本發(fā)明屬于電化學(xué)生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化鎳/碳納米管(PEDOT/NiO/CNT)復(fù)合材料的無酶電化學(xué)生物傳感器電極的制備及生物分子的檢測(cè)領(lǐng)域中應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

無酶電化學(xué)生物傳感器克服酶電化學(xué)生物傳感器的缺點(diǎn)，不使用酶，所以不易失活可以延長使用壽命，可以實(shí)現(xiàn)體外生物分子或者蛋白質(zhì)的檢測(cè)；因利用電化學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)分析物的測(cè)定，檢測(cè)速度提升、靈敏度提高、成本降低、操作簡單。

以3,4-乙烯二氧噻吩單體電聚合PEDOT[聚(3,4乙烯二氧噻吩)]過程及鎳離子還原成鎳的過程，把CNT(碳納米管)共同修飾到玻碳電極、金電極、導(dǎo)電玻璃等固體電極上，這種原位沉積多組分電催化物質(zhì)的電沉積方法，不僅能提高敏感膜及固體電極之間的結(jié)合強(qiáng)度，還可以直接構(gòu)造各種納米結(jié)構(gòu)或形態(tài)，并具有所有成分的電催化活性優(yōu)勢(shì)。

PEDOT[聚(3,4乙烯二氧噻吩)]是導(dǎo)電聚合物，具有良好的成膜特性，CNT(碳納米管)具有電導(dǎo)率高、生物相容性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，而二者均具有良好的電催化活性；由PEDOT[聚(3,4乙烯二氧噻吩)]附著在CNT(碳納米管)表面形成納米片結(jié)構(gòu)二者共同構(gòu)成蓬松的海綿狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增大了比表面積，有利于增加蛋白質(zhì)的吸附量。NiO有著良好的化學(xué)穩(wěn)定性和電學(xué)性能，有強(qiáng)催化作用，代替金，不損失催化活性的同時(shí)，能夠大大降低制作成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述存在問題，提供一種無酶電化學(xué)生物傳感器電極的制備方法及其應(yīng)用，該無酶電化學(xué)生物傳感器電極基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化鎳/碳納米管復(fù)合材料，采用電沉積方式一步原位制備聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化鎳/碳納米管復(fù)合材料修飾電極，用其可以構(gòu)建基于電化學(xué)方法的無酶的各種生物傳感器，具有單組分及多組分檢測(cè)功能。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種無酶電化學(xué)生物傳感器電極的制備方法，所述無酶電化學(xué)生物傳感器電極基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化鎳/碳納米管復(fù)合材料，采用電沉積方式一步原位制備聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化鎳/碳納米管復(fù)合材料修飾電極，步驟如下：

1)固體電極表面進(jìn)行清洗處理

將固體電極用氧化鋁粉末拋光成鏡面后，依次用濃度為50wt％的硝酸水溶液、超純水、無水乙醇和超純水中分別超聲清洗10min，去除有機(jī)及無機(jī)污垢，清潔電極表面；

2)配制碳納米管、氯化鉀、氯化鎳和3，4-乙烯二氧噻吩的混合溶液

將碳納米管、氯化鉀、氯化鎳和3，4-乙烯二氧噻吩混合均勻得到混合溶液，混合溶液中碳納米管、氯化鉀、氯化鎳和3，4-乙烯二氧噻吩的濃度分別為0.5mg/mL、0.1mol/L、0.2mol/L及2.1g/L；

3)聚(3,4乙烯二氧噻吩)/鎳/碳納米管修飾電極的制備

將清洗干凈的工作電極、參比電極和對(duì)電極組成的三電極系統(tǒng)插入到步驟2)得到的混合溶液中，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電沉積處理，電位范圍設(shè)置為-0.8V～1.5V，電壓掃描速度為0.01V/s～0.1V/s，然后取出三電極系統(tǒng)用超純水沖洗干凈，得到聚(3,4乙烯二氧噻吩)/鎳/碳納米管修飾電極；

4)無酶電化學(xué)生物傳感器電極的制備

把步驟3)中制得的聚(3,4乙烯二氧噻吩)/鎳/碳納米管修飾電極插入到pH為4～10、濃度為0.1～0.2mol/L的磷酸緩沖溶液中用循環(huán)伏安法對(duì)鎳進(jìn)行氧化處理，電位范圍設(shè)置為-0.8V～1.5V，電壓掃描速度為0.01V/s～0.1V/s，取出工作電極用超純水沖洗干凈并用氮?dú)獯蹈?，得到基于?3,4乙烯二氧噻吩)/氧化鎳/碳納米管復(fù)合材料的無酶電化學(xué)生物傳感器電極。

所述步驟3)中的工作電極為玻碳電極、金電極或?qū)щ姴ＡВ瑓⒈入姌O為飽和甘汞電極、Ag/AgCl電極、貢/硫酸亞汞電極或石墨電極；對(duì)電極為鉑片電極。

一種所制備的無酶電化學(xué)生物傳感器電極的應(yīng)用，用于構(gòu)建基于電化學(xué)方法的無酶的各種生物傳感器，具有單組分及多組分檢測(cè)功能。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

