本發(fā)明涉及生物技術(shù)分析檢測領(lǐng)域，尤其是一種血紅蛋白的檢測方法及血紅蛋白檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

現(xiàn)階段，血紅蛋白的檢測方法包括：硫酸銅滴定法進行血紅蛋白測定，或者采用進口大型生化分析儀進行測定。前者存在自行配制誤差大、易受環(huán)境溫度影響等缺點,后者儀器價格昂貴,測試成本高。國外常用的測試方法為試劑盒和干式生化分析法,試劑盒法需要大型生化分析儀,干式生化分析法產(chǎn)品主要有德國的Re-flotronⅣ型全血干式生化分析儀和瑞典的SWELAB血液分析儀,采用的均是波長比色法,所需采血量較大,測試時間長,成本高。

免疫層析膠體金技術(shù)的優(yōu)點是微創(chuàng)取樣，取樣量少，成本低，檢測快，準確度高，適用于現(xiàn)場及家庭檢測，而目前市場上未出現(xiàn)免疫層析技術(shù)檢測血紅蛋白含量的產(chǎn)品，其技術(shù)難點在于血紅蛋白雙抗體夾心存在HOOK效應(yīng)，因此目前免疫層析雙抗體技術(shù)還是主要集中在潛血，隱血的檢測項目中。

Hook效應(yīng)是指在雙位點夾心免疫試驗中，其劑量反應(yīng)曲線的高劑量區(qū)段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀，此現(xiàn)象稱之為HOOK效應(yīng)。目前對于血紅蛋白的免疫學檢測，一般需要多步稀釋才能使其處于線性范圍內(nèi)，但這樣造成的誤差勢必會加大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種血紅蛋白的檢測方法。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種實現(xiàn)上述檢測方法的血紅蛋白檢測試劑盒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種血紅蛋白的檢測方法，采用免疫夾心法進行檢測，具體步驟如下：標記有膠體金顆粒的第一抗體結(jié)合血液中釋放的血紅蛋白后，借助毛細作用力向前層析，層析至硝酸纖維素膜包被的第二抗體(即固相載體)時，形成“膠體金顆粒-抗體-抗原-抗體”的復合體系，并且聚集于硝酸纖維素膜上，膠體金顆粒大量聚集時可形成紫紅色的信號，通過儀器能夠準確定量判讀檢測信號的強度，從而實現(xiàn)定量檢測,所述第一抗體為抗人血紅蛋白抗體，第二抗體為配對的血紅蛋白抗體，所述第一抗體和第二抗體可同時結(jié)合于目標抗原的不同表位，從而形成復合體系。

在低劑量范圍內(nèi)，隨著血紅蛋白含量增多，檢測信號增強，呈正相關(guān)性，當樣本中血紅蛋白超過一定量時，便不可避免的發(fā)生HOOK效應(yīng)，即隨著血紅蛋白濃度的增加，檢測信號遞減，在一定范圍呈負相關(guān)性。

一種實現(xiàn)上述檢測方法的血紅蛋白檢測試劑盒，包括由血紅蛋白檢測試紙、外置卡殼、樣本裂解液以及內(nèi)設(shè)了相應(yīng)標準曲線和判定方法的IC卡，其中，

所述血紅蛋白檢測試紙，寬度為3-5mm，長度為7-8cm，所述檢測試紙由含有膠體金標記的抗人血紅蛋白抗體的膠體金墊、包被有T線和C線(即包被有配對的血紅蛋白抗體和抗鼠IgG)的硝酸纖維素膜(NC膜，為多孔結(jié)構(gòu)膜，孔徑為8-15um)、樣品墊、吸樣墊和塑料底板組成，所述T線為配對的血紅蛋白抗體，C線為抗鼠IgG，所述抗人血紅蛋白抗體作為第一抗體標記有膠體金顆粒，樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊從塑料底板一端依次排列至另一端；

所述外置卡殼，包含上蓋和下蓋，兩條所述血紅蛋白檢測試紙平行放置于所述下蓋內(nèi)部，所述上蓋對應(yīng)樣品墊部分設(shè)置有樣品孔，用于加入樣本和 稀釋液，上蓋對應(yīng)硝酸纖維素膜中部位置設(shè)置有視窗口，用于觀察硝酸纖維素膜上的C線、T線，判定結(jié)果。

所述樣本裂解液，主要配方為：0.02M Tris-HCL，0.15molNaCL，1％Triton100調(diào)節(jié)PH至7.4。

所述IC卡，內(nèi)置了標準曲線和判定方法，標準曲線通過多次試驗結(jié)果繪制得到,該IC卡配套使用NS3001B型免疫層析結(jié)果判讀記錄儀(天津中新科炬生物制藥有限公司產(chǎn)品)使用，用于對檢測結(jié)果的定量判定，具體來說,血紅蛋白試紙判讀測定得到信號值,利用IC卡將信號值與濃度值進行轉(zhuǎn)換從而得到濃度值,對血紅蛋白檢測范圍為50-250g/L。

優(yōu)選的，上述血紅蛋白檢測試劑盒，所述吸樣墊為吸水濾紙。

優(yōu)選的，上述血紅蛋白檢測試劑盒，所述包被有配對抗體的硝酸纖維素膜的制備方法為：以0.01M pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)將配對的血紅蛋白抗體配制成終濃度1-2mg/mL，將噴膜儀在硝酸纖維素膜上以1.2-1.4ul/cm的參數(shù)進行劃線，包被T線，同時在硝酸纖維素膜上部包被1-2mg/ml的抗鼠IgG，作為C線，干燥，備用。

優(yōu)選的，上述血紅蛋白檢測試劑盒，所述膠體金墊的制備方法為：取100ml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0.2M K₂CO₃調(diào)至pH7.0-8.0，再加入1-2mg標記用血紅蛋白抗體，室溫攪拌1小時，封閉，12000rpm離心30分鐘，棄上清，用工作液復溶至60ml，然后用噴金機分別均勻地噴涂在無紡布或玻纖上，干燥備用。

試紙盒裝配方法為：在相對濕度小于30％的條件下，取塑料底板，將已包被血紅蛋白配對抗體的NC膜粘貼在底板的中部，在NC膜T線一側(cè)粘貼膠體金墊，在膠體金墊另一側(cè)粘貼樣品墊；在NC膜C線一側(cè)粘貼吸樣墊；各粘貼組分接口相互疊壓1-2mm，粘貼好的大板切成3-5mm寬的試紙條。然后將試紙條分別放置于塑料卡殼下蓋的槽中，然后蓋上上蓋，壓緊，形成試紙盒。

上述血紅蛋白檢測試劑盒的操作方法為：檢測時將10ul的血液樣本加入到1ml樣本裂解液中，混勻，等待2分鐘，從樣本裂解液中取100μL加入血紅蛋白檢測試劑卡中的加樣端，在15-20分鐘內(nèi)，用NS3001B型免疫層析結(jié)果判讀記錄儀對檢測結(jié)果進行判定。

本發(fā)明的有益效果是：

所述血紅蛋白檢測試劑盒及方法，用來檢測人全血樣本中的血紅蛋白含量,具有操作簡便、反應(yīng)快速、結(jié)果準確、可信、適合現(xiàn)場檢測等優(yōu)點。利用樣本中血紅蛋白濃度達到一定量(1g/L)時，會形成HOOK效應(yīng)，隨著濃度繼續(xù)增高，HOOK效應(yīng)增強，形成反向抑制效應(yīng)，反向抑制效應(yīng)在一定范圍呈規(guī)律遞增，通過研究血紅蛋白雙抗體夾心HOOK效應(yīng)的“鉤狀”區(qū)域，優(yōu)化樣本稀釋，創(chuàng)新突破了免疫層析技術(shù)因HOOK效應(yīng)而無法直接檢測的難點，從而準確快速的檢測血紅蛋白的含量，彌補該領(lǐng)域的空缺，為現(xiàn)場檢測及家庭檢測提供便捷；所述檢測方法通過一步稀釋并裂解血液樣本法，良好的控制了在人體可獲得范圍內(nèi)(50-250g/L)血紅蛋白含量在HOOK效應(yīng)區(qū)呈良好的劑量曲線規(guī)律，將50-250g/L進行l(wèi)ogistic四參數(shù)曲線擬合，求得線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)|r|值良好。

附圖說明

圖1為血紅蛋白含量與檢測信號值劑量關(guān)系計量曲線圖；

圖2為血紅蛋白含量與檢測信號值劑量關(guān)系線性分析圖(1-250g/L)；

圖3為血紅蛋白含量與檢測信號值劑量關(guān)系線性分析圖(50-250g/L)圖；

圖4為血紅蛋白檢測試紙的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中，1-膠體金墊 2-T線 3-C線 4-硝酸纖維素膜 5-樣品墊 6-吸樣墊；

圖5為外置卡殼的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中，S-上蓋 A-樣品孔 B-視窗口。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進一步的說明。

實施例1

一種實現(xiàn)上述檢測方法的血紅蛋白檢測試劑盒，包括由血紅蛋白檢測試紙(如圖4所示)、外置卡殼(如圖5所示)、樣本裂解液以及內(nèi)設(shè)了相應(yīng)標準曲線和判定方法的IC卡，其中，

所述血紅蛋白檢測試紙，寬度為3-5mm，長度為7-8cm，所述檢測試紙由含有膠體金標記的抗人血紅蛋白抗體的膠體金墊1、包被有T線2和C線3(即包被有配對的血紅蛋白抗體和抗鼠IgG)的硝酸纖維素膜4(NC膜，為多孔結(jié)構(gòu)膜，孔徑為8-15um)、樣品墊5、吸樣墊6和塑料底板(圖略)組成，所述T線為配對的血紅蛋白抗體，C線為抗鼠IgG，所述抗人血紅蛋白抗體作為第一抗體標記有膠體金顆粒，樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊從塑料底板一端依次排列至另一端，其中，

所述吸樣墊為吸水濾紙，

所述硝酸纖維素膜包被有配對抗體的的方法為：以0.01M pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)將配對的血紅蛋白抗體配制成終濃度1-2mg/mL，將噴膜儀在硝酸纖維素膜上以1.2-1.4ul/cm的參數(shù)進行劃線，包被T線，同時在硝酸纖維素膜上部包被1-2mg/ml的抗鼠IgG，作為C線，干燥，備用，

所述膠體金墊的制備方法為：取100ml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0.2M K₂CO₃調(diào)至pH7.0-8.0，再加入1-2mg標記用血紅蛋白抗體，室溫攪拌1小時，封閉，12000rpm離心30分鐘，棄上清，用工作液復溶至60ml，然后用噴金機分別均勻地噴涂在無紡布(也可以是玻纖)上，干燥備用；

所述外置卡殼，包含上蓋S和下蓋(圖略)，兩條所述血紅蛋白檢測試紙平行放置于所述下蓋內(nèi)部，所述上蓋對應(yīng)樣品墊部分設(shè)置有樣品孔A，用于加入樣本和稀釋液，上蓋對應(yīng)硝酸纖維素膜中部位置設(shè)置有視窗口B，用于觀察硝酸纖維素膜上的C線、T線，判定結(jié)果。

所述樣本裂解液，主要配方為：0.02M Tris-HCL，0.15molNaCL， 1％Triton100調(diào)節(jié)PH至7.4。

所述IC卡，內(nèi)置了標準曲線和判定方法，標準曲線通過多次試驗結(jié)果繪制得到,該IC卡配套使用NS3001B型免疫層析結(jié)果判讀記錄儀(天津中新科炬生物制藥有限公司產(chǎn)品)使用，用于對檢測結(jié)果的定量判定，具體來說,血紅蛋白試紙判讀測定得到信號值,利用IC卡將信號值與濃度值進行轉(zhuǎn)換從而得到濃度值,對血紅蛋白檢測范圍為50-250g/L。

上述試紙盒裝配方法為：在相對濕度小于30％的條件下，取塑料底板，將已包被血紅蛋白配對抗體的NC膜粘貼在底板的中部，在NC膜T線一側(cè)粘貼膠體金墊，在膠體金墊另一側(cè)粘貼樣品墊；在NC膜C線一側(cè)粘貼吸樣墊；各粘貼組分接口相互疊壓1-2mm，粘貼好的大板切成3-5mm寬的試紙條。然后將試紙條分別放置于塑料卡殼下蓋的槽中，然后蓋上上蓋，壓緊，形成試紙盒。

上述血紅蛋白檢測試劑盒的操作方法為：檢測時將10ul的血液樣本加入到1ml樣本裂解液中，混勻，等待2分鐘，從樣本裂解液中取100μL加入血紅蛋白檢測試劑卡中的加樣端，在15-20分鐘內(nèi)，用NS3001B型免疫層析結(jié)果判讀記錄儀對檢測結(jié)果進行判定。

實施例2

1材料

1.1本發(fā)明實施例1所述血紅蛋白檢測試劑盒

1.2 Hb企業(yè)內(nèi)控品：人血紅蛋白干粉，購自Sigma，產(chǎn)品貨號：H7379，稱取干粉由純水稀釋為高濃度后，再由過濾羊血清按梯度稀釋至0.05g/L、0.1g/L、0.5g/L、1g/L、5g/L、20g/L。企業(yè)內(nèi)控品50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L為人定值全血。

1.3臨床樣本：由公司在相關(guān)醫(yī)院獲得，共120份，其中確診為貧血病人全血樣本60份，Hb檢測值從60-90g/L。正常人血清樣本60份，Hb檢測值從110-160g/L。

1.3實驗儀器：天津中新科炬生物制藥有限公司NS3001B型免疫層析結(jié)果判讀記錄儀。

2方法

Hb企業(yè)內(nèi)控品濃度0.05g/L、0.1g/L、0.5g/L、1g/L、5g/L、20g/L、50g/L、100g/L、200g/L、250g/L，各濃度點吸取10μL，分別加入1mL樣本裂解液中，混勻，2分鐘后，吸取100μL加入到試劑卡的加樣端，每個濃度點設(shè)三個重復，15-20分鐘內(nèi)，使用NS3001B型免疫層析結(jié)果判讀記錄儀分別記錄檢測結(jié)果。

3結(jié)果

檢測結(jié)果見下表1。

表1血紅蛋白內(nèi)控品的檢測結(jié)果

根據(jù)上表1所得數(shù)據(jù)，以濃度值為X軸，所得信號值的平均值為Y軸，做劑量曲線，如圖1所示，0.05-0.5g/L濃度范圍內(nèi)，隨血紅蛋白濃度增加檢測信號值增強；0.5-1g/L附近，隨血紅蛋白濃度增加，檢測信號值變化不 顯著；1-250g/L濃度范圍內(nèi)，隨血紅蛋白濃度增加檢測信號減弱。表明：1-250g/L濃度范圍內(nèi)，處于顯著地“HOOK”效應(yīng)負相關(guān)區(qū)，且呈一定的相關(guān)性。

根據(jù)以上所述，將1-250g/L的劑量曲線利用ELISACalc軟件做logistic四參數(shù)曲線擬合分析。如圖2所示，根據(jù)曲線擬合方程分析，如表2所示，相關(guān)系數(shù)r^2值為0.999.表明利用HOOK效應(yīng)區(qū)1-250g/L檢測血紅蛋白含量，存在良好的劑量曲線規(guī)律。

表2四參數(shù)Logistic曲線擬合

由于正常人血紅蛋白含量在110-160g/L范圍內(nèi)，對于嚴重貧血患者，血紅蛋白含量不低于30g/L，因此鑒于臨床意義及樣本的可獲得性，采用本方法發(fā)明的試劑裝置用于檢測50-250g/L范圍內(nèi)血紅蛋白含量，對貧血患者的篩查提供科學依據(jù)。根據(jù)表1所得數(shù)據(jù)，將50-250g/L的劑量曲線利用ELISACalc軟件做logistic四參數(shù)曲線擬合分析。如圖3所示，根據(jù)曲線擬合方程分析，如表3所示，相關(guān)系數(shù)r^2值為0.999.表明在50-250g/L范圍內(nèi)檢測血紅蛋白含量，存在良好的劑量曲線規(guī)律。

表3四參數(shù)Logistic曲線擬合

臨床樣本檢測：對120份臨床全血進行檢測，加樣方式同上所述，其中57例檢測為貧血，58例檢測為正常值。和臨床相比，陽性、陰性預(yù)期值為100％，另5例為可疑結(jié)果。綜合結(jié)果的一致率為95.8％。定量檢測效果較好。通過以上結(jié)果可以判定本方法應(yīng)用于免疫層析夾心法檢測血紅蛋白含量結(jié)果可信，實現(xiàn)了現(xiàn)場、家庭快速、便捷檢測等優(yōu)點。

上述參照實施例對該一種血紅蛋白的檢測方法及血紅蛋白檢測試劑盒進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。