本發(fā)明涉及一種離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測定茶葉中砷形態(tài)的方法及應用。

背景技術：

茶是一種常用飲料，茶葉中除含有茶多酚、咖啡堿、維生素等對人體有益的有機成分外，還含有多種微量元素。微量元素對人體是有益的，也有少數(shù)元素是有害的，必須在種植生產(chǎn)和加工過程中對其加以有效監(jiān)測和控制。準確測定茶葉中的微量元素，對于評價茶葉質(zhì)量有重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，砷污染嚴重危害人體健康，但砷對人及生態(tài)系統(tǒng)的毒性不僅與砷總量有關，還與砷存在的化學形態(tài)密切相關。在自然界中，砷的主要形態(tài)有砷酸鹽(As(Ⅴ)、亞砷酸鹽As(Ⅲ)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)和砷糖(AsS)等，其中As(Ⅴ)、As(Ⅲ)為無機砷，其他均為有機砷。無機砷的毒性很高，已有研究證明無機砷為致癌物質(zhì)，而有機形態(tài)砷大多無毒。由于砷的各種形態(tài)隨著所處環(huán)境的不同始終處轉化之中，所以單獨測定總砷含量已無法準確反映砷的暴露水平及其對環(huán)境和生態(tài)的影響。因此，對砷的存在形態(tài)進行分析測定十分必要。

當前研究中，有關砷的形態(tài)研究大多集中在土壤環(huán)境、水質(zhì)、海產(chǎn)品和少數(shù)其他食品中，其中砷化合物的提取溶劑大多采用甲醇-水混合液或稀酸溶液（車東昇等，環(huán)境化學，2014，2014，33(7): 1130-1136）。目前行業(yè)標準《NY 659-2003》僅對茶葉中的砷總量做出限定，對茶葉中各種砷形態(tài)進行全面的調(diào)查分析是目前的難點。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種IC-ICP-MS聯(lián)用測定茶葉中砷形態(tài)的方法及應用。

一種IC-ICP-MS聯(lián)用測定茶葉中砷形態(tài)的方法，

1）待測茶葉經(jīng)過干燥、粉碎、過篩，利用0.1mol·L^-1硝酸水溶液提取，石墨消解儀100℃消解2h，得到待測液；

2）利用離子色譜進行分離待測液；

3）利用ICP-MS采用CCT模式測定砷形態(tài)。

所述的硝酸水溶液提取條件具體如下，稱取粉碎的樣品1.00 g于石墨消解儀的50 mL特氟龍消解罐中，加10 mL的0.2 mol·L^-1硝酸溶液，混勻，90℃消解2h，8000 r·min^-1離心15 min，取上清液過濾得到待測液。

