轉(zhuǎn)化為高瓜氨酸。瓜氨酸和高瓜氨酸在化學結(jié)構(gòu)上相似，但位于蛋白質(zhì)的不同位點，因為精氨酸和賴氨酸在不同的部位。而且，高瓜氨酸只是多了一個甲酰基。盡管一些抗體對兩種結(jié)構(gòu)都有反應性，但有些抗carp抗體對瓜氨酸不產(chǎn)生反應，同樣，一些抗瓜氨酸抗體也對carp不產(chǎn)生反應。2009年auger等人用含有8268個蛋白的芯片篩選acpa陰性的ra病人，成功篩選出pad4和braf兩個候選標志物。以涉及蛋白質(zhì)瓜氨酸化的酶為靶點的抗pad抗體受到很多關(guān)注，因為人們發(fā)現(xiàn)這些抗體不只是與靶點結(jié)合，還對pad有激活作用。它能夠通過降低該瓜氨酸化酶鈣的需要量從而增加pad4的催化能力。charpinc等人通過研究發(fā)現(xiàn)：ra病人體內(nèi)存在著抗braf催化結(jié)構(gòu)域的抗體，主要集中在416位到766位的氨基酸序列上，而且這一抗體存在于30％的acpa陰性的ra患者中。同時，抗braf抗體陽性的ra病人中有高達33％的病人是acpa陰性的。4％的as患者和6％的健康對照中也存在該自身抗體。如前所述，ra是一種慢性的自身免疫性疾病，自身抗體標記物的檢測在疾病的診斷中具有重要作用。ra以臨床表現(xiàn)差異大為特征，可以是輕度自限性疾病，也可能是快速進展性炎癥、關(guān)節(jié)破壞及嚴重的功能殘疾。ra臨床特征的差異導致患者治療反應的極大差別。目前，我們沒辦法預測某項特定治療對特定患者的療效，因為我們?nèi)狈a患者進行分組的高效能生物標志物。血清標志物acpa的發(fā)現(xiàn)有著深遠的影響，因為這是首次可以根據(jù)血清標志物對ra不同的疾病特征進行分組。但acpa陽性和acpa陰性的ra患者在疾病的遺傳學和環(huán)境決定因素、受累關(guān)節(jié)的分子特征、緩解率以及最重要的對治療的應答率方面都存在著顯著差異。對于很多acpa陰性的ra患者，能夠進行亞組區(qū)分的靶點有限，主要示由于缺乏強有力的生物標志物對ra的臨床表現(xiàn)進行區(qū)分。因此鑒定更多的尤其是acpa陰性的自身抗體可能有助于揭示ra的發(fā)病機制，特別是自身抗體在其中的作用。由于在發(fā)展中國家ra的發(fā)病率一直居高不下，中國也是罹患ra一大國家，加之ra的致殘率，因此早期正確的識別ra非常重要。鑒定更多acpa陰性的ra相關(guān)的自身抗體標記物和一些能夠預測病情活動度和療效的自身抗原，對于降低ra的致殘率十分重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明提供acpa陰性的ra診斷標志物及其應用。本發(fā)明提供的acpa陰性的ra診斷標志物為dohh(deoxyhypusinedioxygenase，脫氧輔蛋白雙加氧酶)，page5(pantigenfamilymember5，p抗原家族蛋白5)，dusp11(dualspecificityproteinphosphatase11，雙特異性蛋白磷酸酶11)和ptx3(pentaxin-relatedprotein，pentaxin相關(guān)蛋白3)。本發(fā)明還提供dohh、page5、dusp11、ptx3或它們的片段在制備用于診斷acpa陰性的ra的試劑中的用途。其中，所述診斷包括：測定獲自呈現(xiàn)acpa陰性的ra的患者的生物樣品中對dohh、page5、dusp11、ptx3或它們的片段的反應性的抗體的水平；任選地，與對照數(shù)據(jù)比較所述生物樣品中抗體的水平，其中相對于所述對照數(shù)據(jù)所述樣品中對dohh、page5、dusp11或ptx3為反應性的抗體的可檢測的提高表明患acpa陰性的ra的可能性。其中，所述生物樣品為血清樣品。其中，dohh、page5、dusp11或ptx3的抗體水平通過以下步驟來測量，包括：a.使來自患者的生物樣品與dohh、page5、dusp11、ptx3或它們的片段接觸；b.在生物樣品中存在的抗體與dohh、page5、dusp11、ptx3或它們的片段之間形成抗體-蛋白質(zhì)復合物；c.