本發(fā)明屬于煙葉原料的理化檢驗技術領域，具體是涉及一種快速檢測煙草或煙草制品中煙堿含量的方法。

背景技術：

煙堿又名尼古丁，廣泛存在于茄科植物中，是煙草中含氮生物堿的主要成分，能迅速溶于水及酒精中，具有成癮性。重復使用會導致心率加快，血壓升高，食欲下降。劑量過大，甚至會引起惡心、嘔吐，嚴重者會引起死亡，其對于人的致死量是50-70mg，相當于20-25支香煙中煙堿的含量。煙堿主要作用于煙堿乙酰膽堿接受體，對中樞神經系統(tǒng)、周邊神經系統(tǒng)都有損害。美國一研究員日前公布的一項研究結果顯示，煙堿還會阻礙紫杉醇等化療藥物殺死癌細胞。因此對于煙堿的檢測十分重要。

目前，測定煙堿的方法主要是氣相色譜(gc)、液相色譜(hplc)、毛細管電泳(ce)、連續(xù)流動儀(cfa)等方法。這些方法均需要對樣品進行復雜的前處理，耗時較長、成本高且對樣品有一定程度的損耗，而且僅能離線監(jiān)測。

實時直接分析(directanalysisinrealtime,dart)是一種熱解析和離子化技術，操作簡便。最重要的是它可以在幾秒鐘的時間內分析存在于氣體、液體、固體材料表面的化合物，從而能對樣品進行無損耗的定性和定量分析。

直接分析新型原位電離技術結合質譜測定(dart-ms/ms)主要的原理是，在大氣壓條件下，載氣(如氮氣或氦氣)經放電產生激發(fā)態(tài)原子，對激發(fā)態(tài)原子進行快速加熱和電場加速，使其解析并瞬間離子化待測樣品表面的化合物分子，然后進行質譜或串聯(lián)質譜檢測。目前，將其應用于煙草成分分析，特別是對煙草或煙草制品中的煙堿含量進行快速測定，在現(xiàn)有技術中尚未見有報道。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種快速測定煙草或主流煙氣中煙堿含量的方法，在保證檢測準確度和靈敏度的同時，無環(huán)境溶劑污染、降低檢測成本和縮短檢測時間。

本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)，除非另有說明，本發(fā)明所采用的百分數(shù)均為質量百分數(shù)。

(1)樣品前處理：將煙葉或煙絲烘干，進行細胞壁破壁，然后過篩，密封保存為備樣；稱取0.5g備樣，加入20-60ml萃取劑震蕩萃取，靜止后取上層澄清液，同時制備空白樣品及測定備樣含水率；

(2)配置煙堿的標準系列溶液；

(3)dart-ms/ms測定：dart電離正離子模式，離子源溫度350℃，采用液體進樣模式，進樣速率0.4-1.5mm/s，定量離子(m/z)163.1/129.8，定性離子對(m/z)163.1/84.1，載氣為氦氣(≥99.999％)；

(4)標準曲線繪制：將標準工作溶液按步驟(3)的儀器條件進行分析，以其濃度與定量離子的峰面積繪制標準工作曲線。

(5)計算煙堿含量：將測試樣品的峰面積代入標準曲線計算出樣品瓶中煙堿濃度，再由煙堿濃度計算得到樣品中煙堿的含量；

進一步地，所述步驟(1)中樣品前處理，用高速旋風磨進行細胞壁破壁，然后過40目篩網，密封保存為備樣；萃取劑為超純水，加入30ml超純水震蕩萃取30min，靜止3min后取上層澄清液，萃取效果更好；按yc/t31-1996標準測試備樣中含水率；所述空白樣品制備即在進樣棒蘸取超純水和不蘸取超純水兩種情況下，進行空白實驗。

進一步地，所述步驟(3)中，所述進樣速率為0.6mm/s?？梢缘玫搅己玫臒焿A離子化效率。

進一步地，所述配置煙堿的標準系列溶液的具體方法為：將煙堿標準物質溶解于超純水中，制備6個系列標準工作溶液，其濃度范圍為0.01mg/ml-2.0mg/ml，覆蓋預計檢測到的樣品含量。

進一步地，所述步驟(5)中煙堿的含量以毫克每克數(shù)表示，精確至0.001mg/g，由如下公式計算得出：

式中：

x——樣品中煙堿的含量，單位為毫克每克(mg/g)；

ci——從標準工作曲線上得到煙堿濃度，單位為毫克每毫升(mg/ml)；

c0——空白試驗中煙堿濃度，單位為毫克每毫升(mg/ml)；

v——超純水的體積，單位為毫升(ml)；

m——稱樣量，單位為克(g)；

ω——樣品的含水率。

相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明首次采用實時直接分析方法對煙草或煙草制品中的煙堿含量進行快速測定。采用定性離子對和定量離子對同時檢測，相對于gc、hplc能夠有效地消除共流出組分干擾，減少溶劑使用，測定結果準確。與現(xiàn)行通用的連續(xù)流動(cfa)相比，該方法不僅能在幾秒內分析樣品，而且能夠降低檢測成本并且無環(huán)境溶劑污染，還能實現(xiàn)在線檢測，準確及時。

2、采用超純水作為萃取劑，能夠保證煙堿萃取完全。

3、本發(fā)明前處理簡單，不需要凈化富集，操作簡單、快速、無環(huán)境溶劑污染、高通量，以3倍和10標準偏差為方法的檢出限和定量限，分別為6.05和20.17ng/ml，標準曲線的相關系數(shù)大于0.99，三個加標水平的平均回收率在90.5-110％之間，相對標準偏差(rsd)小于10％，該方法靈敏度和回收率高，重復性較好。