所述的離子色譜條件：

Dionex IonPac AS7，250mm×2mm；

流動相，A為5 mol·L^-1 (NH₄)₂CO₃，B為100 mol·L^-1 (NH₄)₂CO₃；

二元梯度程序：0~2.5 min，100%A；2.5~5min，100% B；5~15min，100% A；流速0.3 mL·min^-1，進樣體積25 μL。

所述的 ICP-MS條件：

功率 1400 W；

冷卻氣流速13.0 L·min^-1；

輔助氣流速0.88 L·min^-1；

載氣流速1.12 L·min^-1；

采樣深度150；

四極桿偏壓-6.5 v；

六極桿偏壓-8.5 v；

聚焦電壓9.22 v；

采集時間800 s；

碰撞氣流量3.0 L·min^-1。

所述的方法的應用，根據(jù)不同砷形態(tài)組成，應用于茶葉產(chǎn)地溯源研究。

本發(fā)明的有益效果是，該方法檢測速度快、準確度高，成本低，適用于實際樣品的檢測，可用于茶葉中四種砷形態(tài)的準確定量和風險評估。

由于茶葉中砷形態(tài)與產(chǎn)地（包括氣候土壤等大環(huán)境）相關，也與人工管理和茶葉加工有關，所以可以應用于茶葉產(chǎn)地溯源研究。

附圖說明

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。

圖1是20 μg?L-1的As(Ⅲ)、DMA、As(V)和MMA分離圖；

圖2是4個砷形態(tài)0.5-25 μg·L-1標準曲線譜圖。

具體實施方式

本發(fā)明采用硝酸提取，以Dionex IonPac AS7陰離子交換柱為分離柱，在相關研究(Chungang Yuan etc. ,Food and Chemical Toxicology, 2007(45): 2381-2389)的基礎上，對試驗條件進行了優(yōu)化，結合ICP-MS檢測，成功地建立了茶葉中4種主要砷形態(tài)的檢測方法，并通過對4個茶類中砷形態(tài)的分析，對茶葉中砷形態(tài)現(xiàn)狀作了初步探索，為茶產(chǎn)品種植加工過程中砷變化規(guī)律的研究和茶葉品質(zhì)監(jiān)測提供技術支持，為研究茶產(chǎn)品中砷的風險評估奠定基礎。

材料與方法

1.1 茶樣

4個茶類共63個樣品均取自市售，其中花茶10個來自新疆，磚茶20個取自湖北，綠茶18個取自浙江，紅茶15個取自云南。樣品稱量、消解前均經(jīng)過干燥、粉碎、過篩。

儀器與試劑

儀器：Thermo Fisher XSeries II型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司）；ICS-3000型離子色譜（美國Thermo Fisher公司）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國 Millipore公司）；DEENA II樣品全自動消解前處理系統(tǒng)（美國Thomas Cain），IR210旋轉蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；Z383K型離心機（德國Hermle公司）；KQ-100超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；Buchi Waterbath B-480旋轉蒸發(fā)儀（瑞士 Buchi 公司）。

試劑：亞砷酸鈉As(Ⅲ)，砷酸鈉As(V)，一甲基砷酸鈉(MMA)和二甲基砷酸(DMA)，均購于Fluka公司。碳酸銨為優(yōu)級純，阿拉丁試劑有限公司；甲醇和過氧化氫，默克公司；水為超純水。用超純水配制1.0 mg·L^-1的混合As(Ⅲ)、DMA、MMA和As(Ⅴ)（以砷計）砷形態(tài)儲備液；工作溶液使用超純水逐級稀釋配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。流動相使用前經(jīng)超聲波清洗器超聲脫氣。

樣品前處理

1.2.1 砷總量的測定

準確稱量0.2 g左右（精確至0.0001 g）茶葉樣品于特氟龍消解罐中，加入5mL硝酸和1 mL雙氧水，微波消解，參數(shù)見表1。消解結束后，將樣品轉移至干凈的容量瓶中，稀釋定容至25mL，供ICP-MS測定。

1.2.2 不同形態(tài)砷的測定

采用三種前處理方法對茶葉中存在的砷形態(tài)進行提取。

方法一：準確稱取粉碎的樣品1.00 g于15 mL具塞離心管中，加10 mL的甲醇-水(體積比1:1)，混勻，超聲提取30 min，8000 r·min^-1離心15min，取上清液過濾。旋轉蒸發(fā)儀將濾液濃縮，減少甲醇的對柱子的傷害。用超純水定容至25mL，即可用于砷的形態(tài)分析。

方法二：準確稱取粉碎的樣品1.00 g于50 mL特氟龍消解罐中，加10 mL的0.2 mol·L^-1硝酸溶液，混勻，90℃消解2h，8000 r·min^-1離心15 min，取上清液過濾。用超純水定容至25 mL，即可用于砷的形態(tài)分析。

方法三：準確稱取粉碎的樣品1.00 g于50 mL特氟龍消解罐中，加入25mL沸水，100℃石墨消解儀保持微沸30 min，冷卻，8000 r·min^-1離心15 min，取上清液過濾。用超純水定容至25 mL，即可用于茶湯中砷形態(tài)分析。

混合標準溶液的配制

準確稱取4種砷形態(tài)的化合物，用去離子水配成含砷1.0 mg·L^-1的母液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。工作溶液使用去離子水逐級稀釋配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。流動相使用前經(jīng)超聲波清洗器超聲脫氣。

儀器工作條件

IC條件：Dionex IonPac AS7（250mm×2mm) 陰離子交換柱；流動相：A為5 mol·L^-1(NH₄)₂CO₃，B為100 mol·L^-1 (NH₄)₂CO₃。二元梯度程序：0~2.5 min，100%A；2.5~5min，100% B；5~15min，100% A；流速0.3 mL·min^-1，進樣體積25 μL。