洗滌來除去任何未結(jié)合的抗體；d.添加被標記的并且對來自生物樣品的抗體為反應性的檢測抗體；e.洗滌來除去任何未結(jié)合的被標記的所述檢測抗體；和f.將所述檢測抗體的標記物轉(zhuǎn)化為可檢測信號；其中可檢測信號的存在表明所述患者中存在抗dohh、page5、dusp11或ptx3的抗體。其中，所述的dohh、page5、dusp11、ptx3或它們的片段沉積或固定在固相支持物上。其中，所述支持物是乳膠珠子、多孔平板或膜條的形式。其中，所述檢測抗體通過共價連接到酶、具有熒光化合物或金屬的標記物、或具有化學發(fā)光化合物的標記物來標記。本發(fā)明還提供一種用于鑒定來自患者的樣品中對dohh、page5、dusp11、ptx3或它們的片段，或它們的組合為反應性的抗體的存在或水平的設備，包括：a.至少一種dohh、page5、dusp11、ptx3或它們的片段，或它們的組合；和b.至少一種固相支持物，其中所述dohh、page5、dusp11、ptx3或它們的片段，或它們的組合沉積在所述支持物上。本發(fā)明所述的設備，進一步包括檢測抗體，其中所述檢測抗體特異于所述患者的樣品中對dohh、page5、dusp11、ptx3或它們的片段，或它們的組合為反應性的抗體，并且所述檢測抗體產(chǎn)生可檢測信號。其中，所述患者的樣品為血清樣品。本發(fā)明通過高密度蛋白質(zhì)芯片與ra血清雜交篩選到特異性達到90％，敏感度大于25％的35個抗原作為候選acpa陰性的ra自身抗原，7種蛋白質(zhì)為候選預測疾病活動度的自身抗原，6種蛋白質(zhì)為候選預測治療效果的自身抗原(其中有在2種蛋白質(zhì)候選抗原在不同組的分析中重復出現(xiàn))。為了驗證這些自身抗原的敏感度和特異性，構(gòu)建了包含46個候選ra自身抗原的蛋白質(zhì)芯片。然后通過大樣本血清(9份oa血清、38份sle血清、39份as血清、18份bd血清、10份anca血清、21份ss血清及102份健康人，290份ra血清)與自身抗原芯片雜交。通過數(shù)據(jù)分析，共鑒定到4種蛋白質(zhì)抗原在ra的acpa陰性的血清中具有較高的靈敏度和特異度，均為新發(fā)現(xiàn)的自身抗原，它們是dohh,dusp11,ptx3,page5，其中dohh作為診斷標志物的敏感性達49.66％，ptx3作為診斷標志物的敏感性達43.54％。7種候選預測疾病活動度的自身抗原中，有1種自身抗原能夠成功區(qū)分ra的中低度活動與高度活動，它是：rrn3，auc達0.65，有2種自身抗原能夠成功區(qū)分acpa陽性的ra的中低度活動與高度活動，它們是：rrn3和plekhg2，auc分別達0.845和0.817。6種候選預測疾病療效的自身抗原中，有1種自身抗原，erh，能夠成功判斷ra對藥物治療的效果，其預測療效的auc可達0.733。附圖說明圖1：蛋白質(zhì)芯片的質(zhì)控檢測。圖2：gst檢測蛋白質(zhì)芯片上所有重組蛋白質(zhì)探針平行點之間的相關(guān)性。圖3：小樣本血清與高密度蛋白質(zhì)芯片雜交局部效果圖。圖4：blank和empty的信號強度在蛋白質(zhì)芯片上的分布。圖5：ptx3等在ra病人和健康對照及疾病對照組中的信號分布。圖6：rrn3在不同病情活動度的ra中信號強度分布。圖7：rrn3等2種抗原在不同病情活動度的acpa陽性的ra中信號強度分布圖8：erh在不同療效的ra病人中信號強度分布圖及auc曲線。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。