附圖說明

圖1煙堿母離子掃描圖；

圖2煙堿標準工作液的mrm圖；

圖3空白實驗質譜圖；

圖4樣品的mrm離子色譜圖(m/z163.1/129.8)。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但實施例并不是對本發(fā)明技術方案的限定。

實施例1

1、儀器、試劑及儀器工作條件

1)儀器

dartsvp(美國ionsense公司)；高速旋風磨(美國udy公司)；hy-8型振蕩儀(常州國華電器有限公司)；me414s電子天平(感量：0.0001g，德國sartorius公司)；烘箱(德國binder公司)；40目篩網。

2)試劑：超純水，應符合gb/t6682中一級水的要求；煙堿標準品(純度>98.0％)。發(fā)明人比較了超純水、甲醇、異丙醇、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、石油醚以及甲醇、異丙醇與超純水按不同比例分別作為萃取劑對煙堿的萃取效果，結果發(fā)現(xiàn)超純水作為萃取劑效果最好。

3)條件：dart電離為正離子模式，離子源溫度為350℃，采用液體進樣模式，進樣速率為0.6mm/s，定量離子對：163.1/129.8，定性離子對：163.1/84.1。載氣：氦氣(純度≥99.999％)。

2、煙堿的標準系列溶液配置

稱取0.5g的煙堿溶于100ml的棕色容量瓶中，以超純水定容作為儲備液，分別取0.02，0.1，0.5，1，2.0，4.0ml的儲備液于10ml棕色容量瓶中，加超純水定容至刻度，制備6個系列標準溶液。

3、標準曲線的測定

對配制的不同濃度的系列標準工作液進行dart-ms/ms分析，以標準溶液濃度(x，mg/ml)對峰面積(y)進行回歸分析，得到工作曲線y＝66603x+21469，r²為0.9991，線性范圍為0.01-2.00mg/ml。

4、樣品的處理和檢測

首先將煙葉(或煙絲)放入烘箱中，在不高于100℃的烘箱中烘干，直至可用手捻碎，用高速旋風磨對煙草及煙草制品進行細胞壁破壁，然后過40目篩網，密封保存為備樣。稱取0.5g備樣至于100ml的三角燒瓶中，加30ml超純水搖床萃取30min；靜止3min后取上層澄清液于樣品瓶中。然后進行dart-ms/ms分析，計算樣品中煙堿含量。按yc/t31-1996標準測試樣品含水率。同時，在進樣棒蘸取超純水和不蘸取超純水兩種情況下，進行空白實驗。檢測結果(圖3)表明，兩個空白實驗基本一致。通過標準工作曲線計算可得空白實驗的煙堿濃度為0.008mg/ml。

煙草中煙堿的含量由如下公式計算得出：

式中：

x——樣品中煙堿的含量，單位為毫克每克(mg/g)；

ci——從標準工作曲線上得到煙堿濃度，單位為毫克每毫升(mg/ml)；

c0——空白試驗中煙堿濃度，單位為毫克每毫升(mg/ml)；

v——超純水的體積，單位為毫升(ml)；

m——稱樣量，單位為克(g)；

ω——樣品的含水率，

每個樣品平行測定2次，以2次平行測定的平均值為測定結果。

5、方法驗證

(1)工作曲線、檢測限和定量限

對配制的不同濃度的系列標準工作液進行dart-ms/ms分析，以標準溶液濃度(x，mg/ml)對峰面積(y)進行回歸分析，得到工作曲線y＝66603x+21469，r²為0.9991，線性范圍為0.01～2.00mg/ml。對最低濃度的煙堿標準溶液進行10次測定，計算其標準偏差，以3倍和10標準偏差為方法的檢出限和定量限，分別為6.05和20.17ng/ml。煙堿母離子掃描圖如圖1所示，煙堿標準工作液的mrm圖如圖2所示。

(2)回收率和重復性

選擇一種卷煙樣品4份，其中1份為參比，其余3份分別加入高、中、低不同濃度水平的煙堿，樣品按本發(fā)明方法處理和dart-ms/ms分析。結果(表1)表明，煙堿的回收率在98.5％～102.3％之間。將該樣品重復分析6次，測得煙堿的相對標準偏差(rsd)為1.6％，表明方法的重復性良好，可以滿足樣品的分析要求。

表1卷煙樣品中煙堿的回收率

(3)卷煙樣品分析結果

分別選擇5種成品卷煙(1#～5#)和5種煙葉原料(6#～10#)，按照本發(fā)明方法進行處理和dart-ms/ms分析。由樣品色譜圖圖4可以看出，20s即可完成1個樣品的分析。采用本方法和現(xiàn)行行業(yè)標準yc/t468—2013即連續(xù)流動儀(cfa)方法測定煙堿含量，結果如表2所示?？梢钥闯?，采用兩種方法測定的煙堿含量基本一致，相對偏差在0.24％～2.74％，表明本方法一種可靠的煙堿分析方法，且與現(xiàn)行通用的連續(xù)流動(cfa)相比，該方法不僅能在幾秒內分析樣品，而且能夠降低檢測成本并且無環(huán)境溶劑污染，還能實現(xiàn)在線檢測，準確及時。

表2卷煙中煙堿分析結果比較

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。