本發(fā)明涉及顆粒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是涉及一種基于非均勻電場(chǎng)的阻抗脈沖顆粒計(jì)數(shù)裝置及其計(jì)數(shù)方法。

背景技術(shù)：

準(zhǔn)確地對(duì)樣品中顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)在多個(gè)領(lǐng)域具有重要的意義和需求；例如，在生物醫(yī)學(xué)研究、公眾健康檢測(cè)和海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，對(duì)研究用于確定目標(biāo)物(如細(xì)菌、病毒和海洋微生物等)的個(gè)數(shù)的便攜式顆?？焖儆?jì)數(shù)裝置或方法，一直有著迫切的需求。

目前現(xiàn)有常用的顆粒計(jì)數(shù)的方法包括下述幾種：

1)光阻法(光學(xué)干涉原理)：光阻法是目前應(yīng)用最為廣泛的顆粒計(jì)數(shù)方法，又稱(chēng)光障礙法或光遮擋法，是利用微粒對(duì)光的遮擋所發(fā)生的光強(qiáng)度變化進(jìn)行微粒粒徑檢測(cè)的方法。此方法原理簡(jiǎn)單，但需要較為昂貴且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，而且檢測(cè)精度低；

2)電感法：電感法利用顆粒通過(guò)檢測(cè)微孔時(shí)會(huì)改變微孔電感的現(xiàn)象，對(duì)檢測(cè)微孔電感信號(hào)的變化加以監(jiān)測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)顆粒計(jì)數(shù)。此方法原理簡(jiǎn)單，可以對(duì)各種金屬顆粒進(jìn)行檢測(cè)，但僅適用于金屬顆粒，檢測(cè)精度也受限；

3)電容法：電容法是一種非接觸式檢測(cè)方法，當(dāng)顆粒經(jīng)過(guò)檢測(cè)微孔時(shí)，會(huì)改變微孔的電容，通過(guò)監(jiān)測(cè)微孔電容信號(hào)的變化，可以實(shí)現(xiàn)顆粒計(jì)數(shù)。此方法可以用于低導(dǎo)電溶液(例如油液)中的顆粒計(jì)數(shù)，且電容檢測(cè)對(duì)象主要為金屬顆粒，但微小電容的檢測(cè)依賴(lài)于高精度的檢測(cè)儀器，因而限制了其便攜化發(fā)展。

4)激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法：顆粒在激光照射后自帶熒光，可以被光電傳感器檢測(cè)到并實(shí)現(xiàn)顆粒計(jì)數(shù)。此方法尤其適用于血液分析、免疫學(xué)和微生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，檢測(cè)方便，但是檢測(cè)前必須對(duì)樣品進(jìn)行處理，檢測(cè)所用光學(xué)元件成本高且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無(wú)法檢測(cè)極微小的顆粒；

5)電阻脈沖法(RPS)：電阻脈沖法是基于當(dāng)顆粒流經(jīng)存在電場(chǎng)的微孔，微孔處兩端電壓變化而產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)；此方法操作簡(jiǎn)便，是目前精度最高的顆粒計(jì)數(shù)方法。

微流控芯片裝置可以將生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過(guò)程的樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等基本操作集成到一塊微米尺度的芯片上，自動(dòng)完成分析全過(guò)程。它具有液體流動(dòng)可控、消耗試劑和試樣極少、分析速度成十倍上百倍地提高等特點(diǎn)，可以在幾分鐘甚至更短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行上百個(gè)樣品的同時(shí)分析，并且能在線(xiàn)實(shí)現(xiàn)樣品的預(yù)處理及分析全過(guò)程。