血清樣本(血清樣本收集及相關(guān)臨床檢測均由北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科完成)本課題研究共使用647份血清，包括：350份來自ra確診患者的血清，平均年齡±標準差：45.2±12.5；9份骨關(guān)節(jié)炎血清(osteoarthritis,oa)，平均年齡±標準差：67.2±16.6；48份系統(tǒng)性紅斑狼瘡血清(systemiclupuserythematosus，sle)，平均年齡±標準差：36.8±12.4；28份白塞氏病血清(behcet’sdisease，bd)，平均年齡±標準差：54.2±20.7；10份anca相關(guān)性血管炎血清(anti-neutrophilcytoplasmicantibodies,anca)，平均年齡±標準差：46.9±16.3；39份強直性脊柱炎血清(ankylosing-spondylitis,as)，平均年齡±標準差：38.2±15.1；21份干燥綜合癥血清(sjogrensyndrome,ss)，平均年齡±標準差：52.7±13.2；10份大動脈炎血清(takayasuarteritis，ta)，平均年齡±標準差：38.4±13.5；132份健康人血清，平均年齡±標準差：37.5±12.1；ra的診斷按照2010年acr/eular確立的標準，oa,sle,bd,anca,as,ss和ta亦分別滿足各自的診斷和/或分類標準。所有血清由北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科自2006年至2014年收集，所有疾病血清均來自臨床確診患者，診斷有爭議的患者至少通過了臨床三名主任醫(yī)師的會診后確定診斷。所有ra血清均進行了血清相應抗體的檢測，包括ana3項：ana-if(免疫熒光法)，dna-if(免疫熒光法)和ds-dna(elisa法)的檢測，抗ccp抗體即acpa檢測(>25iu/ml定義為陽性)，rf檢測，aka和apf檢測，mcv檢測，gpi檢測。所有抗ccp抗體和/或抗aka,apf,mcv抗體陰性的ra患者均滿足ra滑膜炎的b超或核磁的診斷標準。本試驗得到了北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會的審核批準。實施例1高密度蛋白質(zhì)芯片篩選候選ra自身抗原高密度蛋白質(zhì)芯片以及含目的基因序列的釀酒酵母表達重組質(zhì)粒由美國約翰·霍普金斯大學朱衡教授實驗室提供。每張高密度蛋白質(zhì)芯片上含有48個微矩陣(block)，每個微矩陣包含992個探針點，呈32*31的陣列排列，芯片上每種蛋白質(zhì)探針有2個平行點。該蛋白質(zhì)芯片包含21827種非冗余重組人源蛋白質(zhì)。重組蛋白質(zhì)來自釀酒酵母宿主表達的相應基因全長開放閱讀框(openreadingframe，orf)，其n端具有谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶(glutathiones-transferase，gst)標簽。使用小鼠抗gst單克隆抗體與芯片雜交驗證芯片質(zhì)量，當芯片上每兩個重復的蛋白點的熒光信號值的相關(guān)性達到97％以上時，認為芯片上每兩點的可重復性好。每張高密度蛋白質(zhì)芯片上共計47616個蛋白點(包括陽性對照點和陰性對照點；每種蛋白抗原具有兩個平行點)。其中包括21827種非冗余重組人源蛋白質(zhì)。每張芯片上所有蛋白共組成48個微陣列(block)，每個微陣列呈32*31的陣列排列。由于所有重組蛋白質(zhì)探針的n端均帶有g(shù)st標簽，因此采用小鼠抗gst單克隆抗體進行檢測芯片上所有探針，確保用于血清篩選的芯片上絕大多數(shù)重組蛋白質(zhì)能被檢測到且同一探針的兩平行點之間具有較高的平行性。如圖1所示，芯片上檢測到的gst標簽陽性點為紅色(信號飽和時顯示為白色)。每張蛋白質(zhì)芯片上有48個block，每個block中所有蛋白探針以32*31的陣列排列，每種探針由左右兩個平行點組成。每張芯片上含有21827種非冗余組蛋白質(zhì)及其他對照探針。所有重組蛋白均帶有g(shù)st標簽。a和c分別顯示小鼠抗gst單克隆抗體檢測結(jié)果的整體效果圖和單個block的樣圖；b顯示芯片上所有探針點的信噪比分布圖。當兩個平行探針點的信噪比(snr)均大于3時即認為芯片上該探針點可被檢測。根據(jù)這一標準，96.8％的蛋白質(zhì)可被檢測到(圖2)。實施例2高密度蛋白質(zhì)芯片與ra及對照組血清雜交選取60份ra血清及60份對照血清(10份白塞氏病血清，10份大動脈炎血清，10份sle血清和30份健康人血清)與120張芯片雜交，通過信號采集及數(shù)據(jù)分析鑒定候選ra自身抗原。