該無酶電化學(xué)生物傳感器電極制作工藝簡單，操作方便；能夠通過電化學(xué)方法對(duì)電極進(jìn)行多次修飾并實(shí)現(xiàn)待測(cè)樣品的無酶檢測(cè)；傳感器的再現(xiàn)性、重復(fù)性、穩(wěn)定性好，檢測(cè)限低，測(cè)試靈敏度和準(zhǔn)確度高；成本低，有利于民用化。

附圖說明

圖1為使用本發(fā)明提出的方法制備的基于PEDOT/NiO/CNT復(fù)合材料的無酶電化學(xué)生物傳感器電極的掃描電子顯微鏡(SEM)照片。

圖2為使用本發(fā)明提出的方法制備的基于PEDOT/NiO/CNT復(fù)合材料的無酶電化學(xué)生物傳感器電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑片電極為對(duì)電極在不同的癌胚抗原濃度下測(cè)得差分脈沖伏安(DPV)曲線及工作曲線，圖中a為DPV曲線，b為癌胚抗原樣品的工作曲線，其中，癌胚抗原樣品的線性范圍為：151fg/mL～1510fg/mL。

圖3為使用本發(fā)明提出的方法制備的基于PEDOT/NiO/CNT復(fù)合材料的無酶電化學(xué)生物傳感器電極，檢測(cè)多巴胺、五羥色胺及色氨酸的DPV曲線。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，下述的實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)時(shí)方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1：

一種無酶電化學(xué)生物傳感器電極的制備方法，所述無酶電化學(xué)生物傳感器電極基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化鎳/碳納米管復(fù)合材料，采用電沉積方式一步原位制備聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化鎳/碳納米管復(fù)合材料修飾電極，步驟如下：

(1)工作電極的制備

①將玻碳電極表面進(jìn)行清洗處理：將玻碳電極用氧化鋁粉末拋光成鏡面后，依次用濃度為50wt％的硝酸水溶液、超純水、無水乙醇和超純水中分別超聲清洗10min，去除有機(jī)及無機(jī)污垢，清潔電極表面；

②配制碳納米管、氯化鉀、氯化鎳和3，4-乙烯二氧噻吩的混合溶液，混合溶液中其濃度依次為0.5mg/mL、0.1mol/L、0.2mol/L及2.1g/L；

③清洗干凈的玻碳電極、飽和甘汞電極和鉑片電極組成的三電極系統(tǒng)插入到②所配溶液中采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電沉積處理，然后取出三電極系統(tǒng)用超純水沖洗干凈，獲得PEDOT/Ni/CNT修飾電極，循環(huán)伏安法的參數(shù)中，電位范圍設(shè)置為-0.8V～1.5V，掃描速度為0.1V/s，電壓循環(huán)次數(shù)為52圈；

④再把步驟③中制備的PEDOT/Ni/CNT修飾電極插入到pH值為4～10、濃度為0.1mol/L的磷酸緩沖溶液中，用循環(huán)伏安法對(duì)鎳進(jìn)行氧化處理，取出工作電極用超純水沖洗干凈并氮?dú)獯蹈呻姌O，得到基于PEDOT/NiO/CNT復(fù)合材料的無酶電化學(xué)生物傳感器電極。循環(huán)伏安法的參數(shù)中，電位范圍設(shè)置為-0.8V～1.5V,掃描速度為0.1V/s，電壓循環(huán)次數(shù)為12圈，即制得PEDOT/NiO/CNT復(fù)合材料修飾電極?；赑EDOT/NiO/CNT復(fù)合材料的無酶電化學(xué)生物傳感器電極的SEM照片如圖1所示。

(2)制作電化學(xué)生物傳感器的工作曲線：

將步驟(1)④中得到的工作電極孵育固定癌胚抗體，用牛血清白蛋白封閉非特異性位點(diǎn)：將癌胚抗體用pH值為7.4、濃度為0.1mol/L的磷酸緩沖溶液稀釋，將電極浸入癌胚抗體溶液中37℃恒溫孵育12小時(shí)，清洗干燥后放入1.5wt％的牛血清(BSA)溶液中37℃恒溫密閉放置30min并干燥，即得到固定了癌胚抗體的敏感膜；

再將其插入配制的癌胚抗原(CEA)溶液中37℃恒溫密閉放置30min，最后取出電極用pH值為7.4、濃度為0.1mol/L的磷酸緩沖溶液沖洗并氮?dú)獯蹈呻姌O；

打開電化學(xué)工作站，將固定了癌胚抗原(CEA)的工作電極、對(duì)電極和參比電極正確連接在電化學(xué)工作站中；

以5mL鐵氰化鉀溶液為底液，采用差分脈沖伏安法分別測(cè)定不同濃度的癌胚抗原的峰電流，其中差分脈沖伏安法的參數(shù)中，電位范圍設(shè)置為-1.0V～1.0V；電位增量設(shè)置為0.004V；振幅設(shè)置為0.05V；脈沖寬度設(shè)置為0.06s；脈沖周期設(shè)置為0.5s；鐵氰化鉀溶液的配制方法為0.005mol/L的K₃Fe₄(CN)₆和0.005mol/L的K₄Fe₃(CN)₆溶于0.1mol/L的KCl溶液中。

根據(jù)得到的峰電流與癌胚抗原(CEA)濃度，以CEA濃度為橫坐標(biāo)，峰電流作為縱坐標(biāo)，繪制曲線，進(jìn)行線性擬合獲得工作曲線，如圖2所示。測(cè)定結(jié)果表明：CEA的線性回歸方程為I_CEA(μA)＝84.5-0.043[CEA](fg/mL)，([CEA]：151fg/mL～1510fg/mL，R＝0.996)，檢測(cè)限為0.15pg/mL。

實(shí)施例2：

一種無酶電化學(xué)生物傳感器電極的制備方法，所述無酶電化學(xué)生物傳感器電極基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化鎳/碳納米管復(fù)合材料，采用電沉積方式一步原位制備聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化鎳/碳納米管復(fù)合材料修飾電極，步驟如下：

(1)工作電極的制備

①將玻碳電極表面進(jìn)行清洗處理：將玻碳電極用氧化鋁粉末拋光成鏡面后，依次用濃度為50wt％的硝酸水溶液、超純水、無水乙醇和超純水中分別超聲清洗10min，去除有機(jī)及無機(jī)污垢，清潔電極表面；

②配制碳納米管、氯化鉀、氯化鎳和3，4-乙烯二氧噻吩的混合溶液，這些物質(zhì)的濃度依次為0.5mg/mL、0.1mol/L、0.2mol/L及2.1g/L；

③清洗干凈的玻碳電極、飽和甘汞電極和鉑片電極組成的三電極系統(tǒng)插入到②所配溶液中采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電沉積處理，然后取出三電極系統(tǒng)用超純水沖洗干凈，獲得PEDOT/Ni/CNT修飾電極，循環(huán)伏安法的參數(shù)中，電位范圍設(shè)置為-0.8V～1.5V，掃描速度為0.1V/s，電壓循環(huán)次數(shù)為52圈；

④再把步驟③中制備的PEDOT/Ni/CNT修飾電極插入到pH值范圍為4～10、濃度為0.1mol/L的磷酸緩沖溶液中用循環(huán)伏安法對(duì)鎳進(jìn)行氧化處理，取出工作電極用超純水沖洗干凈并氮?dú)獯蹈呻姌O，得到基于PEDOT/NiO/CNT復(fù)合材料的無酶電化學(xué)生物傳感器電極。循環(huán)伏安法的參數(shù)中，電位范圍設(shè)置為-0.8V～1.5V，掃描速度為0.1V/s，電壓循環(huán)次數(shù)為12圈，基于PEDOT/NiO/CNT復(fù)合材料的無酶電化學(xué)生物傳感器電極的SEM照片如附圖1所示。

(2)繪制DPV曲線：

以磷酸緩沖溶液為底液，配制pH值為7.0的多巴胺溶液、五羥色胺溶液、色氨酸溶液以及三者的混合溶液。其中多巴胺濃度為1μmol/L，五羥色胺濃度為1μmol/L，色氨酸濃度為10μmol/L。

PEDOT/NiO/CNT復(fù)合材料修飾電極、飽和甘汞電極和鉑片電極連接電化學(xué)工作站，并將這三個(gè)電極插入到配制的多巴胺溶液、五羥色胺溶液、色氨酸溶液以及三者的混合溶液中，采用電化學(xué)工作站中的差分脈沖伏安法測(cè)試電流—電壓曲線，如圖3所示。差分脈沖伏安法的參數(shù)中電位范圍設(shè)置為-0.6V～1.2V；電位增量設(shè)置為0.004V，振幅設(shè)置為0.05V，脈沖寬度設(shè)置為0.06s，脈沖周期設(shè)置為0.5s。由于每種待測(cè)物的電化學(xué)響應(yīng)特性不同，在上述步驟中測(cè)試的差分脈沖伏安法電壓—電流曲線中，會(huì)出現(xiàn)這三種待測(cè)物的響應(yīng)特征峰。從曲線中獲得多巴胺、五羥色胺、色氨酸的峰電位依次為0.13V、0.29V、0.59V左右，峰電位差均超過100mV，顯然具有峰分離能力，這些峰電位作為定性指標(biāo)。

本實(shí)施例中，檢測(cè)多巴胺、五羥色胺、色氨酸三種物質(zhì)的濃度依次為1μmol/L、1μmol/L及10μmol/L。當(dāng)采用DPV法對(duì)三種生物分子單獨(dú)及疊加測(cè)試時(shí)，在單獨(dú)溶液及混合物中三者的峰電位保持不變，且峰電流也基本沒有變化，表示本方法制備的基于PEDOT/NiO/CNT復(fù)合材料的無酶電化學(xué)生物傳感器電極對(duì)于多組分同時(shí)測(cè)定具有高的選擇性。