本發(fā)明屬農(nóng)藥檢測領(lǐng)域，具體涉及ⅰ型擬除蟲菊酯流動滯后時間分辨熒光速測試劑盒。

背景技術(shù)：

ⅰ型擬除蟲菊酯主要包括氯菊酯、苯醚菊酯、生物芐呋菊酯、聯(lián)苯菊酯等，被廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、稻米等農(nóng)作物病蟲害的防治中，長期大量使用會使害蟲產(chǎn)生抗藥性，且對環(huán)境和人類安全造成一定的威脅。其限量在0.02ppm-10ppm，如我國國標中規(guī)定蔬菜中醚菊酯的最大殘留限量(mrl)為1ppm，茶葉中醚菊酯的mrl為10ppm；蔬菜和水果中的氯菊酯的mrl分別為1ppm和2ppm。

目前的檢測方法主要是儀器分析法和免疫分析法。免疫分析法是以抗原與抗體的特異性識別作用和可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法，該方法具有很高的選擇性和靈敏度，與儀器分析法相比大大簡化縮短樣品處理時間，節(jié)約了檢測成本。時間分辨熒光免疫分析(trfica)利用190nm銪(eu³⁺)作為高親和力探針制備時間分辨熒光免疫層析試紙條，具有靈敏度高、性質(zhì)穩(wěn)定、避免熒光背景的干擾，檢測時間短(一般檢測只需6-8min)等優(yōu)點，非常適合開發(fā)農(nóng)藥殘留快速檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的問題是提供ⅰ型擬除蟲菊酯流動滯后免疫時間分辨熒光速測試劑盒。

ⅰ型擬除蟲菊酯流動滯后免疫時間分辨熒光速測試劑盒，其特征在于：它包括熒光試紙條和含有銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體凍干品的樣品反應(yīng)瓶，其中：所述的熒光試紙條包括紙板，紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，所述檢測墊以硝酸纖維素膜為基墊，硝酸纖維素膜上自上而下設(shè)置橫向質(zhì)控線和檢測線，所述質(zhì)控線包被有兔抗鼠多克隆抗體，所述檢測線上包被ⅰ型擬除蟲菊酯完全抗原(hapten-1-ova)；

所述的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體由保藏編號為cctccno.c2016164的雜交瘤細胞株qw8#分泌產(chǎn)生，所述的雜交瘤細胞株qw8于2016年8月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為cctccno.c2016164。

按上述方案，所述的ⅰ型擬除蟲菊酯完全抗原(hapten-1-ova)結(jié)構(gòu)式為

具體是將原料3-苯氧基芐醇與丁二酸酐反應(yīng)生成ⅰ型擬除蟲菊酯通用半抗原4-氧代-4-(3-苯氧基芐氧基)丁酸，得半抗原。

(程序如圖1)然后通過活潑酯法與卵清蛋白(ova)進行偶聯(lián)得到。

按上述方案，所述銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體是按照以下方法制得：將抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體用碳酸鹽緩沖溶液透析后和銪標記試劑以質(zhì)量比為0.5～2:1的比例充分混勻后靜置過夜，然后經(jīng)sephadexg-50層析柱分離銪標記的抗醚菊酯通用單克隆抗體，洗脫，收集目標產(chǎn)物。

按上述方案，所述熒光試紙條中的吸水墊長15～20mm，寬3～4mm；檢測墊長25～30mm，寬3～4mm；樣品墊長12～18mm，寬3～4mm，相鄰各墊的交疊長度為1～3mm。

按上述方案，所述熒光試紙條中檢測墊上的檢測線與硝酸纖維素膜上沿的間距為15～20mm，質(zhì)控線和檢測線的間距為5～10mm；所述的樣品反應(yīng)瓶為1-5ml的卡口瓶。

按上述方案，所述熒光試紙條中檢測墊上每厘米檢測線所需的ⅰ型擬除蟲菊酯完全抗原包被量為480-1000ng；每厘米質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆抗體的包被量為100-900ng；所述樣品反應(yīng)瓶中銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體凍干品的含量為0.2-1.0μg。

