本發(fā)明涉及一種用于vkorc1-1639g>a基因多態(tài)性檢測(cè)的電化學(xué)傳感器制備方法，尤其是基于富勒烯納米復(fù)合材料作為氧化還原探針制備的夾心型生物傳感器，用于檢測(cè)vkorc1-1639g>a基因多態(tài)性，屬于電化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

華法林是最廣泛的抗凝劑，用于治療中風(fēng)，深靜脈血栓形成，肺栓塞或嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈血栓栓塞性疾病。然而，由于缺乏病人的個(gè)體遺傳信息支持而導(dǎo)致每個(gè)病人對(duì)華法林預(yù)測(cè)劑量可能偏高或偏低?？紤]到華法林的治療指數(shù)狹窄，在給藥劑量上存在較大的個(gè)體差異。因此，針對(duì)個(gè)體差異來精確調(diào)整華法林的用藥劑量是非常必要的。這種用藥差異因素是由針對(duì)華法林作用靶位點(diǎn)和個(gè)體的藥物代謝酶的基因型來決定的。維生素k環(huán)氧化物還原酶復(fù)合亞基1(vkorc1)，是華法林的首要分子靶點(diǎn)。研究表明，vkorc1多態(tài)性對(duì)華法林的用藥劑量有很大的影響，而多態(tài)性主要表現(xiàn)為1639g>a，1173c>t和1542g>c，其中，－1639aa基因型個(gè)體華法林的用藥劑量明顯低于其他基因型個(gè)體?；诖?，基因型可以被簡(jiǎn)化為通過使用-1639g>a多態(tài)性作為預(yù)測(cè)華法林藥效敏感性主要標(biāo)志物。因此，依據(jù)病人的基因型來精確調(diào)整不同個(gè)體華法林的用藥劑量，進(jìn)而防止副作用的發(fā)生非常重要。

傳統(tǒng)對(duì)于vkorc1突變基因的檢測(cè)主要依賴于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)和測(cè)序的方法。然而pcr的方法容易受到生物樣品中復(fù)雜成分的影響，檢測(cè)效率低和易出現(xiàn)假陽(yáng)性而使其應(yīng)用受到了限制。而dan測(cè)序不僅需要專門的儀器設(shè)備，訓(xùn)練有素的工作人員而且檢測(cè)過程繁瑣費(fèi)時(shí)，因此不適用于常規(guī)臨床檢測(cè)。最為主要的是，患者樣品中突變序列相對(duì)于高水平野生型序列顯得寡不敵眾，很難獲得較高的特異性。因此制備靈敏度高，特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法對(duì)于患者樣品中低豐度突變基因的檢測(cè)顯得至關(guān)重要。近年來，基于納米材料電化學(xué)生物傳感器由于簡(jiǎn)便，快速，成本低，靈敏度高等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用于生物樣品的檢測(cè)。

在電化學(xué)生物分析中，信號(hào)放大對(duì)于提高dna傳感器的靈敏度是非常重要。但是核酸分子由于其本質(zhì)是惰性分子，在生物測(cè)定反應(yīng)中不能作為氧化還原電對(duì)。因此，氧化還原分子的有效固定在夾心型dna生物傳感器的構(gòu)建中對(duì)于決定傳感器的線性范圍和檢測(cè)限是關(guān)鍵的步驟。最近，納米材料本身用作為氧化還原探針已被廣泛研究，因?yàn)樗粌H可有效克服氧化還原分子的泄漏，而且做為納米載體可提高生物分子的固載量。新型納米材料富勒烯(c60)，不僅具有大的比表面積和良好的生物相容性，同時(shí)也表現(xiàn)出優(yōu)良的導(dǎo)電性。最重要的是，富勒烯具有強(qiáng)的電子接受能力以形成相應(yīng)的陰離子物質(zhì)，這使其可作為理想的氧化還原物質(zhì)用于構(gòu)建夾層型生物傳感器。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于c60納米復(fù)合材料構(gòu)建氧化還原探針，建立了一種用于vkorc1-1639g>a基因多態(tài)性檢測(cè)的電化學(xué)傳感器制備方法，為華法林的個(gè)體化用藥提供了依據(jù)。