隨著近年來(lái)微流控芯片加工技術(shù)的快速發(fā)展，目前已有許多在微流控芯片上利用RPS法對(duì)微納顆粒、細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等進(jìn)行計(jì)數(shù)的研究報(bào)道。如，典型的微流控RPS計(jì)數(shù)芯片是在一條數(shù)百微米寬的主通道中部加工出一段線(xiàn)寬比待檢測(cè)顆粒稍大的檢測(cè)通道，然后在主通道兩端施加一直流電場(chǎng)；當(dāng)溶液中的絕緣顆粒經(jīng)過(guò)檢測(cè)通道時(shí)會(huì)使其兩端分電壓變化，通過(guò)采用合適的信號(hào)采集系統(tǒng)獲得一個(gè)脈沖信號(hào)，脈沖信號(hào)的個(gè)數(shù)即為顆粒的個(gè)數(shù)。為方便的獲取檢測(cè)通道兩邊電壓的變化，人們發(fā)明了不同的芯片結(jié)構(gòu)。

最初的檢測(cè)芯片結(jié)構(gòu)僅包括一條數(shù)百微米寬的主通道和設(shè)置于主通道中部的一段線(xiàn)寬比待測(cè)顆粒稍大的檢測(cè)通道，通過(guò)將插在主通道兩端的鉑電極串聯(lián)電阻后與直流電源兩端相連，并通過(guò)放大電阻兩端電壓信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)顆粒計(jì)數(shù)，但是此方法系統(tǒng)噪音大，信噪比低，所以檢測(cè)精度低；后來(lái)的檢測(cè)芯片在檢測(cè)通道前后各設(shè)立了一條檢測(cè)臂通道，用電極直接測(cè)量通道兩端電壓信號(hào)，再通過(guò)差分放大，使檢測(cè)信噪比得以提高，進(jìn)而使得檢測(cè)精度升高；最新的計(jì)數(shù)芯片采用了公共進(jìn)液孔多通道環(huán)形分布的結(jié)構(gòu)，每條通道都包括主通道、檢測(cè)通道和儲(chǔ)液孔等，其進(jìn)液孔連接電源正極，各儲(chǔ)液孔串聯(lián)電阻后連接電源負(fù)極，各通道相互作為參考，當(dāng)前的計(jì)數(shù)芯片可以較好地消除系統(tǒng)噪音，通過(guò)控制各通道依次工作，實(shí)現(xiàn)高通量計(jì)數(shù)。但是需要說(shuō)明的是，當(dāng)前的計(jì)數(shù)芯片為了得到較高的檢測(cè)信噪比，往往需要使得檢測(cè)通道尺寸和顆粒的尺寸相近，則對(duì)應(yīng)納米顆粒的檢測(cè)也相應(yīng)的需要加工出納米尺寸的檢測(cè)通道，但是這就需要極為復(fù)雜的加工步驟和昂貴的加工設(shè)備。

此外，由于檢測(cè)通道的尺寸和顆粒較為接近，也容易造成顆粒阻塞檢測(cè)通道；同時(shí)，溶液中的雜質(zhì)也會(huì)造成檢測(cè)通道的部分甚至完全堵塞，使得顆粒粒徑檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)誤差或者檢測(cè)中斷，影響了系統(tǒng)的精度和穩(wěn)定運(yùn)行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于已有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是要提供一種基于非均勻電場(chǎng)的阻抗脈沖顆粒計(jì)數(shù)裝置，檢測(cè)過(guò)程中，所述待測(cè)顆粒從樣品通道進(jìn)入主通道，然后流經(jīng)主通道與樣品通道交界處，即顆粒不進(jìn)入檢測(cè)通道，從而有效提高了檢測(cè)精度及抗通道阻塞能力。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種基于非均勻電場(chǎng)的阻抗脈沖顆粒計(jì)數(shù)裝置，其包括玻璃底片、PDMS微流控芯片、信號(hào)放大元件以及信號(hào)采集控制系統(tǒng)，所述PDMS微流控芯片凹刻有微通道的一側(cè)與所述玻璃底片封裝為一體，以形成供待測(cè)樣品流通的微通道，其特征在于，所述微通道包括：

