本發(fā)明涉及一種含有痕量氯霉素的魚肉粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備方法，魚肉粉中氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一種計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，主要用于校準(zhǔn)計(jì)量器具和評(píng)價(jià)測(cè)量方法的準(zhǔn)確度。
背景技術(shù)：
：氯霉素(chloramphenicol，CAP)，學(xué)名D-蘇式-(-)-N-[α-(羥基甲基)-β-羥基-對(duì)硝基苯乙基]-2,2-二氯乙酰胺，分子式為C11H12Cl2N2O5，白色針狀或微帶黃綠色的針狀、長(zhǎng)片狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，熔點(diǎn)149-153℃，比旋光度19.5℃，水溶性為2.5g/L。易溶于水和甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇等。CAS號(hào)為56-75-7，分子量323.1294。化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。氯霉素是一種高效廣譜抗生素，在動(dòng)物傳染性疾病防治方面得到了廣泛應(yīng)用。但是食用動(dòng)物中殘留的氯霉素可通過食物鏈在人體中富集，對(duì)健康構(gòu)成潛在危害。歐盟、美國(guó)已將氯霉素列為法定禁用獸藥，歐盟確定最低限量為0.3μg/kg，我國(guó)也規(guī)定動(dòng)物性食品中氯霉素“不得檢出”。氣相色譜-質(zhì)譜法或液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)是目前氯霉素檢測(cè)的最主要確證方法。但由于質(zhì)譜檢測(cè)的特點(diǎn)要求樣品的前處理及凈化過程復(fù)雜，主要包括氯霉素提取、蛋白質(zhì)去除、雜質(zhì)凈化、濃縮、過濾等過程使得分析成本高、通量低，更為重要的是，繁瑣復(fù)雜的前處理過程、條件控制、基體效應(yīng)等影響了檢測(cè)結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確度，文獻(xiàn)報(bào)道的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用或者氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法的結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)一般在20％～35％之間，直接影響了在限量值附近結(jié)果的判定。為保證水產(chǎn)品中痕量氯霉素殘留檢測(cè)結(jié)果具有溯源性、可比性和準(zhǔn)確性，亟需開展具有準(zhǔn)確賦值，均勻、穩(wěn)定的魚肉中氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的成功研制能夠保證魚肉中氯霉素測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，進(jìn)而對(duì)保障食品安全有著極其重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種含有氯霉素的魚肉粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備方法。本發(fā)明的目的是提供一種含有痕量氯霉素的魚肉粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具有良好的均勻性和穩(wěn)定性。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用有利于提高魚肉中氯霉素痕量殘留檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與樣品的基體匹配程度，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本發(fā)明還提供一種含有氯霉素的魚肉粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，包括：樣品預(yù)處理：將魚肉剔除魚刺與魚皮、筋膜，切塊，絞碎，作為原料；取原料適量，按照1:3的比例，加水稀釋成肉漿，采用5000rpm，低溫高速均質(zhì)3min，重復(fù)勻漿10次，每次間隔30min；勻漿液裝入冷凍盤；所述冷凍盤中樣品厚度不能超過2cm。