本發(fā)明屬于生物制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及抗體蛋白含量檢測技術(shù)，特別涉及一種抗體蛋白含量的微量檢測方法。
背景技術(shù)：
：目前，測定蛋白質(zhì)含量的常用方法有：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法、Bradford法、紫外吸收法等。這些方法各有優(yōu)劣，對于不同種類的樣品可以選擇不同的測定方法。凱氏定氮法常用于有機(jī)化合物的測定，反應(yīng)時間長，操作復(fù)雜，用樣量大。雙縮脲法、Lowry法和Bradford法均為蛋白質(zhì)溶液的顯色測定方法且均需標(biāo)準(zhǔn)品。雙縮脲法常用于快速但不需要十分精確的測定，如用于蛋白質(zhì)純化的前幾個步驟的測定。Lowry法一直被選為蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)測定方法，此法基于在堿性溶液中，蛋白質(zhì)的易氧化成分(如巰基、酚基)將Cu2+還原為Cu+，F(xiàn)olin-酚試劑定量地與Cu+反應(yīng)，形成藍(lán)色化合物，此藍(lán)色化合物在650nm有最大吸收峰。最近，新開發(fā)的BCA法也是在Lowry法基礎(chǔ)上的改進(jìn)，只是BCA與Cu+的反應(yīng)比Folin-酚試劑與Cu+的反應(yīng)更強(qiáng)。此方法配制試劑比較復(fù)雜，操作繁瑣，而且需要相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，一般新型抗體沒有相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，故不適用于抗體蛋白含量的檢測。Bradford法又叫考馬斯亮藍(lán)法，是染料考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸(精氨酸等)及芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，溶液由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色，最大吸收波長變?yōu)?95nm，在595nm波長下測定的吸光度與蛋白濃度呈線性關(guān)系。此法靈敏度高，重復(fù)性也好，但由于各種蛋白質(zhì)中精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，故通常使用該方法時，需對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，但通常對于新型抗體是沒有法定標(biāo)準(zhǔn)品。常規(guī)抗體蛋白含量的檢測方法主要為紫外吸收法。該方法要求有針對該蛋白的消光系數(shù)。由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸、胱氨酸等，它們具有吸收紫外光的性質(zhì)，其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長下的吸光度與其濃度成正比關(guān)系，故可作為蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。通常的操作為：用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑(水或緩沖液)作空白對照調(diào)零，根據(jù)經(jīng)驗把蛋白溶液稀釋至合適的濃度，使其280nm處吸光值在0.5～1.0之間，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，三次平行測定，根據(jù)Lambert-Beer定律計算蛋白溶液的含量：A＝εcl式中，A-吸光度，OD；ε-摩爾吸收系數(shù)，舊稱摩爾消光系數(shù)；c-濃度，mol/L；l-比色皿光程厚度，cm。此方法比色皿最小測量體積為4uL，根據(jù)經(jīng)驗稀釋蛋白溶液，不同的稀釋倍數(shù)計算得到的濃度不同，精確度不高，且折疊蛋白質(zhì)的摩爾消光系數(shù)會受到其二級、三級結(jié)構(gòu)的影響，從而發(fā)生變化，并不能簡單的進(jìn)行推定。通常確定其消光系數(shù)都是通過測定氨基酸組成或是按模型計算而求得。兩方法一種所需蛋白量達(dá)到毫克級，一種理論推算可能會導(dǎo)致較大誤差，均不如本法測得準(zhǔn)確。