兩端分別設(shè)有進(jìn)油儲(chǔ)液孔和出油儲(chǔ)液孔的主通道；

自所述主通道中間位置，向遠(yuǎn)離所述主通道的方向延伸的進(jìn)樣通道，該進(jìn)樣通道末端設(shè)置有進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔；

自距離所述主通道與所述進(jìn)樣通道相交處一定距離的位置，向遠(yuǎn)離所述主通道的方向延伸的檢測(cè)通道，該檢測(cè)通道的寬度與主通道的寬度比值固定且末端設(shè)置有檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔；

同時(shí)所述進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔和檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔內(nèi)均插入鉑電極，所述進(jìn)樣通道孔內(nèi)的鉑電極通過(guò)一參考電阻與直流電源的正極連接，所述檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔內(nèi)的鉑電極與上述直流電源的負(fù)極連接；所述參考電阻的兩端均通過(guò)導(dǎo)線(xiàn)與所述信號(hào)放大元件的輸入端連接，所述信號(hào)放大元件的輸出端與所述信號(hào)采集控制系統(tǒng)連接。

進(jìn)一步的，作為本發(fā)明的優(yōu)選：

所述檢測(cè)通道與主通道成一定角度，且其與主通道的寬度比值優(yōu)選采用1/200。

進(jìn)一步的，作為本發(fā)明的優(yōu)選：

所述信號(hào)放大元件采用差分放大器元件。

進(jìn)一步的，作為本發(fā)明的優(yōu)選：

所述信號(hào)采集控制系統(tǒng)包括NI采集卡和計(jì)算機(jī)。

本發(fā)明另一目的是要提供一種基于上述顆粒計(jì)數(shù)裝置進(jìn)行顆粒計(jì)數(shù)的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)樣品滴加：首先在所述進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔和檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔中滴加一定量的PBS緩沖液，在主通道進(jìn)油儲(chǔ)液孔中滴加一定量的十二烷，然后將一定量的待測(cè)樣品滴入到所述進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔中；

2)樣品輸運(yùn)：接通所述直流電源，使得所述進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔中的待測(cè)樣品在電滲流和壓力作用下輸運(yùn)至所述主通道，然后在主通道壓差驅(qū)動(dòng)下流向主通道的出油儲(chǔ)液孔；

3)信號(hào)放大采集分析：通過(guò)檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔及進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔內(nèi)的鉑電極采集參考電阻兩端的電壓脈沖信號(hào)，采集到的信號(hào)通過(guò)與參考電阻連接的差分放大器放大后，由信號(hào)采集控制系統(tǒng)進(jìn)行記錄并顯示相應(yīng)的檢測(cè)數(shù)據(jù)，即檢測(cè)樣品顆粒的個(gè)數(shù)；前述所述顆粒的個(gè)數(shù)檢測(cè)值等于檢測(cè)通道脈沖信號(hào)的個(gè)數(shù)。

檢測(cè)過(guò)程中使用十二烷將顆粒溶液聚焦流經(jīng)主通道與檢測(cè)通道交界處。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

1)本發(fā)明在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其待測(cè)樣品顆粒不進(jìn)入檢測(cè)通道，從而不會(huì)造成通道堵塞的現(xiàn)象，檢測(cè)穩(wěn)定性高；

2)本發(fā)明通過(guò)增大主通道與檢測(cè)通道的比值來(lái)不斷提高檢測(cè)信號(hào)的信噪比，從而提高檢測(cè)精度。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明計(jì)數(shù)裝置的微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖。

圖中：M、微流控芯片，L、玻璃底片，A、主通道進(jìn)油儲(chǔ)液孔，B、主通道出油儲(chǔ)液孔，C、進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔，D、檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔，1、主通道，2、進(jìn)樣通道，3、檢測(cè)通道。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