預(yù)凍樣品：所述樣品共晶點(diǎn)為-15℃，設(shè)置預(yù)凍溫度設(shè)為-20℃；預(yù)凍速率為10℃/min；快速預(yù)凍2小時(shí)；第一階段升華干燥：將所述冷凍盤裝入干箱，當(dāng)干箱壓力較常時(shí)間保持不變后，以5℃/次的速率逐步提高擱板溫度，直至-5℃；當(dāng)樣品溫度升至接近于擱板溫度或者干箱真空度與冷阱真空度接近并保持恒定時(shí)，繼續(xù)干燥1小時(shí)；第二階段升華干燥：一次調(diào)整擱板溫度至樣品允許的最高溫度0-4℃以下；自動(dòng)調(diào)節(jié)滲氣，時(shí)間為2小時(shí)之上；樣品達(dá)到最高允許溫度后，恢復(fù)干箱內(nèi)真空度，恒溫4小時(shí)；研磨制粉：將凍干樣品在研磨機(jī)中研碎，研磨速率為3000rpm，研磨1min；篩分：采用35目篩，超聲脈沖篩分樣品；混勻：樣品置于10L混勻桶中，連續(xù)混勻6小時(shí)；得到魚肉粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。分裝：樣品包裝在15mL透明樣品瓶中，每瓶約2.5g；輻照：采用放射性同位素鈷-60產(chǎn)生的γ射線，對(duì)凍干粉進(jìn)行輻照殺菌，輻照劑量為4kGy。本發(fā)明與其他技術(shù)相比，其優(yōu)勢(shì)在于：1)將樣品預(yù)處理后與水以適當(dāng)比例混合后勻漿，采用冷凍干燥方法獲得凍干魚肉，經(jīng)過研磨、篩分、混勻、輻照等步驟，制備獲得具有良好均勻性的凍干魚粉。2)通過模擬飼喂，獲得氯霉素污染的魚肉原料，該原料能夠完全模擬實(shí)際檢測(cè)中的氯霉素污染魚肉樣品；3)采用該技術(shù)制備魚粉中氯霉素的含量水平(0.6μg/kg)與歐盟最低殘留限量水平(0.3μg/kg)在一個(gè)數(shù)量級(jí)，滿足痕量殘留檢測(cè)的需要。本發(fā)明提供的方法制備的含有氯霉素的凍干魚粉，均勻性和穩(wěn)定性良好，可用于水產(chǎn)品中氯霉素痕量殘留檢測(cè)中分析方法的評(píng)價(jià)、分析過程的質(zhì)量控制及實(shí)驗(yàn)室能力考核。作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也可并用于校準(zhǔn)計(jì)量器具和評(píng)價(jià)測(cè)量方法，操作簡(jiǎn)單，易于推廣。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的說明書中闡述，并且，部分地從說明書中變得顯而易見，或者通過實(shí)施本發(fā)明而了解。本發(fā)明的目的和其他優(yōu)點(diǎn)可通過在所寫的說明書、說明書附圖、權(quán)利要求書中所特別指出的結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)和獲得。下面結(jié)合附圖，通過實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。附圖說明附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：圖1為氯霉素分子結(jié)構(gòu)圖；圖2為魚粉樣品的氯霉素LC-MSMS的MRM檢測(cè)譜圖。具體實(shí)施方式以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本實(shí)施例中，首先需要獲取原材料，也就是含有氯霉素的魚肉樣品。采用飼喂的方式得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物。購(gòu)買羅非魚，保證飼喂所用的水以及魚缸均不含有氯霉素，空白飼養(yǎng)兩周后，初步檢測(cè)，確定魚肉為空白樣品。按照一定劑量在水體里加入氯霉素，每周更換水體后重復(fù)添加氯霉素，連續(xù)飼養(yǎng)6周。1、魚肉樣品預(yù)處理：(1)取陽(yáng)性羅非魚，剔除魚刺與魚皮、筋膜等，切塊，絞碎，作為原料。(2)取原料適量，按照1:3的比例，加水稀釋成肉漿，采用5000rpm，低溫高速均質(zhì)3min，重復(fù)勻漿10次(每次間隔30min)。(3)勻漿液裝入冷凍盤(30cm*30cm*5cm)，盤中樣品厚度不能超過2cm。2、魚肉凍干粉制備：(1)預(yù)凍樣品：樣品共晶點(diǎn)為-15℃，設(shè)置預(yù)凍溫度設(shè)為-20℃；預(yù)凍速率為10℃/min(每分鐘降溫11℃)；快速預(yù)凍2小時(shí)，使樣品完全凍牢。(2)第一階段升華干燥：預(yù)凍結(jié)束后，開始第一階段升華。當(dāng)干箱壓力較常時(shí)間保持不變后，以5℃/次的速率逐步提高擱板溫度，直至-5℃，防止樣品出現(xiàn)過冷，為升華提供能量，加快升華速度。當(dāng)樣品溫度升至接近于擱板溫度或者干箱真空度與冷阱真空度接近并保持恒定時(shí)，繼續(xù)干燥1小時(shí)，以徹底消除樣品中的殘留冰晶及樣品干燥的不均衡性，第一階段升華結(jié)束。(3)第二階段升華干燥該階段樣品中已不存在凍結(jié)冰，一次調(diào)整擱板溫度至樣品允許的最高溫度0-4℃以下。為避免干箱內(nèi)壓力過低影響傳熱，進(jìn)行自動(dòng)調(diào)節(jié)滲氣，以使樣品溫度盡快達(dá)到最高溫度，提高升華速率。