ICP-MS條件：以1.0 μg·L^-1的⁷Li、⁵⁹Co、¹¹⁵In、²³⁸U調(diào)諧液進行儀器條件最佳化選擇，使1.0 μg·L^-1的¹¹⁵In和²³⁸U的計數(shù)分別大于4.0×10⁴ cps和8.0×10⁴ cps以進行全質(zhì)量范圍內(nèi)質(zhì)量校正。氧化物比率CeO⁺/Ce⁺≤0.5%，雙電荷比率Ba⁺⁺/Ba⁺≤2%；由于³⁵Cl和儀器所用的高純載氣（氬氣）易形成⁷⁵ClAr⁺，干擾⁷⁵As的測定，因此，采用時間CCT模式，用以消除⁷⁵ClAr⁺干擾。ICP-MS的工作參數(shù)分別見表2。

數(shù)據(jù)處理

由保留時間定性，峰面積定量。繪制標準曲線，外標法定量，計算各個砷形態(tài)的含量。以Excel和SPSS 19.0進行作圖和數(shù)據(jù)處理。單因素方差分析（Analysis of variance，ANOVA）用來比較各組間的差異，P<0.05表示差異性顯著。

結果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 流動相

比較了(NH₄)₂CO₃、硝酸:甲醇混合溶液（體積比為95:5）、硝酸、作為淋洗液對As(Ⅴ)、As(Ⅲ)、MMA、DMA的洗脫效果。結果顯示，當(NH₄)₂CO₃和硝酸甲醇混合溶液作為流動相時，As(Ⅴ)、As(Ⅲ)、MMA、DMA完全分離，且相同濃度的硝酸甲醇混合溶液比(NH₄)₂CO₃的分析時間短，但As(Ⅲ)和DMA分離效果較差，硝酸的分離效果更差。因此，選擇(NH₄)₂CO₃為本試驗流動相。

濃度及流速

分析了1，3，5，10 mmol·L^-1的碳酸銨在指定流速下對As(Ⅲ) 和DMA的分離效果，結果顯示：隨著(NH₄)₂CO₃濃度的增大，As(Ⅲ) 、DMA的保留時間減少，選擇濃度10 mmol·L^-1時兩者重疊；選擇1 mmol·L^-1時，As(Ⅲ) 有拖尾嚴重；選擇3 mmol·L^-1和5 mmol·L^-1時，分離度相差不大，但出峰時間顯著差異，因此選擇5 mmol·L^-1 (NH₄)₂CO₃作為As(Ⅲ) 、DMA的分離濃度?？疾炝?0、100、200 mmol·L^-1的(NH₄)₂CO₃在指定流速下對As(V)和MMA的分離效果，結果顯示：隨著洗脫濃度的增加，兩者出峰時間縮短，但分離度降低，因此選擇濃度適中的100 mmol·L^-1 (NH₄)₂CO₃作為As(V)和MMA的洗脫濃度。

分別比較了流速為0.1、0.3、0.5 mL·min^-1時的出峰情況及柱壓，當流速為0.5 mL·min^-1時，保留時間減少，但As(Ⅲ) 、DMA分離度降低，且柱壓超過4000 psi，不利于保護柱子；當流速為0.1 mL·min^-1時，分離時間延長，并且峰拖尾顯著，因此選擇0.3 mL·min^-1為本試驗最佳流速。

綜合考慮選擇流速為0.3 mL·min^-1，(NH₄)₂CO₃濃度為5 mmol·L^-1和100 mmol·L^-1作為流動相梯度分離測定As(Ⅲ)、DMA、As(V)和MMA。先用4種單標進樣確定其出峰時間，再用混合標準溶液，進一步確定各物質(zhì)的出峰順序。圖1為20 μg·L^-1的As(Ⅲ)、DMA、As(V)和MMA分離圖，4種物質(zhì)得到較完全分離，其保留時間分別約為2.08、2.92、7.34、8.03 min。