為達(dá)到目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種用于vkorc1-1639g>a基因多態(tài)性檢測(cè)的電化學(xué)傳感器制備方法，其特征是包括以下步驟：

(1)鉑多空納米粒子-聚酰胺樹枝狀聚合物-富勒烯納米粒-單鏈脫氧核糖核酸(ptpnps-pamam-c60nps-ssdna)復(fù)合物dna信號(hào)探針的制備；

(2)四面體dna捕獲探針的合成；

(3)利用ptpnps-pamam-c60nps-ssdna復(fù)合物dna信號(hào)探針作為氧化還原探針，利用四面體的dna捕獲探針建立電化學(xué)dna生物傳感器，并對(duì)基因vkorc1-1639g>a進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明中，所述ptpnps-pamam-c60nps-ssdnadna復(fù)合物dna信號(hào)探針的制備，包括以下步驟：

(1.1)pamam-c60nps納米復(fù)合材料的制備：

把1.0mg氨基修飾的聚酰胺樹枝狀聚合物溶于1ml雙蒸水中，然后在上述溶液中加入4ml無水乙醇及1ml濃度為1.5mm的富勒烯甲苯溶液,室溫?cái)嚢?6h，得到表面修飾有大量氨基的富勒烯懸液，然后5000轉(zhuǎn)離心10min，用無水乙醇、雙蒸水分別清洗3次，所得產(chǎn)物重新分散在2ml濃度為0.1m磷酸鹽緩沖溶液中，備用；所述磷酸鹽緩沖溶液的組分組成：濃度為0.1m的na2hpo4、濃度為0.1m的kh2po4、濃度為0.1m的kcl、其余是去離子水；ph=7.4；

(1.2)ptpnps-pamam-c60nps納米復(fù)合材料的制備：

把5.6mg六水氯化鈷（cocl2·6h2o）和100mg的聚乙烯吡咯烷酮（pvp）溶于50ml超純水中，超聲15min；然后在氮?dú)猓╪2）中脫氣15min，15mmol的硼氫化鈉快速加入上述溶液中，攪拌，然后加入12ml質(zhì)量百分比濃度為0.1%的氯鉑酸（h2ptcl6），連續(xù)攪拌直到顏色變?yōu)楹诤稚?，然后將所得產(chǎn)物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上干燥，得到空心鉑；取干燥后的空心鉑1mg重新分散在1ml超純水中，配制成濃度為1mg/ml的空心鉑溶液，4℃儲(chǔ)存待用；在1ml濃度為1mg/ml的pamam-c60nps溶液中加入1ml上述制備的空心鉑溶液，4℃攪拌12h，所得溶液經(jīng)8000/分鐘，離心15min，并用超純水清洗3次；

(1.3)ptpnps-pamam-c60nps-ssdna復(fù)合物的制備：

用高于巰基修飾的單鏈dna片段100倍用量的三(2-氯乙基)磷酸酯室溫處理巰基修飾的單鏈dna片段，1h；將處理后的100ml濃度為100nm的dna信號(hào)探針溶液（所述dna為序列表中的seqidno：6）加入1ml濃度為1mg/ml的ptpnps-pamam-c60nps溶液中，4℃攪拌12小時(shí)后離心，并用清洗緩沖液清洗，其中，所述清洗緩沖液的組分組成：濃度為10mm的na2hpo4、濃度為2mm的kh2po4、濃度為37mm的nacl、濃度為2.7mm的kcl、其余是去離子水；ph為7.4；

將合成的ptpnps-pamam-c60nps-ssdna重新分散在1ml雜交溶液中，4℃保存?zhèn)溆?；其中，所述雜交溶液的組分組成：濃度為10mm的na2hpo4、濃度為10mm的kh2po4、濃度為20mm的nacl、濃度為20mm的mgcl2、其余是去離子水；ph為7.4。