時(shí)間為2小時(shí)之上。樣品達(dá)到最高允許溫度后，恢復(fù)干箱內(nèi)真空度，恒溫4小時(shí)，第二階段升華干燥結(jié)束。(4)關(guān)機(jī)，取出凍干樣品。稱重，凍干粉得率為23％。3、研磨制粉：凍干樣品在研磨機(jī)中研碎，研磨速率為3000rpm，研磨1-2min。4、篩分：采用35目篩，超聲脈沖篩分樣品。5、混勻：樣品置于10L混勻桶中(不超過桶體積的1/2)，連續(xù)混勻6小時(shí)。6、分裝：樣品包裝在15mL透明樣品瓶中，每瓶約2.5g。7、輻照：采用放射性同位素鈷-60產(chǎn)生的γ射線，對(duì)凍干粉進(jìn)行輻照殺菌，輻照劑量為4kGy。對(duì)上述方法制得的痕量氯霉素的凍干魚粉樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)。(一)均勻性檢驗(yàn)均勻性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基本屬性，用于描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性的空間分布特征。在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制(生產(chǎn))過程中必須進(jìn)行均勻性評(píng)估，以證明其具有良好的均勻性。均勻性的檢測(cè)方法：前處理：稱取魚肉2g。加入10mL0.1mol醋酸鈉緩沖溶液(pH＝5)，渦旋2min，再加入20mL乙酸乙酯，渦旋1min，振蕩提取15min，5000r/min冷凍離心(4℃)5min，收集15mL乙酸乙酯提取液至15mL離心管中。直接過OasisPRIMEHLB柱，收集洗脫液后，在45℃水浴下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?ml15％甲醇水混勻，過0.22μmGHP濾膜，供LC/MS/MS測(cè)定。儀器分析：AB-QTRAP5500；色譜柱：ACQUITYCSHTMC18，1.7μm，3.0×100mm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：A相：水+0.1％乙酸；B相：甲醇；流速為0.3ml/min。其它流動(dòng)相條件見表1。表1其它流動(dòng)相條件Time(Time)0.01133.0155.018PumpB157070909015Stop質(zhì)譜條件：負(fù)離子掃描方式；多反映監(jiān)測(cè)(MRM)；電噴霧電壓(IS)：-4500V；氣簾氣壓力(CUR)：15psi；霧化氣壓力(GS1)：55psi；輔助氣壓力(GS2)：50psi；離子源溫度：550℃；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓(DP)、碰撞室入口電壓(EP)、碰撞室出口電壓(CXP)以及碰撞氣能量(CE)的條件見表2。表2氯霉素定量定性離子對(duì)及質(zhì)譜相關(guān)工作參數(shù)從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的300個(gè)包裝中隨機(jī)抽取15個(gè)包裝，每個(gè)包裝取3個(gè)子樣進(jìn)行瓶間和瓶?jī)?nèi)均勻性檢驗(yàn)。最小取樣量為0.5g，按照如下所述的液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法(LC-IDMS/MS)進(jìn)行測(cè)試。將均勻性方差分析結(jié)果sbb與所用方法的重復(fù)性sr或該特性量值不確定度的預(yù)期目標(biāo)進(jìn)行比較，若不顯著，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)視為均勻。應(yīng)計(jì)算待測(cè)特性量值的不均勻性引入的不確定度分量ubb，并將其計(jì)入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總的不確定度中。按照上述方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了均勻性檢驗(yàn)，均勻性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。表3均勻性檢驗(yàn)結(jié)果瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差的估計(jì)值用下式計(jì)算：重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差sr可以用s22計(jì)算：結(jié)果發(fā)現(xiàn)sbb>sr，故瓶間均勻性標(biāo)準(zhǔn)偏差sbb＝ubb＝0.0164μg/kg。