按上述方案，所述的熒光試紙條是采用以下方法獲得的：

(1)將吸水紙剪裁得吸水墊；

(2)檢測墊的制備：

將醚菊酯完全抗原(hapten-1-ova)配制成濃度為0.2-1.0mg/ml的包被液，用線噴方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上，得到檢測線，然后于37～40℃條件下干燥30～60分鐘；將兔抗鼠多克隆抗體配成濃度為0.10-0.80mg/ml的包被液，用線噴方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上，得質(zhì)控線，然后于37～40℃條件下干燥30～60分鐘；

(3)樣品墊的制備：

將玻璃纖維膜放入封閉液中浸濕，取出，于37～40℃條件下干燥3～6小時，得樣品墊，然后置干燥器中室溫保存；

(4)熒光試紙條的組裝：

在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測墊、樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，即得熒光試紙條。

按上述方案，所述熒光試紙條的制備中配制醚菊酯完全抗原(hapten-1-ova)包被液中所使用的包被緩沖液為：每10ml中含有牛血清白蛋白0.1g，疊氮化鈉0.002g，氯化鈉0.08g，十二水磷酸氫二鈉0.029g，氯化鉀0.002g，磷酸二氫鉀0.002g；

配制兔抗鼠多克隆抗體包被液中所使用的包被緩沖液為：每10ml中含有疊氮化鈉0.002g，氯化鈉0.08g，十二水磷酸氫二鈉0.029g，氯化鉀0.002g，磷酸二氫鉀0.002g；

所述熒光試紙條的制備中使用的封閉液為：每100ml中含有卵清白蛋白0.5-2g，蔗糖2g，疊氮化鈉0.02g，氯化鈉0.8g，十二水磷酸氫二鈉0.29g，氯化鉀0.02g，磷酸二氫鉀0.02g。

按上述方案，所述醚菊酯流動滯后免疫時間分辨熒光速測試劑盒還包括樣品稀釋液及樣品稀釋液吸管，所述的樣品稀釋液為體積分數(shù)為0.01～0.30％的吐溫-20水溶液。

上述ⅰ型擬除蟲菊酯流動滯后免疫時間分辨熒光速測試劑盒在ⅰ型擬除蟲菊酯含量檢測中的應(yīng)用：將待測樣品液加入樣品反應(yīng)瓶中，混勻，插入熒光試紙條，37℃反應(yīng)6分鐘后，用時間分辨熒光測試儀進行檢測，獲得熒光試紙條上檢測線(t)熒光強度值和質(zhì)控線(c)熒光強度值的比值；基于預(yù)先獲得的熒光試紙條檢測線熒光強度與質(zhì)控線熒光強度的比值(t/c)與ⅰ型擬除蟲菊酯濃度的關(guān)系曲線，獲得待測樣品液中ⅰ型擬除蟲菊酯的含量。

按上述方案，所述的熒光試紙條檢測線熒光強度與質(zhì)控線熒光強度的比值(t/c)與ⅰ型擬除蟲菊酯濃度的關(guān)系曲線是采用以下方法得到的：

(1)配制得到一系列濃度的ⅰ型擬除蟲菊酯標準品溶液；

(2)將適量上述各濃度的ⅰ型擬除蟲菊酯標準品溶液分別加入到樣品反應(yīng)瓶中，混勻，插入熒光試紙條，37℃反應(yīng)6分鐘，用時間分辨熒光免疫分析儀檢測得到各熒光試紙條上檢測線(t)和質(zhì)控線(c)的辨熒光強度值，由此獲得各熒光試紙條檢測線熒光強度與質(zhì)控線熒光強度的比值(t/c)；

(3)經(jīng)擬合得到熒光試紙條檢測線熒光強度與質(zhì)控線熒光強度的比值(t/c)與ⅰ型擬除蟲菊酯濃度的關(guān)系曲線。

本研究將醚菊酯通用單克隆抗體qw8#與銪標記試劑相偶聯(lián)，研制出了高靈敏度ⅰ型擬除蟲菊酯時間分辨熒光免疫層析試紙條，利用時間分辨熒光儀進行定量，建立了快速、高靈敏檢測ⅰ型擬除蟲菊酯的時間分辨熒光免疫層析方法。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供的ⅰ型擬除蟲菊酯流動滯后免疫時間分辨熒光速測試劑盒可用于ⅰ型擬除蟲菊酯含量的定量測定，且操作簡單，快速，準確度高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明抗原合成示意圖；

圖2為本發(fā)明提供的ⅰ型擬除蟲菊酯流動滯后免疫時間分辨熒光速測試劑盒中熒光試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中：1樣品墊、2檢測線、3質(zhì)控線、4吸水墊，5檢測墊。

具體實施方式

實施例1抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體的獲得

雜交瘤細胞株qw8#的篩選

1.抗原合成及動物免疫

購買市售3-苯氧基芐醇標準品進行完全抗原合成，具體的合成步驟如下：將4mg3-苯氧基芐醇溶于2ml氯仿，加入50μl丁二酸酐，混合物在室溫下攪拌反應(yīng)過夜；產(chǎn)物蒸干后用乙酸乙酯萃取2次，得有機層，旋轉(zhuǎn)蒸干，得產(chǎn)物hapten-1(圖1)。

取1.0mghapten-1溶于800μldmf中，再分別加入0.2mmol的dcc及0.3mmol的nhs，攪拌反應(yīng)過夜，將混合物逐滴加入4ml10mg/ml的bsa溶液中，室溫反應(yīng)4h；4℃條件下，pbs溶液(磷酸鹽緩沖液，ph7.4)透析3d，除去3-苯氧基芐醇及過量的hapten-1，最后進行常規(guī)紫外掃描法鑒定，鑒定結(jié)果表明制備得到了通用ⅰ型擬除蟲菊酯完全抗原h(huán)apten-1-bsa。

購買同一批次的6～8周齡balb/c雌性小鼠，進行編號。飼養(yǎng)幾天確定小鼠沒有異常，利用合成的完全抗原h(huán)apten-1-bsa進行免疫。免疫劑量為100μg/只，初次免疫選擇弗氏完全佐劑乳化，進行頸背部皮下多點注射免疫，初免間隔4周，以后間隔三周進行2、3、4次免疫，使用弗氏不完全佐劑。前3次每次免疫后一周，尾靜脈采血，分離血清，采用間接elisa法監(jiān)測小鼠血清抗體效價。第4次免疫后一周，尾靜脈采血，分離血清，采用間接elisa法監(jiān)測小鼠血清抗體效價，并用間接競爭elisa法測定小鼠血清靈敏度，選擇效價、靈敏度均相對較高的血清對應(yīng)的小鼠進行最后一次加強免疫，融合前3天取200μg免疫原溶于200μl生理鹽水直接進行腹腔注射，無需乳化。

醚菊酯、氯菊酯、苯醚菊酯購于sigma-aldrich公司。

2.細胞融合

最后一次加強免疫3天后，采用50％(重量百分數(shù))的聚乙二醇即peg(分子量為1450)作融合劑，按常規(guī)方法進行細胞融合，具體步驟如下：

頸椎脫臼法處死免疫小鼠，在無菌條件下取脾臟，分離脾細胞，與鼠源骨髓瘤細胞sp2/0以5∶1的個數(shù)比混合，用rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗混合細胞，然后用50％peg融合，融合時間1分鐘，然后加滿rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心，移去上清，小鼠脾細胞和鼠源骨髓瘤細胞sp2/0形成的融合細胞用72mlrpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，將重懸起來的細胞滴加到96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，2滴/孔，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，所述rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含有20％(體積百分數(shù))胎牛血清，2％(重量百分數(shù))生長因子和1％(重量百分數(shù))次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷。

上述sp2/0購于上海泛柯生物科技有限公司；rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液購于hyclone公司；1％次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(hat)購于sigma-aldrich公司。

3.細胞株的篩選及克隆

為了篩選到目標陽性雜交瘤細胞株-特異性強、靈敏度高的抗含二苯醚結(jié)構(gòu)的擬除蟲菊酯細胞株(用醚菊酯標準品進行篩選)，本實驗對傳統(tǒng)的常規(guī)兩步篩選法進行了改進，在間接競爭elisa篩選過程中采用梯度篩選法：(1)第一步利用間接非競爭elisa，篩選出識別二苯醚結(jié)構(gòu)但不識別載體蛋白(bsa)的陽性孔。(2)第二步利用間接競爭elisa采用梯度篩選法，初次亞克隆后的檢測使用5μg/ml的醚菊酯標準品，第二次亞克隆后檢測加入2μg/ml的醚菊酯標準品，第三次亞克隆加入1μg/ml的醚菊酯標準品。從陽性孔中選擇b/b0相對較小的。其中，b為不加醚菊酯標準品的對照吸光值，b0為加醚菊酯標準品的吸光值。采用有限稀釋法進行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步法進行檢測，如此重復(fù)克隆2-3次后，獲得雜交瘤細胞株3g1。

抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體雜交瘤細胞株系qw8#抗體可變區(qū)序列測定

(1)提取總rna：采用天根公司的總rna提取試劑盒并按照說明書提取可產(chǎn)生雜交瘤細胞株qw8#的總rna；

(2)合成cdna：以步驟1獲得的總rna為模板，oligo(dt)15為引物，按照superscripttm-2ii反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行反轉(zhuǎn)錄，合成cdna第一鏈；引物oligo(dt)15由invitrogen購得；

(3)pcr法克隆可變區(qū)基因：根據(jù)genbank中小鼠抗體基因序列的保守位點設(shè)計引物，以cdna為模版擴增抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因。pcr程序為：94℃30s、55℃50s、70℃1min，擴增30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)過1％(重量百分數(shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用試劑盒純化回收dna片段，連接在載體pmd18-t中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，送至蘇州泓迅生物科技有限公司進行測序。其中引物的序列分別為：重鏈可變區(qū)引物5’-aagcagtggtatcaacgcagagtacatgggg-3’(31mer)和5’-caggggccagtggatagacag-3’(21mer),輕鏈可變區(qū)引物為5’-gcagtggtatcaacgcagagtacatggggg-3’(30mer)和5’-ctaagcctgactgatggcgaag-3’(22mer)。

得到的基因序列結(jié)果：重鏈可變區(qū)編碼基因序列長363bp，序列如seqidno:1所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的重鏈可變區(qū)由121個氨基酸組成，序列如seqidno:3所示。輕鏈可變區(qū)編碼基因序列長327bp,序列如seqidno:2所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的輕鏈可變區(qū)由109個氨基酸組成，序列如seqidno:4所示。

抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體的制備純化、亞型和特性鑒定

將獲得的ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體雜交瘤細胞株系qw8#注射預(yù)先用弗氏不完全佐劑處理過的balb/c小鼠，收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作為：將腹水從-20℃冰箱拿出室溫解凍。腹水用雙層濾紙過濾初步除去脂肪片、細胞碎片及其他雜質(zhì)。12000r/min，離心15min，取上清，棄沉淀。精確量腹水體積。取一份體積的腹水與3份體積的醋酸鹽緩沖液磁力攪拌混勻，用2mol/lhcl調(diào)ph至4.5-4.8。在磁力攪拌下緩慢加入正辛酸，每1ml腹水加33μl正辛酸，加完后室溫磁力攪拌半小時，后置4℃靜置2h。然后12000r/min，離心5min，取上清，雙層濾紙過濾，收集濾液。量取濾液體積，加入1/10體積的0.1mph＝7.4的pbs,用2mol/lnaoh(記錄naoh體積)調(diào)ph至7.4。將上清冰浴預(yù)冷，加硫酸銨固體至0.277g/ml，邊加邊攪拌，并于30min內(nèi)加完，置4℃過夜。之后12000r/min，離心上述液體15min，棄上清。用一定體積的0.01mol/lpbs溶解沉淀。0.01mol/lpbs透析兩天。收集透析液，12000r/min，離心15min，取上清，置-20℃預(yù)凍后真空凍干成粉保存。

所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141ml醋酸加水定容至100ml所得；所述的0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.02g，加水定容至100ml所得。

用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細胞株qw8#分泌的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體的亞型為igg2a。

利用間接非競爭elisa測定qw8#的親和力。用hapten-1-bsa按2.0、1.0、0.5、0.25μg/ml濃度包被酶標板，100μl/孔，37℃，2h；封閉液封閉1h后，將用pbs稀釋好的抗體(稀釋因子1：2)加入酶標板，其余步驟同間接非競爭elisa方法。以測定的od450值為縱坐標，抗體濃度(mol/l)的對數(shù)值為橫坐標，做出4個濃度對應(yīng)的4條s形曲線。找出每條s曲線最頂部的最大od值即odmax，找出每條曲線50％odmax值對應(yīng)的抗體濃度。將4個濃度兩兩一組，根據(jù)公式ka＝(n-1)/2(n[ab’]t-[ab]t)計算抗體的親和力常數(shù)，其中[ab’]t、[ab]t為每組中兩個50％最大od值對應(yīng)的抗體濃度，n為每組中包被抗原濃度的倍數(shù)。得抗ⅰ型擬除蟲菊酯小鼠腹水抗體酶聯(lián)免疫吸附分析(elisa)法親和力可達2.16×10⁸l/mol。用常規(guī)間接競爭elisa法鑒定抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體對醚菊酯的ic50值為20.86μg/l，最低檢出限為3.16μg/l；對氯菊酯的ic50值為24.2μg/l，最低檢出限為3.72μg/l，對苯醚菊酯的ic50值為29.4μg/l，最低檢出限為4.27μg/l。對其他ⅰ型和ⅱ型擬除蟲菊酯菊酯的交叉反應(yīng)率均小于1％。

實施例2：ⅰ型擬除蟲菊酯免疫時間分辨熒光速測試劑盒及其應(yīng)用

ⅰ型擬除蟲菊酯流動滯后免疫時間分辨熒光速測試劑盒,它包括熒光試紙條、含有銪標記的抗醚菊酯通用單克隆抗體凍干品的樣品反應(yīng)瓶、樣品稀釋液及樣品稀釋液吸管，所述的熒光試紙條包括紙板，紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，交疊長度為1mm，其中：吸水墊長15mm，寬4mm；檢測墊長25mm，寬4mm；樣品墊長13mm，寬4mm。所述檢測墊以硝酸纖維素膜為基墊，硝酸纖維素膜上自上而下設(shè)置橫向質(zhì)控線和檢測線，所述質(zhì)控線包被有兔抗鼠多克隆抗體，所述檢測線上包被ⅰ型擬除蟲菊酯完全抗原，，檢測線與硝酸纖維素膜上沿的間距為15mm，質(zhì)控線和檢測線的間距為5mm。

所述熒光試紙條的獲得：

(1)吸水墊的制備

將吸水紙剪裁成長15mm，寬4mm的規(guī)格，即得吸水墊；

(2)檢測墊的制備

檢測線的包被：

將ⅰ型擬除蟲菊酯完全抗原(hapten-1-ova)用包被緩沖液配制成濃度為0.8mg/ml的包被液；于距硝酸纖維素膜上沿15mm的位置，用線噴方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上，得到檢測線，每厘米檢測線所需hapten-1-ova的包被量為480ng，然后于37℃條件下干燥30分鐘；

所述的包被緩沖液為：0.1g牛血清白蛋白，0.002g疊氮化鈉，0.08g氯化鈉，0.029g十二水磷酸氫二鈉，0.002g氯化鉀，0.002g磷酸二氫鉀，加水定容到10ml所得；

質(zhì)控線的包被：

將兔抗鼠多克隆抗體用包被緩沖液配成濃度為0.25mg/ml的包被液；于距檢測線6mm的位置，用線噴方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上，得質(zhì)控線，每厘米質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆抗體的包被量為100ng，然后于37℃條件下干燥1小時；

所述的包被緩沖液為0.002g疊氮化鈉，0.08g氯化鈉，0.029g十二水磷酸氫二鈉，0.002g氯化鉀，0.002g磷酸二氫鉀，加水定容至10ml所得；

(3)樣品墊的制備：

將玻璃纖維膜剪裁成長13mm，寬4mm的規(guī)格，放入封閉液中浸濕，取出，于37℃條件下干燥6小時，得樣品墊，然后置干燥器中室溫保存；

所述的封閉液為1g卵清白蛋白，2g蔗糖，0.02g疊氮化鈉，0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容至100ml所得；

(4)熒光試紙條的組裝：

在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測墊、熒光標記抗體反應(yīng)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，交疊長度為2mm，即得熒光試紙條(見圖2)。

所述銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體的獲得：

取1mg上述通用單克隆抗體，用100mmol/lph9.3的碳酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌6次后，將其和2mg銪標記試劑充分混勻，于4℃過夜。然后將其加入到1.9cm×60cm的sephadexg-50層析柱中，用含0.9％nacl的50mmol/ltris-hcl洗脫液洗脫，收集流出液(1ml/管)，逐管測量吸光值(a280nm)，合并峰管，獲得目標產(chǎn)物銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體。上述銪標記試劑購于上海優(yōu)你生物科技有限公司，但不限于此。

所述含有銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體凍干粉的樣品反應(yīng)瓶的獲得：取上述銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體0.25μg放于3ml卡口瓶中，采用常規(guī)冷凍真空干燥方法抽干后，即得銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體凍干粉，4℃保存，備用。

上述流動滯后免疫時間分辨熒光速測試劑盒在白菜樣品ⅰ型擬除蟲菊酯檢測中的應(yīng)用：

ⅰ熒光試紙條檢測線熒光強度與質(zhì)控線熒光強度的比(t/c)與ⅰ型擬除蟲菊酯濃度的關(guān)系曲線的建立：

(1)對經(jīng)高效液相色譜(hplc)檢測醚菊酯、氯菊酯和苯醚菊酯為陰性的白菜樣品進行前處理，將醚菊酯、氯菊酯和苯醚菊酯以1：1：1的比例加標至濃度為10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml的標準溶液。

(2)取上述各濃度的ⅰ型擬除蟲菊酯標準品溶液各100μl，分別加入到樣品反應(yīng)瓶中，混勻，插入熒光試紙條，37℃反應(yīng)6分鐘，用吸水紙吸干樣品墊殘留液體，即刻用時間分辨熒光免疫分析儀檢測(激發(fā)波長：365nm，測定波長：615nm)，得到各熒光試紙條上檢測線處(t)和質(zhì)控線(c)處的熒光強度值，由此獲得各熒光試紙條檢測線熒光強度與質(zhì)控線熒光強度的比值(t/c)；

(3)以標準品濃度為橫坐標，t/c值為縱坐標，建立標準曲線。其定量檢測限為9.12ng/ml。

(4)在白菜空白樣品中添加醚菊酯、氯菊酯和苯醚菊酯混合標準品濃度為2μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml，以熒光試紙條測得ⅰ型擬除蟲菊酯濃度為橫坐標，hplc測得ⅰ型擬除蟲菊酯濃度為縱坐標，該方法的添加回收率在90.4％-118.1％之間。

實施例5：ⅰ型擬除蟲菊酯流動滯后免疫時間分辨熒光速測試劑盒及其應(yīng)用

ⅰ型擬除蟲菊酯流動滯后免疫時間分辨熒光速測試劑盒，它包括熒光試紙條、含有銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體凍干品的樣品反應(yīng)瓶、樣品稀釋液及樣品稀釋液吸管，所述的熒光試紙條包括紙板，紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，交疊長度為1mm，其中：吸水墊長18mm，寬3mm；檢測墊長28mm，寬3mm；樣品墊長15mm，寬3mm。所述檢測墊以硝酸纖維素膜為基墊，硝酸纖維素膜上自上而下設(shè)置橫向質(zhì)控線和檢測線，所述質(zhì)控線包被有兔抗鼠多克隆抗體，其包被量為150ng/cm質(zhì)控線，所述檢測線上包被ⅰ型擬除蟲菊酯完全抗原(hapten-1-ova)，其包被量為550ng/cm檢測線，檢測線與硝酸纖維素膜上沿的間距為20mm，質(zhì)控線和檢測線的間距為10mm。

所述熒光試紙條的獲得：

(1)吸水墊的制備

將吸水紙剪裁成長18mm，寬3mm的規(guī)格，即得吸水墊；

(2)檢測墊的制備

檢測線的包被：

將醚菊酯完全抗原(醚菊酯完全抗原(hapten-1-ova))用包被緩沖液配制成濃度為0.8mg/ml的包被液；于距硝酸纖維素膜上沿20mm的位置，用線噴方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上，得到檢測線，每厘米檢測線所需的醚菊酯完全抗原(hapten-1-ova)包被量為480ng，然后于40℃條件下干燥30分鐘；

所述的包被緩沖液為：0.1g牛血清白蛋白，0.002g疊氮化鈉，0.08g氯化鈉，0.029g十二水磷酸氫二鈉，0.002g氯化鉀，0.002g磷酸二氫鉀，加水定容到10ml所得；

質(zhì)控線的包被：

將兔抗鼠多克隆抗體用包被緩沖液配成濃度為0.25mg/ml的包被液；于距檢測線6mm的位置，用線噴方式將其橫向包被于硝酸纖維素膜上，得質(zhì)控線，每厘米質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆抗體的包被量為100ng，然后于40℃條件下干燥30min；

所述的包被緩沖液為0.002g疊氮化鈉，0.08g氯化鈉，0.029g十二水磷酸氫二鈉，0.002g氯化鉀，0.002g磷酸二氫鉀，加水定容至10ml所得；

所述的硝酸纖維素膜長28mm，寬3mm。

(3)樣品墊的制備：

將玻璃纖維膜剪裁成長15mm，寬3mm的規(guī)格，放入封閉液中浸濕，取出，于37℃條件下干燥6小時，得樣品墊，然后置干燥器中室溫保存；

所述的封閉液為1g卵清白蛋白，2g蔗糖，0.02g疊氮化鈉，0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容至100ml所得；

(4)熒光試紙條的組裝：

在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊。相鄰各部分在連接處交疊連接，交疊長度為2mm，即得熒光試紙條。

所述銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體的獲得：

取1mg上述實施例3中的通用單克隆抗體，用100mmol/lph9.3的碳酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌6次后，將其和2mg銪標記試劑充分混勻，于4℃過夜。然后將其加入到1.9cm×60cm的sephadexg-50層析柱中，用含0.9％nacl的50mmol/ltris-hcl洗脫液洗脫，收集流出液(1ml/管)，逐管測量吸光值(a280nm)，合并峰管，獲得目標產(chǎn)物銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體。上述銪標記試劑購于上海優(yōu)你生物科技有限公司，但不限于此。

所述含有銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體凍干粉的樣品反應(yīng)瓶的獲得：取上述銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體0.25μg放于3ml卡口瓶中，采用常規(guī)冷凍真空干燥方法抽干后，既得銪標記的抗ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體凍干粉，4℃保存，備用。

所述的樣品稀釋液為：體積分數(shù)為0.30％的吐溫20水溶液。

上述流動滯后免疫時間分辨熒光速測試劑盒在白菜樣品ⅰ型擬除蟲菊酯檢測中的應(yīng)用：

取待測白菜樣品五個，前處理后取200μl加入樣品反應(yīng)瓶中，混勻，插入熒光試紙條，37℃反應(yīng)6分鐘后，用吸水紙吸干樣品墊殘留液體，立即用時間分辨熒光免疫分析儀檢測(激發(fā)波長：365nm，測定波長：615nm)，獲得各熒光試紙條檢測線熒光強度與質(zhì)控線熒光強度的比值(t/c)，然后將其代入熒光試紙條檢測線熒光強度與質(zhì)控熒光強度的比值(t/c)與ⅰ型擬除蟲菊酯濃度的關(guān)系曲線，得：檢測回收率在94.48％-112.2％之間，試劑盒與hplc檢測結(jié)果相關(guān)系數(shù)達到0.986(r²)。

序列表

＜110＞中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所

＜120＞ⅰ型擬除蟲菊酯流動滯后免疫時間分辨熒光速測試劑盒

＜160＞4

＜210＞1

＜211＞363bp

＜212＞dna

＜213＞小鼠

＜400＞1

caggttactttgaaagagtctggccctgggatattgcagccctcccagac50

cctcagtctgacttgttctttctctgggttttcactgagcacttatggta100

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tacggccgccccttctatgctatggactactggggtcaaggaaccacagt350

caccgtctcctca363

＜210＞1

＜211＞327

＜212＞dna

＜213＞小鼠

＜400＞2

caggctgttgtgactcaggaatctgcactcaccacatcacctggtgaaac50

agtcacactcacttgtcgctcaagtactggggctgttacaactagtaact100

atgtcaactgggtccaagaaaaaccagatcatttattcactggtctaata150

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atgaggcaatatatttctgtgctctatggtacagcaaccattgggtgttc300

ggtggaggaaccaaactgactgtccta327

＜210＞1

＜211＞121

＜212＞prt

＜213＞小鼠

＜400＞3

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glnthrleuserleuthrcysserpheserglypheserleuser30

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＜210＞1

＜211＞109

＜212＞prt

＜213＞小鼠

＜400＞4

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leuthrvalleu109