本發(fā)明中所述的四面體dna捕獲探針的合成，其特征在于：

將s1、s2、s3和s4四條單鏈dna片段（所述dna依次為序列表中的seqidno：1、2、3和4）分別溶于te緩沖液中，使每條單鏈dna片段溶液的最終濃度為50mm；各取2ml的上述s1、s2、s3和s4單鏈dna片段溶液與42mltm緩沖液(20mmtris、50mmmgcl2、ph7.4)混合，將上述溶液置于95℃孵育5min，然后冷卻至4℃并保持30s，以形成四面體dna捕獲探針溶液。

本發(fā)明中所述的“利用ptpnps-pamam-c60nps-ssdna復(fù)合物dna信號(hào)探針作為氧化還原探針，利用四面體的dna捕獲探針建立電化學(xué)dna生物傳感器，并對(duì)基因vkorc1-1639g>a進(jìn)行檢測(cè)”，其特征在于包括以下步驟：

(3.1)分別用0.3mm和0.05mm的氧化鋁（al2o3）粉末將玻碳電極拋光成鏡面，然后分別按超純水、無水乙醇、超純水的順序超聲電極各5min，室溫干燥備用；

(3.2)將8ml濃度為2mg/ml還原性氧化石墨烯四乙烯五氨（rgo-tepa）滴加在電極表面，室溫干燥；

(3.3)將干燥后的電極浸入質(zhì)量百分比濃度為1%的氯金酸溶液中，在chi660d電化學(xué)工作站用恒壓法，在-0.2v條件下沉積30s，金納米粒子沉積到電極表面；

(3.4)用超純水將電極沖洗干凈后，滴加10ml濃度為100ng/ml鏈酶親和素溶液，并置于4℃孵育16h；

(3.5)用超純水將孵育后的電極沖洗干凈后，滴加10ml濃度為10nm四面體dna捕獲探針溶液，室溫孵育10h；

(3.6)用超純水將孵育后的電極沖洗干凈后，滴加10ml質(zhì)量百分比濃度為1%的牛血清白蛋白溶液，室溫孵育1h，得電化學(xué)傳感器；

(3.7)將濃度依次從1fm、10fm、100fm、1pm、10pm的目標(biāo)dna片段溶液(所述dna為序列表中的seqidno：7)分別與100nmc60-pamam-ptpnps-ssdna檢測(cè)探針混合系統(tǒng)溶液在37℃雜交1h；

(3.8)將上述牛血清白蛋白封閉后的電極用清洗緩沖液沖洗干凈并在氮?dú)庵懈稍铮黄渲?，所述清洗緩沖液的組分組成：濃度為10mm的na2hpo4、濃度為2mm的kh2po4、濃度為37mm的nacl、濃度為2.7mm的kcl、其余是去離子水；ph為7.4；

(3.9)在干燥后的電極上分別滴加8ml上述不同濃度的目標(biāo)dna片段溶液和檢測(cè)探針混合液置于37℃孵育1h；

(3.10)將孵育后的電極用清洗緩沖液沖洗干凈后置于氮?dú)庵懈稍铮?/p>

(3.11)在干燥后的電極上滴加10ml濃度為10mm四辛基溴化銨甲苯溶液，孵育10min；

(3.12)將電極置于0.1mol磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行表征，測(cè)量其差示脈沖伏安法峰電流值；其中，所述磷酸鹽緩沖溶液的組分組成：濃度為0.1m的na2hpo4、濃度為0.1m的kh2po4、濃度為0.1m的kcl、其余是去離子水；ph為7.4；

(3.13)根據(jù)所得峰電流與vkorc1-1639g>a目標(biāo)dna片段(所述dna依次為序列表中的seqidno：7)濃度呈線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的一種指導(dǎo)華法林用藥的vkorc1-1639g>a基因多態(tài)性檢測(cè)的電化學(xué)dna生物傳感器的制備方法，其突出的特點(diǎn)是：