樣品提取方法優(yōu)化

目前針對砷形態(tài)的提取溶劑主要有水、酸液、甲醇和酶等試劑。本研究比較了100℃水煮30min、甲醇-水(1:1)超聲30min和0.2 mol·L^-1硝酸水90℃消解2h三種提取方式對4種砷形態(tài)的提取效率。上述三種提方式對4種砷形態(tài)的提取效果見表3。

由表3可知，以0.2 mol·L^-1硝酸水溶液對茶葉中砷的提取效率在78%~88%之間；水煮提取最低，均不超過50%；甲醇水溶液提取居于中間，在53%~68%之間。由于甲醇水溶液提取后，提取液須旋蒸或氮吹將甲醇盡可能去除，以避免對分析柱的損害，因此該方法相對繁瑣。綜合考慮選擇以0.2 mol·L^-1硝酸水溶液100℃消解2h作為茶葉中砷形態(tài)的提取方法。

標準工作曲線、檢出限及方法準確性

在優(yōu)化條件下，采用逐級稀釋法配制質(zhì)量濃度為0.5、1、5、10、25 μg·L^-1的4種砷系列標準混合溶液，繪制標準曲線，將s/n =3時的樣品濃度作為儀器檢出限(LOD)，s/n=10時的樣品濃度作為儀器定量下限(LOQ)。結果如表3所示，4種砷形態(tài)在0.5~25 μg·L^-1范圍內(nèi)呈良好的線性關系良好( r² ≥0.999 )，As(Ⅲ)、As(V)、MMA和DMA 4種砷形態(tài)的檢出限(LODs)分別為0.2、0.1、0.3、0.3 μg·L^-1，定量下限(LOQs)分別為0.5、0.3、0.5、0.6 μg·L^-1。對1 μg·L^-1砷混合標準溶液進行24h內(nèi)和48h內(nèi)相對標準偏差(RSD)的測定，得到4種砷形態(tài)的24h內(nèi)RSD(n=6)小于4.1%，48h內(nèi)RSD(n=3)小于4.6%，兩項指標均可滿足日常檢測需求。

2.5 加標回收率與方法穩(wěn)定性實驗

在3個加標水平下，測定IC-ICP-MS方法的回收率及穩(wěn)定性，結果如表5所示。4種砷形態(tài)在1.0、5.0和10.0 μg·kg^-1三個加標水平下的回收率為90.9%~125.0%。實驗重復4次，其相對標準偏差小于5.7%，可用于定量分析。4個砷形態(tài)0.5-25 μg·L^-1標準曲線譜圖如圖2所示。

2.4 茶葉中As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)的分析結果

將4個茶類共63個樣品前處理后進行分離與檢測，結果顯示（見表6-1，6-2）。63個樣品中共有7樣品未檢出砷，其中綠茶4個，紅茶3個。綠茶、紅茶、磚茶、花茶中砷總量平均值分別為43.5、42.8、303.7、573.9 μg·kg^-1，可提取總量分別為38.0、38.0、285.0、509.7 μg·kg^-1。綠茶中只檢出As(V)，紅茶有3只樣品檢出少量As(III)，其余只檢出As(V)，兩個茶類中均未檢出有機形態(tài)砷。磚茶和花茶中均檢出As(V)和As(III)，且含量相對較高，其中磚茶和花茶中4種砷形態(tài)As(III)、As(DMA)、As(MMA)、As(V)占對應提取總量的百分比分別為24.8%、8.9%、10.2%、56.1%和23.1%、7.7%、10.0%、59.2%。根據(jù)上述數(shù)據(jù)分析，茶葉中無機砷含量顯著高于有機砷(P<0.05)，并以無機形態(tài)的As(V)為主，含量從高到低依次為As(V)、As(Ⅲ )、MMA、DMA，該情況與煙草類似。

4 結論

本研究建立的離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，并對茶葉中砷的提取方法和流動相體系進行了優(yōu)化，實現(xiàn)茶葉中As(Ⅴ)、As(Ⅲ)、MMA和DMA四種砷形態(tài)的同時檢測。該方法檢測速度快、準確度高，適用于實際樣品的檢測，同時對市售4個茶類中砷背景值及4種砷形態(tài)含量進行了初步分析，為進行茶葉中砷殘留檢測及風險評估提供了基礎數(shù)據(jù)。