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種抗體蛋白含量的微量檢測方法，更加微量、精確的測定抗體蛋白含量的方法，以解決現(xiàn)有A280紫外吸收法測定蛋白濃度的缺點和不足。本發(fā)明的方法所需樣品量極少，操作簡單迅速，重復(fù)性好，且對不同種類的抗體蛋白溶液均能進(jìn)行有效測定。本發(fā)明建立在現(xiàn)有A280紫外吸收法的基礎(chǔ)上，用鹽酸胍溶液將抗體蛋白完全變性去折疊，從而可以根據(jù)待測抗體蛋白中色氨酸、酪氨酸殘基和二硫鍵等的數(shù)量計算其理論摩爾消光系數(shù)。本發(fā)明采用微量比色皿進(jìn)行實驗，選用抗體樣品梯度稀釋制作線性曲線，測量體積僅為4μL，可以線性擬合不同稀釋倍數(shù)與吸光度之間的關(guān)系，計算蛋白含量結(jié)果準(zhǔn)確度更高。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種抗體蛋白含量的微量檢測方法，包括以下步驟：(1)以變性液為稀釋液將供試樣品進(jìn)行梯度稀釋，室溫放置一段時間，以使抗體蛋白完全變性，測定不同稀釋倍數(shù)溶液的吸光度；以稀釋系數(shù)為橫坐標(biāo)，測得的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制變性線性曲線，得到變性線性方程Y＝AX+B；(2)根據(jù)該供試樣品的氨基酸序列，利用ExPASyProtParamtool在線計算供試樣品非變性條件下的消光系數(shù)，即正常狀態(tài)下蛋白為1mg/mL，光程為1cm的吸光度值；(3)將所述的吸光度值代入變性線性方程Y＝AX+B，計算該完全變性蛋白為1mg/mL時的稀釋系數(shù)(即d的倒數(shù))；根據(jù)下述公式計算該供試樣品的抗體蛋白濃度：C＝1.0×d×1/L式中，c-抗體蛋白濃度，mg/mL；d-蛋白溶液稀釋倍數(shù)；L-為光程(微量比色皿光程)。優(yōu)選為，還包括步驟(4)以非變性液為稀釋液將另一供試樣品進(jìn)行同梯度稀釋，然后重復(fù)步驟(1)的其他步驟，得到非變性線性曲線；然后將步驟(3)該完全變性蛋白為1mg/mL時的稀釋系數(shù)代入非變性線性曲線，得到該供試樣品抗體蛋白未變性即常態(tài)時消光系數(shù)ζ，該消光系數(shù)試用于下列公式，直接用于該供試樣品抗體蛋白未變性時的濃度測定：A＝ζ*C*L式中，c-抗體蛋白濃度，mg/mL；A-吸光度，OD；ζ為消光系數(shù)；L為光程，cm。優(yōu)選為，步驟(1)中所述的變性液為6.3mM十二水合磷酸氫二鈉，13.7mM二水合磷酸二氫鈉，6M鹽酸胍，pH＝6.5的混合液；步驟(4)中所述的非變性液為6.3mM十二水合磷酸氫二鈉，13.7mM二水合磷酸二氫鈉，pH＝6.5±0.1的混合液。優(yōu)選為，步驟(1)和(4)中所述的供試樣品為純化后得到的抗體蛋白溶液，且不含有吸收紫外線的物質(zhì)。優(yōu)選為，步驟(1)和(4)中梯度稀釋系數(shù)根據(jù)所述的供試樣品的吸光度值而定，使稀釋后溶液測定的吸光度值在儀器測量范圍內(nèi)。優(yōu)選為，稀釋后溶液測定的吸光度值在0.056至0.42之間。優(yōu)選為，步驟(1)和(4)中所述的吸光度值的測定儀器為紫外分光光度計，如AgilentCary60等。優(yōu)選為，所述的紫外分光光度計的參數(shù)設(shè)置為波長280nm，讀數(shù)次數(shù)三次，運行時進(jìn)行曲線校正，擬合類型線性，最小R2為0.99，測定比色皿為微量比色皿，光程l為0.1cm。優(yōu)選為，在測定所述的供試樣品的吸光度之前，用所述的變性液進(jìn)行調(diào)零，調(diào)零吸光度在0.37以下。優(yōu)選為，按照稀釋倍數(shù)從高到低依次測定，每測完一個稀釋倍數(shù)溶液，用超純水清洗微量比色皿后，再測下一個稀釋倍數(shù)溶液。本發(fā)明還公開了上述抗體蛋白含量的微量檢測方法在抗體蛋白檢測試劑盒的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：與現(xiàn)有A280方法相比，本發(fā)明無需通過其他方法測定消光系數(shù)，且使用了微量比色皿，從而極大的節(jié)省了測試所需樣品量，對純化后的少量抗體樣品可以快速測定，滿足實驗室和企業(yè)研發(fā)需要；同時為了解決現(xiàn)有方法準(zhǔn)確度不高的問題，本發(fā)明對蛋白溶液稀釋系數(shù)和吸光度進(jìn)行線性擬合，避免了對蛋白溶液稀釋倍數(shù)不同，而導(dǎo)致計算出的供試品蛋白含量不同的問題；且本發(fā)明的方法重復(fù)性好，方法學(xué)驗證精密度RSD均小于5％；和可根據(jù)不同的抗體蛋白的結(jié)構(gòu)特點改變摩爾消光系數(shù)，適用于各種抗體蛋白含量的測定，應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明的方法線性擬合不同稀釋倍數(shù)與抗體蛋白溶液吸光度之間的關(guān)系，解決了原有A280紫外吸收法精確度不高的問題，對不同抗體樣品的蛋白含量均能進(jìn)行有效測定。附圖說明圖1為本實施例1變性液梯度稀釋后的抗體1測得的以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為X軸-以吸光度為Y軸的變性線性曲線圖；圖2為本實施例1非變性液梯度稀釋后的抗體1測得的以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為X軸-以吸光度為Y軸的非變性線性曲線圖；圖3為本實施例2變性液梯度稀釋后的抗體2測得的以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為X軸-以吸光度為Y軸的變性線性曲線圖；圖4為本實施例2非變性液梯度稀釋后的抗體2測得的以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為X軸-以吸光度為Y軸的非變性線性曲線圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)該理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。在實際應(yīng)用中本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明做出的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)本發(fā)明未做特別的說明，以下實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)手段，且所用的原料、試劑也均為市售可購買得到的商品。實施例1測定抗體1的抗體蛋白含量(1)變性線性曲線的制作：以變性液為稀釋液將抗體1梯度稀釋10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍，室溫放置1小時后，測定不同稀釋倍數(shù)溶液的吸光度值；以稀釋系數(shù)(稀釋倍數(shù)的倒數(shù))為橫坐標(biāo)，測定的吸光值為縱坐標(biāo)繪制變性線性曲線，如圖1所示。所述的變性液為6.3mM十二水合磷酸氫二鈉，13.7mM二水合磷酸二氫鈉，6M鹽酸胍，pH＝6.5的混合液；所述的抗體1為上海泰因生物技術(shù)有限公司發(fā)酵、純化所得；稀釋所得溶液測定吸光度值在0.056到0.42之間。(2)根據(jù)抗體1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)即氨基酸序列，利用ExPASyProtParamtool在線計算其理論消光系數(shù)。(3)將步驟(2)得到的吸光系數(shù)，即1mg/mL完全變性蛋白的吸光度值1.304代入所得標(biāo)曲：y＝4.1728x-0.007，得到蛋白含量為1mg/mL時的稀釋倍數(shù)為3.18，代入C＝1.0×d×1/L計算抗體蛋白濃度：C＝1.0*3.18*1/0.1＝31.8mg/mL。(4)繪制非變性線性曲線，通過計算抗體1未變性時的消光系數(shù)，用以矯正步驟(1)的變性線性曲線，并可直接用于該供試樣品抗體蛋白未變性時的濃度測定：以非變性液為稀釋液將抗體1梯度稀釋10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍，測定不同稀釋系數(shù)溶液的吸光度值；以稀釋系數(shù)(即稀釋倍數(shù)的倒數(shù))為橫坐標(biāo)，測定吸光值為縱坐標(biāo)繪制非變性線性曲線，如圖2所示。所述的非變性液為6.3mM十二水合磷酸氫二鈉，13.7mM二水合磷酸二氫鈉，pH6.5±0.1的混合液；所述的抗體1為上海泰因生物技術(shù)有限公司發(fā)酵、純化所得；稀釋所得溶液測定吸光度值處于0.056至0.42之間。將步驟(3)所得蛋白含量為1mg/mL時的稀釋系數(shù)代入非變性標(biāo)準(zhǔn)線性曲線，計算得該抗體1未變性時的消光系數(shù)為：ε′＝1.37。實施例2測定抗體2的抗體蛋白含量(1)變性線性曲線的制作：以變性液為稀釋液將抗體2梯度稀釋3.33倍、6.66倍、8.88倍、13.32倍、17.76倍，室溫放置1小時后，測定不同稀釋倍數(shù)溶液的吸光度值；以稀釋系數(shù)(即稀釋倍數(shù)的倒數(shù))為橫坐標(biāo)，測定吸光度值為縱坐標(biāo)繪制變性線性曲線，如圖3所示。所述的變性液為6.3mM十二水合磷酸氫二鈉，13.7mM二水合磷酸二氫鈉，6M鹽酸胍，pH＝6.5的混合液；所述的抗體2為上海泰因生物技術(shù)有限公司發(fā)酵、純化所得；稀釋所得溶液測定吸光度值0.056至0.42之間。(2)根據(jù)抗體2的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用ExPASyProtParamtool在線計算其消光系數(shù)：(3)將步驟(2)所得的吸光系數(shù)，即1mg/mL完全變性蛋白的吸光度值1.567代入所得標(biāo)曲：y＝1.6003x-0.0228，得到蛋白含量為1mg/mL時的稀釋倍數(shù)為1.01，代入C＝1.0×d×1/L計算抗體蛋白濃度：C＝1.0*1.01*1/0.1＝10.1mg/mL。(4)繪制非變性線性曲線，通過計算抗體2未變性時的消光系數(shù)，用以矯正步驟(1)的變性線性曲線，并可直接用于該供試樣品抗體蛋白未變性時的濃度測定：以非變性液為稀釋液將抗體2梯度稀釋3.33倍、6.66倍、8.88倍、13.32倍、17.76倍，測定不同稀釋倍數(shù)溶液的吸光度值。以稀釋系數(shù)(即稀釋倍數(shù)的倒數(shù))為橫坐標(biāo)，測定吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。所述的非變性液為6.3mM十二水合磷酸氫二鈉，13.7mM二水合磷酸二氫鈉，pH6.5±0.1的混合液；所述的抗體2為上海泰因生物技術(shù)有限公司發(fā)酵、純化所得；稀釋3.33倍所得溶液測定吸光度值小于1。將步驟(3)所得蛋白含量為1mg/mL時的稀釋系數(shù)(即稀釋倍數(shù)的倒數(shù))代入非變性線性曲線，計算得該抗體2未變性時的消光系數(shù)為：ε′＝1.57。實施例3方法精密度的驗證3.1儀器重復(fù)性：同一日期同一分析人員對供試樣品制作一組標(biāo)曲溶液，對這組標(biāo)曲溶液重復(fù)進(jìn)樣測定6次，得到6次的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算供試樣品蛋白濃度。結(jié)果見表1，6次計算所得該供試樣品蛋白濃度RSD為1.30％。表1儀器重復(fù)性實驗結(jié)果進(jìn)樣序號濃度(mg/mL)128.36227.95328.29428.92528.32628.85平均值28.45標(biāo)準(zhǔn)偏差0.37相對標(biāo)準(zhǔn)偏差％1.30％3.2樣品重復(fù)性：同一日期同一分析人員對同一供試樣品制作兩組溶液，對這兩組溶液分別重復(fù)進(jìn)樣3次，共得到6次線性曲線，分別計算供試樣品蛋白濃度。結(jié)果見表2，6次計算所得該供試樣品蛋白濃度RSD為3.99％。表2樣品重復(fù)性實驗結(jié)果3.3中間精密度：不同分析人員在不同日期對同一供試樣品制作溶液，進(jìn)樣測定，共得到3次線性曲線，分別計算供試樣品蛋白濃度。結(jié)果見表3，3次所得該供試樣品蛋白濃度RSD為3.89％。表3中間精密度實驗結(jié)果本方法的使用量微克級就夠了，并且本方法不需要用標(biāo)準(zhǔn)品，使用微量比色皿，操作簡單迅速，代替了常規(guī)方法是兩種實驗相結(jié)合才能得出結(jié)果的繁瑣步驟，本發(fā)明的方法線性擬合不同稀釋倍數(shù)與抗體蛋白溶液吸光度之間的關(guān)系，解決了原有A280紫外吸收法精確度不高的問題，對不同抗體樣品的蛋白含量均能進(jìn)行有效測定。本發(fā)明還公開了一種試劑盒，包括變性液和非變性液，所述試劑盒用于抗體蛋白含量的微量檢測。以上公開的本發(fā)明優(yōu)選實施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實施例并沒有詳盡敘述所有的細(xì)節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的具體實施方式。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實際應(yīng)用，從而使所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書及其全部范圍和等效物的限制。當(dāng)前第1頁1 2 3