(1)將基于c60的納米復(fù)合材料作為氧化還原探針引入到電化學(xué)dna生物傳感器的制備中，不僅有效的克服了氧化還原分子固定在納米材料過程中產(chǎn)生的泄漏，而且提高了生物分子的固載量，進(jìn)而提高了電化學(xué)dna生物傳感器的靈敏度和生物相容性；

(2)通過使用四面體的dna捕獲探針用于識(shí)別目標(biāo)dna，它不僅確保了捕獲探針在電極表面固定的良好取向，而且通過增加傳感器表面用于分子識(shí)別的捕獲探針密度進(jìn)而提高了傳感器的靈敏度；

(3)本方法制備的電化學(xué)dna生物傳感器可為臨床根據(jù)不同病人基因型調(diào)整華法林用藥劑量，進(jìn)而避免華法林用藥過程副作用的發(fā)生；

(4)使用完全相同的納米材料和修飾方法，利用捕獲探針，信號(hào)探針與目標(biāo)dna的特異性識(shí)別，只需通過改變探針的核酸序列即可實(shí)現(xiàn)多種疾病(如腫瘤)個(gè)體化用藥基因的特異性，高靈敏檢測(cè)，另外，此方法簡(jiǎn)便，快速，便于實(shí)現(xiàn)商品化，從而推進(jìn)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的電化學(xué)dna生物傳感器的構(gòu)建示意圖。

圖2為本發(fā)明的電極材料不同修飾步驟的掃描電鏡圖和原子力顯微圖。

圖3為本發(fā)明的電化學(xué)dna生物傳感器在檢測(cè)vkorc1-1639g>a基因多態(tài)性時(shí)得到的差示脈沖伏安法峰電流與濃度的線性關(guān)系，以及傳感器的特異性與穩(wěn)定性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步闡述，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例１

結(jié)合附圖1所示，進(jìn)一步描述如下：

步驟1.把1.0mg氨基修飾的聚酰胺樹枝狀聚合物（pamam）溶于1ml雙蒸水中，然后在上述溶液中加入4ml乙醇及1ml濃度為1.5mm的富勒烯甲苯溶液,室溫?cái)嚢?6h，得到表面修飾有大量氨基的富勒烯懸液，然后5000轉(zhuǎn)離心10min，用無水乙醇、雙蒸水分別清洗3次，所得產(chǎn)物重新分散在2ml濃度為0.1m磷酸鹽緩沖溶液中，得到pamam-c60nps，備用；所述磷酸鹽緩沖溶液的組分組成：濃度為0.1m的na2hpo4、濃度為0.1m的kh2po4、濃度為0.1m的kcl、其余是去離子水；ph=7.4；

步驟2.把5.6mg六水氯化鈷（cocl2·6h2o）和100mg的聚乙烯吡咯烷酮（pvp）溶于50ml超純水中，超聲15min；然后在氮?dú)猓╪2）中脫氣15min，15mmol的硼氫化鈉（nabh4）快速加入上述溶液中，攪拌，然后加入12ml質(zhì)量百分比濃度為0.1%的氯鉑酸（h2ptcl6），連續(xù)攪拌直到顏色變?yōu)楹诤稚?，然后將所得產(chǎn)物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上干燥，得到空心鉑；取干燥后的空心鉑1mg重新分散在1ml超純水中，配制成濃度為1mg/ml的空心鉑溶液，4℃儲(chǔ)存待用；在1ml濃度為1mg/ml的pamam-c60nps溶液中加入1ml上述制備的空心鉑溶液，4℃攪拌12h，所得溶液經(jīng)8000/分鐘，離心15min，并用超純水清洗3次；

步驟3.在1ml濃度為1mg/ml的pamam-c60nps溶液中加入1ml上述制備的空心鉑溶液，4℃攪拌12h，所得溶液經(jīng)8000/分鐘，離心15min，并用超純水清洗3次；得到ptpnps-pamam-c60nps備用；