用pe-cy5標記的抗人igg抗體檢測血清中自身抗體與相應自身抗原探針的反應。圖3所示為高密度蛋白質(zhì)芯片與血清反應后的代表性局部圖像結(jié)果，方框內(nèi)為差異的蛋白質(zhì)抗原探針。a、c、e、g顯示的是四份ra血清與芯片雜交的示意圖。b、d、f、h顯示的是四份對照組血清(包括健康對照和疾病對照)與芯片雜交的示意圖。i圖是治療有效的ra的示意圖，j圖是治療無效的ra的示意圖。a、b圖方框中兩個平行點蛋白質(zhì)探針為dohh；c、d圖方框中探針為dusp11；e、f圖方框中探針為ptx3；g、h圖方框內(nèi)探針為page5,i、j圖方框內(nèi)探針為erh?？傮w來說，無論是ra血清，還是疾病對照組(bd,sle,ta)和健康人血清，都只能識別芯片上很少比例的蛋白質(zhì)。即使正常對照血清反應的芯片也出現(xiàn)了多個可探測到的陽性信號，說明健康人體內(nèi)也會出現(xiàn)自身抗體，只是這些自身抗體不會引起疾病而已。掃描得到每張芯片的熒光信號圖，將該圖與芯片的模板文件即gail文件同時拖到genepixpro6.0軟件中進行一一對應。然后將genepixpro6.0軟件采集到的每張芯片上所有探針的信號信息轉(zhuǎn)化并導入excel表格中。每個探針點的前景信號強度(f635median)分別除以其周圍背景信號強度(b635median)作為該點的信號值。即iij＝f635median/b635median(iij代表blockj中的蛋白質(zhì)i點的信號值)。蛋白質(zhì)抗原探針的信號值越趨近于1，說明血清中相應的自身抗體越無法檢測到。信號值越高說明自身抗體的結(jié)合靶標蛋白質(zhì)抗原探針的能力越強。為了消除不同芯片及同一芯片上不同空間對雜交造成的差異，芯片數(shù)據(jù)的處理采用芯片內(nèi)歸一化(within-chipnormalization)的方法對每張芯片上的信號進行歸一化。即假設芯片內(nèi)所有靶標蛋白是隨機點制到基片上的，且只有很少部分(小于5％)的靶標蛋白質(zhì)作為自身抗原被血清中相應的靶標自身抗體識別而被檢測到，因此芯片上信號的分布是隨機的，不同block之間是一致的。本研究設定每個block中的所有探針點信號值的中位值為1，以此來歸一化芯片上不同block內(nèi)探針點的信號值。即(median(ij)代表blockj中所有點信號值的中位值，代表歸一化后的blockj中的蛋白質(zhì)i點的信號值)。在此基礎上，根據(jù)hus,xiez,onishia,yux,jiangl,linj,rhohs,woodardc,wangh,jeongjs,longs,hex,wadeh,blackshaws,qianj,zhuh.profilingthehumanprotein-dnainteractomerevealserk2asatranscriptionalrepressorofinterferonsignaling.cell2009；139:610-622中記載的方法設定cutoff值判斷芯片上所有探針點是否為陽性。即計算整張芯片上所有點信號值的均值iaverage，以及所有信號值小于1的信號值的標準差sd，以iaverage+5sd為cutoff值，來判斷芯片上的探針點是否為陽性。然后統(tǒng)計每份血清與芯片上各蛋白質(zhì)抗原探針免疫反應陽性的信息，利用非參數(shù)檢驗卡方檢驗(chi-squaretest，x2)或fisher精確檢驗(fisherexacttest)確定候選ra自身抗原。在篩選acpa陰性的ra候選標志物時，將特異性達到90％，敏感度不小于25％的抗原作為候選的ra自身抗原；在篩選預測疾病活動度和療效的候選標志物時，若經(jīng)卡方檢驗或fisher精確檢驗后的p<0.05，則該標志物被納入為候選標志物。通過數(shù)據(jù)分析確定芯片上的候選的感興趣的目標自身抗原。對于芯片上的蛋白質(zhì)探針是否為ra特異性自身抗原，或是否為病情相關(guān)或療效相關(guān)的自身抗原，利用x2檢驗或fisher精確檢驗確定蛋白質(zhì)為ra中acpa陰性的特異反應的靶標蛋白質(zhì)抗原。