本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性引入的不確定度為0.0164μg/kg(二)穩(wěn)定性檢測(cè)穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基本屬性，用于描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值隨時(shí)間變化的性質(zhì)，即描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性的時(shí)間分布特征。在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制過程中必須進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估。穩(wěn)定性評(píng)估不但能評(píng)估與材料穩(wěn)定性相關(guān)的測(cè)量不確定度，而且能明確合適的保存和運(yùn)輸條件。對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采取同步穩(wěn)定性評(píng)估的方法，按先密后疏的原則，考察在規(guī)定保存條件(0-4℃)下，保存0、1、2、3、6個(gè)月后樣品的穩(wěn)定性。按照如前所述的液質(zhì)聯(lián)用方法進(jìn)行測(cè)試，每次取5個(gè)包裝，每個(gè)包裝取一個(gè)子樣，測(cè)3次，計(jì)算平均值，把5個(gè)包裝的測(cè)量結(jié)果平均值作為檢測(cè)結(jié)果。采用趨勢(shì)分析法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，并評(píng)價(jià)穩(wěn)定性引入的不確定度，以結(jié)果的變動(dòng)在定值結(jié)果不確定度范圍內(nèi)作為判定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定的原則。由于沒有物理或化學(xué)模型能夠真實(shí)地描述魚粉中氯霉素的降解機(jī)理，故可選用線性模型作為該候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀７€(wěn)定性性評(píng)價(jià)結(jié)果見表4，由表可知穩(wěn)定性引入的不確定為0.0114ug/kg。表4魚粉中氯霉素的長(zhǎng)期穩(wěn)定性及趨勢(shì)分析(t＝6個(gè)月)(三)定值魚粉中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用液相色譜同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法定值，系統(tǒng)研究了方法、樣品前處理、檢測(cè)條件等，并采用多家實(shí)驗(yàn)室合作定值。對(duì)于制備的魚粉中氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法多家實(shí)驗(yàn)室合作定值。參照ISO導(dǎo)則34：2000《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者能力的通用要求》對(duì)合作者的管理能力、技術(shù)能力及硬件設(shè)施等方面對(duì)參加合作定值的實(shí)驗(yàn)室提出明確要求。選擇8家符合要求的合作實(shí)驗(yàn)室。合作定值要求每個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)每一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)試8組數(shù)據(jù)，對(duì)于所有測(cè)試數(shù)據(jù)分別進(jìn)行等精度測(cè)量判別和界外值剔除。經(jīng)夏皮羅-威爾克法檢驗(yàn)測(cè)定數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。定值結(jié)果如表5所示。表5定值結(jié)果定值結(jié)果：魚粉中氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值為0.601μg/kg，不確定度為0.043μg/kg。如圖2所示，為魚粉樣品的氯霉素LC-MS/MS的MRM檢測(cè)譜圖。綜上所述，本方法制備的含有氯霉素的凍干魚粉，均勻性和穩(wěn)定性良好，可用于水產(chǎn)品中氯霉素痕量殘留檢測(cè)中分析方法的評(píng)價(jià)、分析過程的質(zhì)量控制及實(shí)驗(yàn)室能力考核。作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也可并用于校準(zhǔn)計(jì)量器具和評(píng)價(jià)測(cè)量方法，操作簡(jiǎn)單，易于推廣。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3