步驟4.用高于巰基修飾的單鏈dna片段100倍用量的三(2-氯乙基)磷酸酯室溫處理巰基修飾的單鏈dna片段，1h；將處理后的100ml濃度為100nm的dna信號(hào)探針溶液（所述dna為序列表中的seqidno：6）加入1ml濃度為1mg/ml的ptpnps-pamam-c60nps溶液中，4℃攪拌12小時(shí)后離心，并用清洗緩沖液清洗，其中，所述清洗緩沖液的組分組成：濃度為10mm的na2hpo4、濃度為2mm的kh2po4、濃度為37mm的nacl、濃度為2.7mm的kcl、其余是去離子水；ph為7.4；

將合成的ptpnps-pamam-c60nps-ssdna重新分散在1ml雜交溶液中，4℃保存?zhèn)溆茫黄渲?，所述雜交溶液的組分組成：濃度為10mm的na2hpo4、濃度為10mm的kh2po4、濃度為20mm的nacl、濃度為20mm的mgcl2、其余是去離子水；ph為7.4；

步驟5.將s1、s2、s3和s4四條單鏈dna片段（所述dna依次為序列表中的seqidno：1、2、3和4）分別溶于te緩沖液中，使每條單鏈dna片段溶液的最終濃度為50mm；各取2ml的上述s1、s2、s3和s4單鏈dna片段溶液與42mltm緩沖液(20mmtris、50mmmgcl2、ph7.4)混合，將上述溶液置于95℃孵育5min，然后冷卻至4℃并保持30s，以形成四面體dna捕獲探針溶液；

步驟6.分別用0.3mm和0.05mm的氧化鋁（al2o3）粉末將電極拋光成鏡面，然后分別按超純水、無水乙醇、超純水的順序超聲電極各5min，室溫干燥備用；

步驟7.將8ml濃度為2mg/ml還原性氧化石墨烯四乙烯五氨（rgo-tepa）滴加在電極表面，室溫干燥；

步驟8.將干燥后的電極浸入質(zhì)量百分比濃度為1%的氯金酸溶液中，在chi660d電化學(xué)工作站用恒壓法，在-0.2v電位條件下沉積30s，金納米粒子沉積到電極表面；如圖2所示，從圖2argo-tepa的掃描電鏡圖可見rgo-tepa為片層、折紙樣結(jié)構(gòu)；圖2b為rgo-tepa/aunps的掃描電鏡圖，從圖可見金納米粒子均勻負(fù)載于rgo-tepa的表面；

步驟9.用超純水將電極沖洗干凈后，滴加10ml濃度為100ng/ml鏈酶親和素溶液，并置于4℃孵育16h；如圖2所示，圖2c為rgo-tepa/aunps/avidin的掃描電鏡圖，從圖可見蛋白包裹于rgo-tepa/aunps的表面，此圖與圖2b明顯不同，由此可見鏈霉親和素已成功修飾于rgo-tepa/aunps表面；

步驟10.用超純水將孵育后的電極沖洗干凈后，滴加10ml濃度為10nm四面體dna捕獲探針溶液，室溫孵育10h；如圖2所示，圖2d為rgo-tepa/aunps/avidin/dnatetrahedral的掃描電鏡圖，從圖可見修飾的納米結(jié)構(gòu)表面呈現(xiàn)晶體形態(tài)，表明四面體dna已成功結(jié)合于rgo-tepa/aunps/avidin表面；圖2e、f、g分別為rgo-tepa，rgo-tepa/aunps和rgo-tepa/aunps/avidin的原子力顯微鏡，從圖可見表面粗糙度先增加后減小，說明傳感器每一步構(gòu)建成功；

步驟11.用超純水將孵育后的電極沖洗干凈后，滴加10ml質(zhì)量百分比濃度為1%的bsa(牛血清白蛋白)溶液，室溫孵育1h，得電化學(xué)傳感器；

步驟12.將本發(fā)明上述傳感器于4℃保存，間斷檢測(cè)傳感器電流響應(yīng)，儲(chǔ)存30天后電流響應(yīng)仍為初始電流的87.49%,表面?zhèn)鞲衅骶哂辛己玫姆€(wěn)定性；