本發(fā)明將特異性達到90％，敏感度大于25％的35個抗原作為候選acpa陰性的ra自身抗原，7種蛋白質(zhì)為候選預測疾病活動度的自身抗原，6種蛋白質(zhì)為候選預測治療效果的自身抗原(其中有在2種蛋白質(zhì)候選抗原在不同組的分析中重復出現(xiàn))，詳細信息見表1。表1-2小樣本血清與高密度蛋白質(zhì)芯片雜交篩選到7個候選預測疾病活動度的自身抗原表1-3小樣本血清與高密度蛋白質(zhì)芯片雜交篩選到6個候選預測疾病療效的自身抗原實施例3ra自身抗原蛋白質(zhì)芯片的構(gòu)建與血清篩選驗證通過分析高密度蛋白質(zhì)芯片與小樣本血清雜交結(jié)果共篩選到46個候選ra自身抗原。為了驗證這些自身抗原的特異性和敏感度，本發(fā)明制備了低探針密度的ra自身抗原蛋白質(zhì)芯片。表2為ra自身抗原蛋白質(zhì)芯片上的各探針的微陣列布局。芯片上的探針包括大芯片篩選到的46個候選ra自身抗原以及5個對照ighg1探針。表2ra自身抗原蛋白質(zhì)芯片上的各探針的微陣列布局ak2ighg1ndatp13a5ndtbc1d19rab35ubxn10rab3daph1atnfaip1hdac4arl2bprai14rrn3polr3berhndrg1blankblankblankblankblankgarssugt1ighg1nol3zscan20lsp1rgccemptypage5fgf12fam84adohhnecab1ndel1dusp11pdcd2mylkstk24mettl21cighg1stk3babam1dgkkptx3ppfia4emptyspanxn2ighg1chac2rnf183atxn10ighg1emptychst11plekhg2snx33blankra自身抗原蛋白質(zhì)芯片上所有51個探針都具有重復的雙點。每張基片上共點制14個微陣列，在血清與芯片的雜交反應前，用圍欄將每一個微陣列隔離開，這樣每一個微陣列都形成一個獨立的空間，因此每張芯片可同時檢測14份血清。與ra自身抗原芯片雜交的大樣本血清包括290份ra血清及237份對照血清(9份oa血清、38份sle血清、39份as血清、18份bd血清、10份anca血清、21份ss血清及102份健康人血清)。利用genepixpro6.0軟件采集ra自身抗原蛋白質(zhì)芯片雜交結(jié)果中探針點的信息，每個探針點的前景值除去背景值即為芯片上該探針點的信號強度。取每個探針的兩個平行點雜交信號的平均值為該探針與血清雜交的信號值并用于進一步分析。采用陰性對照孔蛋白信號對此次實驗做一個評估檢測。在制備的含46個ra自身抗原的蛋白質(zhì)芯片上含有陰性對照蛋白孔，包括6個人blank(空白對照)和3個empty(陰性對照)，利用陰性對照孔蛋白的平均信號強度值來進行蛋白質(zhì)芯片的質(zhì)量評估。如圖4所示，將每張芯片的每個block上的陰性對照蛋白信號強度值分別提取，做一信號強度值的頻率分布圖?？梢杂^察到，blank和empty的信號強度基本都圍繞在1左右，表明該點的前景值與背景值幾乎相同，說明這些由這些芯片提取的蛋白信號強度值都是可靠合理的。首先對acpa陰性的ra病人和健康對照及疾病對照的數(shù)據(jù)進行卡方檢驗或fisher精確檢驗，每個診斷標志物蛋白可以得到tscore，pvalue等參數(shù)；其次對于每個蛋白，選取1000個不同的cutoff值，根據(jù)每個cutoff值可以計算靈敏度，特異性，用這1000個點(1-specificity，sensitivity)繪制roc曲線，并計算auc，靈敏度和特異性之和最高的那個點所對應的cutoff值為最優(yōu)的cutoff。結(jié)果如表3和圖5所示，在與大樣本血清雜交反應的結(jié)果中，4種蛋白質(zhì)抗原與acpa陰性的ra血清免疫反應的敏感性大于25％，同時也具有區(qū)別于健康對照和疾病對照的特異性，它們分別是dohh(deoxyhypusinedioxygenase，敏感性為49.66％)，page5(pantigenfamilymember5，敏感性為72.79％)，dusp11(dualspecificityproteinphosphatase11，敏感性為53.06％)和ptx3(pentaxin-relatedproteinptx3，敏感性為43.54％)。