顆粒流經(jīng)存在電場(chǎng)的微孔時(shí)，會(huì)對(duì)電場(chǎng)產(chǎn)生明顯的擾動(dòng)，相應(yīng)的微孔處兩端電壓變化而產(chǎn)生電壓脈沖信號(hào)。檢測(cè)電壓脈沖信號(hào)的個(gè)數(shù)，即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)樣品顆粒的個(gè)數(shù)。

基于上述設(shè)計(jì)背景，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種基于非均勻電場(chǎng)的阻抗脈沖顆粒計(jì)數(shù)裝置及其計(jì)數(shù)方法，下面結(jié)合附圖以及具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案：

如圖1所示，一種基于非均勻電場(chǎng)的阻抗脈沖顆粒計(jì)數(shù)裝置，其包括玻璃底片L、PDMS微流控芯片M、信號(hào)放大元件以及信號(hào)采集控制系統(tǒng)。

所述PDMS微流控芯片凹刻有微通道的一側(cè)與所述玻璃底片封裝為一體，以形成供待測(cè)樣品流通的微通道，其特征在于，所述微通道包括：兩端分別設(shè)有進(jìn)油儲(chǔ)液孔和出油儲(chǔ)液孔的主通道；自所述主通道中間位置，向遠(yuǎn)離所述主通道的方向延伸的進(jìn)樣通道，該進(jìn)樣通道末端設(shè)置有進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔，且該進(jìn)樣通道的寬度與主通道的寬度比值固定，優(yōu)選為1/10；自距離所述主通道與所述進(jìn)樣通道相交處一定距離的位置，向與所述主通道成一定角度的方向延伸的檢測(cè)通道，優(yōu)選地該檢測(cè)通道的寬度與主通道的寬度比值為1/200，且末端設(shè)置有檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔。

所述進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔和檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔內(nèi)均插入鉑電極。所述進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔內(nèi)的鉑電極通過(guò)一參考電阻與直流電源的正極連接，所述檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔內(nèi)的鉑電極與上述直流電源的負(fù)極連接，用以實(shí)現(xiàn)待測(cè)樣品自進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔從進(jìn)樣通道流入主通道的電滲運(yùn)輸過(guò)程；樣品流入主通道后，在壓差驅(qū)動(dòng)下流向主通道出油儲(chǔ)液孔；

所述參考電阻的兩端均通過(guò)導(dǎo)線(xiàn)與所述信號(hào)放大元件的輸入端連接。優(yōu)選地，所述信號(hào)放大元件采用差分放大器元件。

所述信號(hào)放大元件的輸出端與所述信號(hào)采集控制系統(tǒng)連接，用以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)通道內(nèi)待測(cè)樣品顆粒個(gè)數(shù)信號(hào)的放大采集檢測(cè)過(guò)程。優(yōu)選地，所述信號(hào)采集控制系統(tǒng)包括NI采集卡和計(jì)算機(jī)。

下面以聚苯乙烯樣品顆粒為例進(jìn)行檢測(cè)，如圖2所示：

本實(shí)施案例的裝置參數(shù)：本實(shí)施案例所用的芯片檢測(cè)通道的尺寸1*5μm(寬×高)，各儲(chǔ)液孔到芯片主通道中間的距離是5cm，主微通道尺寸是200*5μm(寬×高)，進(jìn)樣通道尺寸是20*5μm(寬×高)；待檢測(cè)樣品為3μm聚苯乙烯顆粒溶液；緩沖液為PBS(1×)溶液；施加于進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔與檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔的電壓為48V；

該裝置包括位于所述PDMS微流控芯片上的主通道進(jìn)油儲(chǔ)液孔A、主通道出油儲(chǔ)液孔B、進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔C和檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔D以及主通道1、進(jìn)樣通道2和檢測(cè)通道3。在進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔C和檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔D中插入鉑電極，并通過(guò)電阻R連接至直流電源兩端；在電阻R兩端通過(guò)兩根導(dǎo)線(xiàn)并聯(lián)于一差分放大器的兩個(gè)輸入端；差分放大器的輸出端連接至NI數(shù)據(jù)采集卡的輸入端；NI輸出信號(hào)可以直接在所連接的計(jì)算機(jī)顯示并進(jìn)行分析。

基于上述顆粒計(jì)數(shù)裝置進(jìn)行顆粒計(jì)數(shù)的方法，包括如下步驟：

1)樣品滴加：首先在進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔和檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔中滴加一定量的PBS緩沖液，在主通道進(jìn)油孔中滴加一定量十二烷，保證油液壓力一直大于溶液壓力，然后將一定量的待測(cè)樣品滴加入到樣品通道進(jìn)液孔中；

2)樣品輸運(yùn)：接通直流電源，進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔C中的樣品由于電滲流和壓力作用被輸運(yùn)至主通道中，然后在主通道壓差驅(qū)動(dòng)下流向主通道出油儲(chǔ)液孔B，檢測(cè)過(guò)程中待測(cè)顆粒從樣品通道進(jìn)入主通道，然后流經(jīng)主通道與樣品通道交界處，即顆粒不進(jìn)入檢測(cè)通道。由于油液不導(dǎo)電，通道中油液所在區(qū)域不會(huì)存在電場(chǎng)，因此，通過(guò)控制油水界面的位置能夠限制電場(chǎng)的分布。實(shí)際中，需要保證主通道在與檢測(cè)通道交界處的油水界面到檢測(cè)通道的距離僅為待測(cè)顆粒粒徑的2‐3倍。

由于僅在進(jìn)樣通道和檢測(cè)通道施加電場(chǎng)，并且檢測(cè)通道的寬度很窄，因此檢測(cè)通道與主通道交界區(qū)域的電場(chǎng)強(qiáng)度很大(即電力線(xiàn)很密集)。當(dāng)顆粒經(jīng)過(guò)檢測(cè)通道與主通道交界區(qū)域時(shí)，會(huì)很容易擾動(dòng)電場(chǎng)線(xiàn)，使檢測(cè)通道分電壓發(fā)生變化，進(jìn)一步導(dǎo)致電阻R兩端的電壓變化，產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，檢測(cè)信號(hào)經(jīng)過(guò)AD620差分放大器差分信號(hào)放大后輸入至NI采集卡，NI采集卡輸出信號(hào)可以直接在所連接的計(jì)算機(jī)上顯示并進(jìn)行分析。

3)信號(hào)放大采集分析：通過(guò)檢測(cè)通道儲(chǔ)液孔及進(jìn)樣通道儲(chǔ)液孔內(nèi)的鉑電極采集參考電阻兩端的電壓脈沖信號(hào)，采集到的信號(hào)通過(guò)與參考電阻連接的差分放大器放大后，由信號(hào)采集系統(tǒng)進(jìn)行記錄并顯示相應(yīng)的檢測(cè)數(shù)據(jù)，即檢測(cè)樣品顆粒的個(gè)數(shù)。

檢測(cè)結(jié)果：通過(guò)計(jì)算機(jī)可以直接獲得實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果，樣品中顆粒的個(gè)數(shù)等于脈沖信號(hào)的個(gè)數(shù)。

采用本發(fā)明所述一種基于非均勻電場(chǎng)的阻抗脈沖顆粒計(jì)數(shù)裝置及其計(jì)數(shù)方法，檢測(cè)過(guò)程中，使用十二烷將顆粒溶液聚焦流經(jīng)主通道與檢測(cè)通道交界處，且所述待測(cè)顆粒從樣品通道進(jìn)入主通道，然后流經(jīng)主通道與樣品通道交界處。由于檢測(cè)通道與主通道交界區(qū)域的電場(chǎng)強(qiáng)度很大，且顆粒不進(jìn)入檢測(cè)通道，從而有效提高了檢測(cè)精度及抗通道阻塞能力。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。