步驟13.本發(fā)明取同一批次制備的dna生物傳感器5支，在相同條件下對(duì)0.01，1，和10nm的vkorc1-1639g>a基因dna片段分別進(jìn)行測(cè)定，每一濃度測(cè)定5次，結(jié)果響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差少于4.11%；同時(shí)，取不同批次制備的dna生物傳感器3支，在相同條件下對(duì)0.01，1，和10nm的vkorc1-1639g>a基因dna片段分別進(jìn)行測(cè)定，每一濃度測(cè)定5次，結(jié)果響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差少于4.09%，說明傳感器批內(nèi)及批間差異小，傳感器重現(xiàn)性良好；

步驟14.將濃度依次從1fm、10fm、100fm、1pm、10pm的目標(biāo)dna片段溶液(所述dna為序列表中的seqidno：7)分別與100nmc60-pamam-ptpnps-ssdna檢測(cè)探針混合系統(tǒng)溶液在37℃雜交1h；

步驟15.將上述bsa封閉后的電極用清洗緩沖液沖洗干凈并在氮?dú)庵懈稍铮黄渲校銮逑淳彌_液的組分組成：濃度為10mm的na2hpo4、濃度為2mm的kh2po4、濃度為37mm的nacl、濃度為2.7mm的kcl、其余是去離子水；ph為7.4；

步驟16.在干燥后的電極上滴加8ml上述不同濃度的目標(biāo)dna和檢測(cè)探針混合液置于37℃孵育1h；

步驟17.將孵育后的電極用清洗緩沖液（與步驟15中的清洗緩沖液相同）后置于氮?dú)庵懈稍铮?/p>

步驟18在干燥后的電極上滴加10ml濃度為10mm四辛基溴化銨甲苯溶液，孵育10min；

步驟19.將電極置于0.1mol磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行表征,測(cè)量其差示脈沖伏安法峰電流值；其中，所述磷酸鹽緩沖溶液的組分組成：濃度為0.1m的na2hpo4、濃度為0.1m的kh2po4、濃度為0.1m的kcl、其余是去離子水；

步驟20.根據(jù)所得峰電流與vkorc1-1639g>a基因dna片段濃度呈線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)定結(jié)果表明vkorc1-1639g>a基因dna片段濃度在1pm-100nm范圍內(nèi)成線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.992，檢測(cè)限位0.33pm；

步驟21.將本發(fā)明上述傳感器用于檢測(cè)目標(biāo)核酸序列（序列表中的seqidno：7所示）、錯(cuò)配堿基（序列表中的seqidno：9、10、11所示）及隨機(jī)序列（序列表中的seqidno：8所示），結(jié)果錯(cuò)配堿基電流響應(yīng)相對(duì)于目標(biāo)核酸序列顯得微不足道，說明傳感器的特異性好，可以很好區(qū)分目標(biāo)序列且可排除空白血漿基質(zhì)干擾；

如圖3所示，以傳感器對(duì)空白血漿的測(cè)量電流響i0應(yīng)值為基線，然后采用傳感器對(duì)含有基因片段的待測(cè)血漿進(jìn)行檢測(cè)。若待測(cè)血漿中含有vkorc1-1639g>a目標(biāo)序列，則傳感器的電流響應(yīng)值i1會(huì)較空白血漿的電流響應(yīng)值i0明顯升高，且i0和i1兩則電流響應(yīng)值間會(huì)存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；若待測(cè)血漿中不含有vkorc1-1639g>a目標(biāo)序列vkorc1（此時(shí)可能是單堿基錯(cuò)配（mismatch-1）、雙堿基錯(cuò)配（mismatch-2）、三堿基錯(cuò)配（mismatch-3），隨機(jī)序列（random）或空白血漿（blank）、尿酸（ｕａ）、抗壞血酸（ａａ），則傳感器的電流響應(yīng)值i1會(huì)與空白血漿的電流響應(yīng)值i0無明顯變化，且i0和i1兩則電流響應(yīng)值間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。電化學(xué)傳感器測(cè)量結(jié)果直觀如圖3c所示，即vkorc1-1639g>a患者比未突變?nèi)巳簞┝棵黠@要低。

圖3為本發(fā)明的電化學(xué)dna生物傳感器在檢測(cè)vkorc1-1639g>a基因多態(tài)性時(shí)得到的差示脈沖伏安法峰電流與濃度的線性關(guān)系，以及傳感器的特異性與穩(wěn)定性。從圖3a可見傳感器的電流響應(yīng)值隨著待測(cè)目標(biāo)基因濃度的增加而增加，且具有良好的線性相關(guān)性（圖3b）；從3c可見傳感器對(duì)vkorc1-1639g>a目標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，電流響應(yīng)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單堿基錯(cuò)配、雙堿基錯(cuò)配、三錯(cuò)配、隨機(jī)序列、葡萄糖以及空白血漿等，說明傳感器的選擇性良好；從圖3d可見，傳感器在存儲(chǔ)30天后電流響應(yīng)值下降很小，說明傳感器的穩(wěn)定性佳，可以很好用于目標(biāo)物質(zhì)分析。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提條件下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明中，所述的濃度符號(hào)代表的含義如下：

m：mol/l（摩爾/升）；

mm：mmol/l（毫摩爾/升）；

μm：μmol/l（微摩爾/升）；

nm：nmol/l（納摩爾/升）；

fm：fmol/l（飛摩爾/升）；

pm：pmol/l（皮摩爾/升）。

序列表

<110>十堰市太和醫(yī)院

<120>一種用于vkorc1-1639g>a基因多態(tài)性檢測(cè)的電化學(xué)傳感器制備方法

<160>11

<210>1

<211>80

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設(shè)計(jì)，以用作形成四面體dna捕獲探針

<400>1

gttgagggcttagtgttttttttttacacttatctgagtcttgaattacgaccgttcaca60

tacagaagcgccgcatacat80

<210>2

<211>55

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設(shè)計(jì)，以用作形成四面體dna捕獲探針

<400>2

tatcacgacacgttgcaagatgtgaacggtcgtaatcaacgtgagtggaccatac55

<210>3

<211>55

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設(shè)計(jì)，以用作形成四面體dna捕獲探針

<400>3

aactcgtcggtctagtaaaacacagcatgggtctaactatgtatgcggcgcttct55

<210>4

<211>55

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設(shè)計(jì)，以用作形成四面體dna捕獲探針

<400>4

aagactcagataagtgtcgccttgcactgatgctgtactatgaggttcccacgct55

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設(shè)計(jì)，以用作四面體dna捕獲探針的對(duì)照序列

<400>5

gttgagggcttagtgtttttttttt25

<210>6

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設(shè)計(jì)，以用作與納米材料結(jié)合的信號(hào)探針序列

<400>6

gtcagcctggcttgg15

<210>7

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設(shè)計(jì)，以用作靶基因序列

<400>7

cactaagccctcaacccaagccaggctgac30

<210>8

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設(shè)計(jì)，以用作靶基因的隨機(jī)對(duì)照序列

<400>8

cgctcatcgtacgcttgcaagtagtgccgt30

<210>9

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設(shè)計(jì)，以用作與靶基因相對(duì)應(yīng)的單堿基錯(cuò)配序列

<400>9

cactgagccctcaacccaagccaggctgac30

<210>10

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設(shè)計(jì)，以用作與靶基因相對(duì)應(yīng)的雙堿基錯(cuò)配序列

<400>10

cactgagccctcaacccaagcctggctgac30

<210>11

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設(shè)計(jì)，以用作與靶基因相對(duì)應(yīng)的三堿基錯(cuò)配序列

<400>11

cactgagcgctcaacccaagccaggctgac30