圖5中所示為這兩種蛋白標志物在ra病人和健康對照及疾病對照組中的信號分布圖，可以觀察到ra病人中這種自身抗體的表達高于對照組。表3dohh等4種蛋白在ra中cutoff值及對應的aucnametscorepvaluefdr(bh)qvaluefoldchangeauccutoffspecificitysensitivitypage5-3.499146.00e-040.0050560.0014381.111343490.6275251.8303430.4874370.727891ptx3-3.372166.00e-040.0050560.0014381.130179410.5947422.1048850.7437190.435374dohh-2.233770.0205960.0506320.013371.080831190.5992212.028120.6934670.496599dusp11-1.798632.00e-040.0029490.0010381.242437010.6124842.1120030.6683420.530612實施例4新發(fā)現(xiàn)的預測疾病活動度的抗原在ra自身抗原蛋白芯片中的分析首先對中低活動度和高度活動的兩組ra病人的數(shù)據(jù)進行t檢驗，每個與預測疾病活動度相關(guān)的蛋白可以得到tscore，pvalue等參數(shù)；其次對于每個蛋白，選取1000個不同的cutoff值，根據(jù)每個cutoff值可以計算靈敏度，特異性，用這1000個點(1-specificity，sensitivity)繪制roc曲線，并計算auc，靈敏度和特異性之和最高的那個點所對應的cutoff值為最優(yōu)的cutoff。結(jié)果如表4及圖6所示，當rrn3這種蛋白取相對應的最佳cutoff值1.55時，其對應的auc最大，為0.65。圖6中所示為蛋白標志物在中低活動度病人和高度活動病人中的信號分布圖，可以觀察到高度活動的病人中這種自身抗原的表達都高于中低活動度的病人。表4rrn3在不同病情活動度的ra中cutoff值及對應的auc對各臨床亞組進行進一步的分析發(fā)現(xiàn)，在acpa陽性的ra病人亞組中，除rrn3外，另一蛋白抗原plekhg2也能很好的區(qū)分不同病情活動度的病人，但這一預測價值僅限于在acpa陽性的ra病人中(表5，圖7)。對acpa陰性的ra病人亞組分析，沒有新的發(fā)現(xiàn)。當?shù)鞍卓乖璻rn3和plekhg2的信號cutoff值分別取1.548和1.172時，其所對應的auc分別為0.845和0.817，具有非常好的臨床預測價值。表5rrn3等2種抗原在不同病情活動度的acpa陽性的ra中cutoff值及對應的auc實施例5新發(fā)現(xiàn)的預測疾病療效的抗原在ra自身抗原蛋白芯片中的分析對治療有效和治療無效的兩組ra病人的數(shù)據(jù)進行t檢驗，每個與預測疾病療效相關(guān)的蛋白可以得到tscore，pvalue等參數(shù)；其次對于每個蛋白，選取1000個不同的cutoff值，根據(jù)每個cutoff值可以計算靈敏度，特異性，用這1000個點(1-specificity，sensitivity)繪制roc曲線，并計算auc，靈敏度和特異性之和最高的那個點所對應的cutoff值為最優(yōu)的cutoff。結(jié)果如表6及圖8所示，當erh取相對應的最佳cutoff值1.201時，其對應的auc最大，為0.733。圖8中所示為該蛋白在治療有效病人和治療無效的病人中的信號分布，可以觀察到治療有效的病人中這種自身抗原的表達明顯高于治療無效的病人。表6erh在不同療效的ra病人中cutoff值及對應的auc以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術(shù)領域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁12