本發(fā)明屬于巖生忍冬成分鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種巖生忍冬成分鑒定及抗菌活性評價(jià)方法。

背景技術(shù)：

巖生忍冬(Lonicera rupicola Hook.f.et Thomson)，又名西藏忍冬，為忍冬科忍冬屬植物，產(chǎn)于寧夏南部、甘肅臨潭、青海東南部、四川西部、云南西北部及西藏東部至西南部，長于海拔3.6km以上的高山或山坡灌木叢中。在中國，忍冬屬資源也較為豐富，尤以西南部種類最多。忍冬屬內(nèi)有不少藥用植物和具有觀賞價(jià)值的綠化植物，據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，屬內(nèi)可藥用植物有49種，對許多致病菌有較強(qiáng)的抗菌作用。據(jù)現(xiàn)有資料表明，忍冬屬植物中的化學(xué)成分主要有四類：黃酮類、揮發(fā)油類、綠原酸類、苷類，此外還有甾醇類、糖類、無機(jī)元素類等。近年來，隨著合成及半合成抗菌素的增多和廣泛使用，臨床上細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重，面對這一嚴(yán)峻現(xiàn)狀，發(fā)揮中藥的治療優(yōu)勢將成為重要課題。隨著抗菌素種類增多和廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重，藥物的不良反應(yīng)也不斷增加。由于化學(xué)合成藥物開發(fā)難度大，毒副作用明顯。學(xué)者們都在各種中草藥成分的抗菌活性方面展開了研究工作，期望從中草藥中得到更加理想的抗菌藥物。目前為止，忍冬屬植物中除金銀花、山銀花等在醫(yī)藥、食品等方面廣為應(yīng)用而其藥理毒理作用得到深入研究外，其他忍冬屬的藥理毒理作用很少有研究報(bào)道。相關(guān)報(bào)道金銀花醇浸液對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎桿菌、腦膜炎雙球菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、變形桿菌、百日咳桿菌、綠膿桿菌、結(jié)核桿菌、霍亂桿菌等多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有一定的抑制作用。山銀花對白喉?xiàng)U菌也有很強(qiáng)的抗菌作用，高劑量的山銀花能明顯減少金黃色葡萄球菌感染小鼠所致死亡率。目前，由于巖生忍冬生長條件的特殊性及其資源分布等因素，對巖生忍冬作為藥用植物研究尤其是對其活性成分和抗菌活性無明確報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種巖生忍冬成分鑒定及抗菌活性評價(jià)方法，旨在解決目前由于巖生忍冬生長條件的特殊性及其資源分布等因素，對巖生忍冬作為藥用植物研究尤其是對其活性成分和抗菌活性無明確報(bào)道的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種巖生忍冬成分鑒定方法，所述巖生忍冬成分鑒定方法采用理化反應(yīng)和薄層層析法鑒定巖生忍冬的化學(xué)成分，用紙片法和微量肉湯稀釋法檢測巖生忍冬石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水提取物的體外抑菌活性；

所述理化反應(yīng)具體包括：稱取10g巖生忍冬粉末，浸泡于100mL蒸餾水中，密封浸泡24h，過濾，取其濾液；取若干滅菌試管，在試管中加入一定量巖生忍冬濾液，再分別加入各類一定量檢測試劑，觀察并記錄結(jié)果；

所述薄層層析法具體包括：取層析缸，以石油醚：乙酸乙酯＝1:10，v/v，為展開劑，在硅膠板上點(diǎn)樣后放入層析缸中，展開后在紫外燈365nm下觀察記錄有無熒光及熒光顏色，噴上顯色劑后再在紫外燈365nm下觀察熒光情況并記錄。

進(jìn)一步，所述理化反應(yīng)中試劑配制包括：

有機(jī)酸類顯色劑：

甲基紅試劑：稱取甲基紅100mg溶于100mL乙醇中即可；

溴甲酚綠指示劑：稱取溴甲酚綠0.04g溶于100mL乙醇中，用0.1mol/mL氫氧化鈉溶液調(diào)至藍(lán)色剛剛出現(xiàn)，移入棕色瓶中保存；

吖啶試劑：稱取吖啶5mg溶于100mL乙醇中即可；

酚和鞣質(zhì)類顯色劑：

氯化鈉明膠試劑：稱取明膠1g溶于50mL水中，然后加10g氯化鈉使溶解，加水稀釋到100mL；

三氯化鐵試劑：5％三氯化鐵乙醇溶液加入少許鹽酸；

三萜、甾體類顯色劑：20％磷鉬酸乙醇試劑；

黃酮類顯色劑：2％醋酸鎂甲醇試劑；

苯丙素類顯色劑：5％氫氧化鈉甲醇溶液試劑；

醌類顯色劑：

無色亞甲基藍(lán)試劑：準(zhǔn)確稱取100mg亞甲基藍(lán)溶于100mL乙醇中，加入1mL冰醋酸、1g鋅粉，攪拌至藍(lán)色消失，移入棕色瓶中，避光保存；

強(qiáng)心苷類顯色劑：

3，5-二硝基苯甲酸試劑：稱取3，5-二硝基苯甲酸1g，用50mL甲醇溶解，加入1mol/L氫氧化鈉溶液50mL，混合即可；

三氯乙酸試劑：稱取25g三氯乙酸溶于100mL乙醇中即可；

生物堿類顯色劑：

改良碘化鉍鉀試劑：稱取次硝酸鉍0.85g加入10mL冰醋酸和40mL水混合得溶液1；稱取碘化鉀8g加入20mL水溶液得溶液2；取溶液1和溶液2混合，取混合液1mL，加入2mL冰醋酸和10mL水混合即得試劑，移入棕色瓶中保存；

碘-碘化鉀試劑：稱取碘1g和碘化鉀10g溶于50mL水中加熱溶解，加入2mL冰醋酸用水稀釋到100mL，移入棕色瓶中保存。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述巖生忍冬成分鑒定方法中巖生忍冬石油醚提取物制備方法，所述巖生忍冬石油醚提取物制備方法包括：稱取100g巖生忍冬浸泡于1L石油醚中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流提取3次濾液，每次浸泡48h，濃縮至浸膏狀，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90rpm，溫度控制在50℃；取1mL石油醚提取物用二甲基亞砜溶解至溶液透亮，共加入了4mL二甲基亞砜，在無菌工作臺中用0.22μm微孔濾膜過濾。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述巖生忍冬成分鑒定方法中巖生忍冬乙酸乙酯提取物制備方法，所述巖生忍冬乙酸乙酯提取物制備方法包括：稱取100g巖生忍冬浸泡于1L甲醇溶液中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流提取3次濾液，每次浸泡48h，濃縮至浸膏狀，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90rpm，溫度控制在50℃；取1mL乙酸乙酯提取物用二甲基亞砜溶解至溶液透亮，共加入了6mL二甲基亞砜，在無菌工作臺中用0.22μm的微孔濾膜過濾。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述巖生忍冬成分鑒定方法中巖生忍冬醇提取物制備方法，所述巖生忍冬醇提取物制備方法包括：稱取100g粉碎后的巖生忍冬浸泡于1L甲醇溶液中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流提取3次濾液，每次浸泡48h，濃縮至浸膏狀，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90rpm，溫度控制在50℃；取1mL甲醇提取物用二甲基亞砜溶解至溶液透亮，共加入了3mL二甲基亞砜，在無菌工作臺中用0.22μm的微孔濾膜過濾。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述巖生忍冬成分鑒定方法中巖生忍冬水提取物制備方法，所述巖生忍冬水提取物制備方法包括：稱取100g巖生忍冬浸泡于1L蒸餾水中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流提取3次濾液，每次浸泡48h，濃縮至浸膏狀，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90rpm，溫度控制在50℃；取1mL蒸餾水提取物用二甲基亞砜溶解至溶液，共加入了5mL二甲基亞砜，在無菌工作臺中用0.22μm的微孔濾膜過濾。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述巖生忍冬成分鑒定方法中巖生忍冬成分抗菌活性評價(jià)方法，所述巖生忍冬成分抗菌活性評價(jià)方法包括：

(1)石油醚提取物制備：稱取100g巖生忍冬浸泡于1L石油醚中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流提取3次濾液，每次浸泡48h，濃縮至浸膏狀，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90rpm，溫度控制在50℃；取1mL石油醚提取物用二甲基亞砜溶解至溶液透亮，共加入了4mL二甲基亞砜，在無菌工作臺中用0.22μm微孔濾膜過濾；

乙酸乙酯提取物制備：稱取100g巖生忍冬浸泡于1L乙酸乙酯溶液中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流提取3次濾液，每次浸泡48h，濃縮至浸膏狀，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90rpm，溫度控制在50℃；取1mL乙酸乙酯提取物用二甲基亞砜溶解至溶液透亮，共加入了6mL二甲基亞砜，在無菌工作臺中用0.22μm的微孔濾膜過濾；

醇提取物制備：稱取100g粉碎后的巖生忍冬浸泡于1L甲醇溶液中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流提取3次濾液，每次浸泡48h，濃縮至浸膏狀，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90rpm，溫度控制在50℃；取1mL甲醇提取物用二甲基亞砜溶解至溶液透亮，共加入了3mL二甲基亞砜，在無菌工作臺中用0.22μm的微孔濾膜過濾；

水提取物制備：稱取100g巖生忍冬浸泡于1L蒸餾水中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流提取3次濾液，每次浸泡48h，濃縮至浸膏狀，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90rpm，溫度控制在50℃；取1mL蒸餾水提取物用二甲基亞砜溶解至溶液，共加入了5mL二甲基亞砜，在無菌工作臺中用0.22μm的微孔濾膜過濾；

(2)培養(yǎng)基制備：

TSA培養(yǎng)基：按胰蛋白胨大豆肉湯粉、蒸餾水比例為30g/1000mL配制，在電子天平上稱取胰蛋白胨大豆肉湯粉和瓊脂粉與錐形瓶中，并加入相應(yīng)比例的蒸餾水，加熱溶解，放入立式壓力蒸汽滅菌器121℃高壓蒸汽滅菌20min后取出，與已高壓好的平板一同放入無菌操作臺，紫外燈照射15min；隨即在無菌操作臺中將溶液倒入滅菌平皿中，每個(gè)平皿倒入15-20mL，等培養(yǎng)基冷卻，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，24h后取出做無菌檢查，合格者放入4℃冰箱中備用；

MH肉湯：按MH肉湯粉、蒸餾水比例為21g/1000mL配制；在電子天平上稱取MH肉粉劑于錐形瓶中，并加入蒸餾水，溶解后將一部分分裝至試管，每管3mL，密封，放入立式壓力蒸汽滅菌器121℃高壓蒸汽滅菌20min后取出，放置于37℃培養(yǎng)箱，24h后做無菌檢查，合格者放入4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

MH肉湯瓊脂培養(yǎng)基：在MH肉湯中按1.5％的比例加入瓊脂粉，加熱煮沸溶解，放入立式壓力蒸汽滅菌器121℃高壓蒸汽滅菌20min后取出，與以高壓好的平板一同放入無菌操作臺，紫外燈照射15min；在無菌操作臺中將溶液倒入滅菌平皿中，每個(gè)平皿倒入15-20mL，等培養(yǎng)基冷卻，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，24h后取出做無菌檢查，合格者放入4℃冰箱中備用；

(3)供試菌復(fù)蘇與菌懸液制備：

供試菌株復(fù)蘇：在無菌操作臺中，挑取10種標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于TSA培養(yǎng)基中，編號，放至37℃培養(yǎng)箱中16h后，取出放于4℃冰箱中備用；

菌懸液的制備：在無菌操作臺中，在標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)基中挑取單個(gè)菌落接種于3mL MH肉湯試管中，放置于37℃350rpm的搖床中震蕩培養(yǎng)4h，得菌液，再用MH肉湯將菌液稀釋1000倍后備用；

(4)紙片法

取10個(gè)MH肉湯瓊脂培養(yǎng)平板，每個(gè)培養(yǎng)平板加入1種受試菌菌液30μL，鋪勻，做好標(biāo)記；每個(gè)平板中均勻放置4個(gè)滅菌空白藥敏片，在平板外壁藥敏片對應(yīng)的位上分別標(biāo)記為1、2、3、4，在位置1的藥敏片上滴上10μL水提取物，在位置2的藥敏片上滴上10μL石油醚提取物，在位置3的藥敏片上滴上10μL的甲醇提取物，在位置4的藥敏片上滴上10μL的乙酸乙酯提取物，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，觀察測量記錄抑菌圈直徑；

(5)微量肉湯稀釋法

采取微量肉湯稀釋法測定巖生忍冬4種溶劑提取物對10種標(biāo)準(zhǔn)菌株的體外抑菌活性；取10個(gè)滅菌96孔板，每個(gè)板每孔加入100μLMH肉湯，每個(gè)板1、2排加水提取物，3、4排加石油醚提取物，5、6排加甲醇提取物，7、8排加乙酸乙酯提取物，提取物均加100μL，然后從第一孔倍比稀釋均勻至第12孔，每個(gè)板1～11列各孔中加入1種受試菌100μL，做好標(biāo)記，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，觀察并記錄結(jié)果。

本發(fā)明提供的巖生忍冬成分鑒定及抗菌活性評價(jià)方法，采用理化反應(yīng)和薄層層析法粗略鑒定巖生忍冬的主要化學(xué)成分，用紙片法和微量肉湯稀釋法檢測巖生忍冬4種不同溶劑(石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水)提取物的體外抑菌活性。抑菌結(jié)果表明4種不同溶劑提取物對受試菌均有一定的抑制作用。本發(fā)明以石油醚、乙酸乙酯、甲醇和蒸餾水為溶劑，以巖生忍冬全草為原料，采用理化反應(yīng)法和薄層層析法粗略鑒定該植物進(jìn)行主要化學(xué)成分，用紙片法和微量肉湯稀釋法測定該植物體外抑菌活性，用多種細(xì)菌株進(jìn)行抗菌作用的對比，分析不同溶劑提取物的活性成分對細(xì)菌的抑制效果。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的巖生忍冬成分鑒定方法流程圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明采用理化反應(yīng)和薄層層析法粗略鑒定巖生忍冬的主要化學(xué)成分，用紙片法和微量肉湯稀釋法檢測巖生忍冬4種不同溶劑(石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水)提取物的體外抑菌活性。抑菌結(jié)果表明4種不同溶劑提取物對受試菌均有一定的抑制作用。本發(fā)明參考金銀花、山銀花的藥理研究方法來研究巖生忍冬的主要成分及抑菌活性，為今后進(jìn)一步研究巖生忍冬的藥用情況奠定基礎(chǔ)，試驗(yàn)以石油醚、乙酸乙酯、甲醇和蒸餾水為溶劑，以巖生忍冬全草為原料，采用理化反應(yīng)法和薄層層析法粗略鑒定該植物進(jìn)行主要化學(xué)成分，用紙片法和微量肉湯稀釋法測定該植物體外抑菌活性，用多種細(xì)菌株進(jìn)行抗菌作用的對比，分析不同溶劑提取物的活性成分對細(xì)菌的抑制效果。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的巖生忍冬成分鑒定方法包括以下步驟：

S101：精確稱取10g巖生忍冬粉末，浸泡于100mL蒸餾水中，密封浸泡24h，過濾，取其濾液。取若干滅菌試管，在試管中加入一定量巖生忍冬濾液，再分別加入各類一定量檢測試劑，觀察并記錄結(jié)果；

S102：取層析缸，以石油醚：乙酸乙酯(1:10，v/v)為展開劑，在硅膠板上點(diǎn)樣后放入層析缸中，展開后在紫外燈365nm下觀察記錄有無熒光及熒光顏色，噴上顯色劑后再在紫外燈365nm下觀察熒光情況并記錄。

下面結(jié)合試驗(yàn)對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。

1.材料

1.1藥材

藥材為巖生忍冬全草，采自四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣，經(jīng)獸醫(yī)學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室陳朝喜副教授鑒定為忍冬屬巖生忍冬，晾干，粉粹待用。

1.2供試菌株

供試菌株為10種標(biāo)準(zhǔn)菌株：屎腸球菌；糞腸球菌；粘質(zhì)沙雷氏菌；肺炎克雷伯氏菌；陰溝腸桿菌陰溝亞種；痢疾志賀氏菌；腸沙門氏菌腸亞種；阪崎腸桿菌；金黃色葡萄球菌；普通變形桿菌；由西南民族大學(xué)獸醫(yī)藥理實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.3主要耗材及儀器

瓊脂粉；MH肉湯粉；胰蛋白胨大豆肉湯粉；磷鉬酸；氫氧化鈉；醋酸鎂；氯化鈉；明膠；三氯化鐵；甲基紅；溴甲酚綠；吖啶；亞甲基藍(lán)；冰醋酸；鋅粉；3，5-二硝基苯甲酸；三氯乙酸；次硝酸鉍；碘化鉀；碘；鹽酸；甲醇；乙醇；乙酸乙酯；石油醚；蒸餾水。

試管、試管架、培養(yǎng)皿、96孔聚苯乙烯微孔板、錐形瓶、注射器、記號筆、鉛筆、直尺、毛細(xì)管、洗耳球、稱量紙、濾紙、移液槍、槍頭、接種環(huán)(針)、量筒、燒杯、玻璃棒、層析缸、層析用硅膠、一次性手套、口罩等。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；手提式不繡鋼蒸汽消毒器；隔熱式電熱恒溫培養(yǎng)箱；凈化工作臺；電子天平；三用紫外分析儀；熱風(fēng)循環(huán)型實(shí)驗(yàn)室烘干箱；超純水儀；循環(huán)水真空泵；低溫冷卻液循環(huán)泵。

2.方法

2.1化學(xué)成分鑒定

2.1.1理化試劑配制

有機(jī)酸類顯色劑：

甲基紅試劑：稱取甲基紅100mg溶于100mL乙醇中即可。

溴甲酚綠指示劑：稱取溴甲酚綠0.04g溶于100mL乙醇中，用0.1mol/mL氫氧化鈉溶液調(diào)至藍(lán)色剛剛出現(xiàn)，移入棕色瓶中保存。

吖啶試劑：稱取吖啶5mg溶于100mL乙醇中即可。

酚和鞣質(zhì)類顯色劑：

氯化鈉明膠試劑：稱取明膠1g溶于50mL水中，然后加10g氯化鈉使溶解，加水稀釋到100mL。

三氯化鐵試劑：5％三氯化鐵乙醇溶液加入少許鹽酸。

三萜、甾體類顯色劑：20％磷鉬酸乙醇試劑。

黃酮類顯色劑：2％醋酸鎂甲醇試劑。

苯丙素類顯色劑：5％氫氧化鈉甲醇溶液試劑。

醌類顯色劑：

無色亞甲基藍(lán)試劑：準(zhǔn)確稱取100mg亞甲基藍(lán)溶于100mL乙醇中，加入1mL冰醋酸、1g鋅粉，攪拌至藍(lán)色消失，移入棕色瓶中，避光保存。

強(qiáng)心苷類顯色劑：

3，5-二硝基苯甲酸試劑：稱取3，5-二硝基苯甲酸1g，用50mL甲醇溶解，加入1mol/L氫氧化鈉溶液50mL，混合即可。

三氯乙酸試劑：稱取25g三氯乙酸溶于100mL乙醇中即可。

生物堿類顯色劑：

改良碘化鉍鉀試劑：稱取次硝酸鉍0.85g加入10mL冰醋酸和40mL水混合得溶液1；

稱取碘化鉀8g加入20mL水溶液得溶液2；取溶液1和溶液2混合，取混合液1mL，加入2mL冰醋酸和10mL水混合即得試劑，移入棕色瓶中保存。

碘-碘化鉀試劑：稱取碘1g和碘化鉀10g溶于50mL水中加熱溶解，加入2mL冰醋酸用水稀釋到100mL，移入棕色瓶中保存。

2.1.2理化反應(yīng)

精確稱取10g巖生忍冬粉末，浸泡于100mL蒸餾水中，密封浸泡24h，過濾，取其濾液。取若干滅菌試管，在試管中加入一定量巖生忍冬濾液，再分別加入各類一定量檢測試劑，觀察并記錄結(jié)果。

2.1.3薄層層析法

取層析缸，以石油醚：乙酸乙酯(1:10，v/v)為展開劑，在硅膠板上點(diǎn)樣后放入層析缸中，展開后在紫外燈365nm下觀察記錄有無熒光及熒光顏色，噴上顯色劑后再在紫外燈365nm下觀察熒光情況并記錄。

2.2體外抑菌試驗(yàn)

2.2.1供試液準(zhǔn)備

石油醚提取物制備：準(zhǔn)確稱取100g巖生忍冬浸泡于1L石油醚中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流提取3次濾液，每次浸泡48h，濃縮至浸膏狀，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90rpm左右，溫度控制在50℃左右。取1mL石油醚提取物用二甲基亞砜溶解至溶液透亮，共加入了4mL二甲基亞砜，在無菌工作臺中用0.22μm(尼龍66)微孔濾膜過濾。

乙酸乙酯提取物制備：準(zhǔn)確稱取100g巖生忍冬浸泡于1L乙酸乙酯溶液中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流提取3次濾液，每次浸泡48h，濃縮至浸膏狀，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90rpm左右，溫度控制在50℃左右。取1mL乙酸乙酯提取物用二甲基亞砜溶解至溶液透亮，共加入了6mL二甲基亞砜，在無菌工作臺中用0.22μm(尼龍66)的微孔濾膜過濾。

醇提取物制備：準(zhǔn)確稱取100g粉碎后的巖生忍冬浸泡于1L甲醇溶液中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流提取3次濾液，每次浸泡48h，濃縮至浸膏狀，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90rpm左右，溫度控制在50℃左右。取1mL甲醇提取物用二甲基亞砜溶解至溶液透亮，共加入了3mL二甲基亞砜，在無菌工作臺中用0.22μm(尼龍66)的微孔濾膜過濾。

水提取物制備：準(zhǔn)確稱取100g巖生忍冬浸泡于1L蒸餾水中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回流提取3次濾液，每次浸泡48h，濃縮至浸膏狀，轉(zhuǎn)數(shù)控制在90rpm左右，溫度控制在50℃左右。取1mL蒸餾水提取物用二甲基亞砜溶解至溶液，共加入了5mL二甲基亞砜，在無菌工作臺中用0.22μm(尼龍66)的微孔濾膜過濾。

2.2.2培養(yǎng)基制備

TSA培養(yǎng)基：按胰蛋白胨大豆肉湯粉、蒸餾水比例為30g/1000mL配制，在電子天平上稱取一定量的胰蛋白胨大豆肉湯粉和瓊脂粉與錐形瓶中，并加入相應(yīng)比例的蒸餾水，加熱溶解，放入立式壓力蒸汽滅菌器121℃高壓蒸汽滅菌20min后取出，與已高壓好的平板一同放入無菌操作臺，紫外燈照射15min。隨即在無菌操作臺中將溶液倒入滅菌平皿中，每個(gè)平皿倒入約15-20mL，等培養(yǎng)基冷卻，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，24h后取出做無菌檢查，合格者放入4℃冰箱中備用。

MH肉湯：按MH肉湯粉、蒸餾水比例為21g/1000mL配制。在電子天平上稱取一定量的MH肉粉劑于錐形瓶中，并加入相應(yīng)比例的蒸餾水，溶解后將一部分分裝至試管，每管3mL，密封，放入立式壓力蒸汽滅菌器121℃高壓蒸汽滅菌20min后取出，放置于37℃培養(yǎng)箱，24h后做無菌檢查，合格者放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

MH肉湯瓊脂培養(yǎng)基：在MH肉湯中按1.5％的比例加入瓊脂粉，加熱煮沸溶解，放入立式壓力蒸汽滅菌器121℃高壓蒸汽滅菌20min后取出，與以高壓好的平板一同放入無菌操作臺，紫外燈照射15min。隨即在無菌操作臺中將溶液倒入滅菌平皿中，每個(gè)平皿倒入約15-20mL，等培養(yǎng)基冷卻，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，24h后取出做無菌檢查，合格者放入4℃冰箱中備用。

2.2.3供試菌復(fù)蘇與菌懸液制備

供試菌株復(fù)蘇：在無菌操作臺中，挑取10種標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于TSA培養(yǎng)基中，編號，放至37℃培養(yǎng)箱中16h后，取出放于4℃冰箱中備用。

菌懸液的制備：在無菌操作臺中，在標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)基中挑取單個(gè)菌落接種于3mL MH肉湯試管中，放置于37℃350rpm的搖床中震蕩培養(yǎng)4h，得菌液，再用MH肉湯將菌液稀釋1000倍后備用。

2.2.4紙片法

取10個(gè)MH肉湯瓊脂培養(yǎng)平板，每個(gè)培養(yǎng)平板加入1種受試菌菌液30μL，鋪勻，做好標(biāo)記；每個(gè)平板中均勻放置4個(gè)滅菌空白藥敏片，在平板外壁藥敏片對應(yīng)的位上分別標(biāo)記為1、2、3、4，在位置1的藥敏片上滴上10μL水提取物，在位置2的藥敏片上滴上10μL石油醚提取物，在位置3的藥敏片上滴上10μL的甲醇提取物，在位置4的藥敏片上滴上10μL的乙酸乙酯提取物，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，觀察測量記錄抑菌圈直徑。

2.2.5微量肉湯稀釋法

參照CLSI(2013版)指導(dǎo)原則和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采取微量肉湯稀釋法測定巖生忍冬4種溶劑提取物對10種標(biāo)準(zhǔn)菌株的體外抑菌活性。取10個(gè)滅菌96孔板，每個(gè)板每孔加入100μLMH肉湯，每個(gè)板1、2排加水提取物，3、4排加石油醚提取物，5、6排加甲醇提取物，7、8排加乙酸乙酯提取物，提取物均加100μL，然后從第一孔倍比稀釋均勻至第12孔，每個(gè)板1～11列各孔中加入1種受試菌100μL，做好標(biāo)記，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，觀察并記錄結(jié)果。

3.結(jié)果

3.1成分鑒定結(jié)果

3.1.1理化反應(yīng)成分鑒定結(jié)果

表1巖生忍冬化學(xué)成分理化反應(yīng)鑒定結(jié)果

注：巖生忍冬原液為橙紅色，渾濁。

3.1.2薄層層析成分鑒定結(jié)果

表2巖生忍冬化學(xué)成分薄層層析鑒定結(jié)果

3.2體外抑菌結(jié)果

3.2.1紙片法抑菌結(jié)果

表3巖生忍冬紙片法體外抑菌結(jié)果

3.2.2微量肉湯稀釋法抑菌結(jié)果

表4巖生忍冬4種溶劑提取物微量肉湯稀釋法抑菌結(jié)果

注：D為水，PE為石油醚，MT為甲醇，EAC為乙酸乙酯。

本試驗(yàn)采用理化反應(yīng)和薄層層析法粗略鑒定巖生忍冬的主要化學(xué)成分，結(jié)果表明巖生忍冬中含有黃酮類、有機(jī)酸類、酚和鞣質(zhì)類、三萜和甾體類、強(qiáng)心苷類、生物堿類、皂苷類等化學(xué)成分。從兩種體外抑菌試驗(yàn)中可以得出，巖生忍冬4種不同溶劑提取物對受試菌均有一定的抑制作用，其中水提取物的抑菌效果較其他三種提取物的抑菌效果差，其他三種提取物的抑菌效果相當(dāng)。

兩種體外抑菌試驗(yàn)中，可選用平板稀釋法代替微量肉湯稀釋法，平板法穩(wěn)定，且不受藥液顏色及渾濁度的影響，比較適合于中藥制劑體外抑菌濃度的測定。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。