本發(fā)明屬于醫(yī)用檢測工具，涉及狼瘡腎炎活躍度的檢測工具，特別涉及一種以ncam-1為檢測指標的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒及其應用。
背景技術：
狼瘡腎炎是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見的并發(fā)癥之一，且狼瘡腎炎所導致的終末期腎病是導致系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人死亡的主要因素。而從狼瘡腎炎發(fā)展為終末期腎病最主要的原因就是因為活躍期的狼瘡腎炎沒有被及時發(fā)現(xiàn)，導致了治療不及時，腎臟引發(fā)不可逆的腎小球硬化以及間質血管纖維化。對于狼瘡腎炎活躍度的判斷，“金標準”是通過腎臟穿刺活檢術對腎臟組織進行病理學檢查，根據(jù)病理學檢查結果進行診斷。而腎臟穿刺活檢術為有創(chuàng)性檢查，禁忌癥較多，無法多次常規(guī)進行，因此目前臨床上缺乏無創(chuàng)、準確、快捷、安全的檢測方法和工具。
雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法的原理是將特異性抗體結合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢血清中的相應抗原結合形成免疫復合物，洗滌后再加酶標記抗體，與免疫復合物中抗原結合形成酶標抗體-抗原-固相抗體復合物，加底物顯色，判斷抗原含量。
ncam-1（neuralcelladhesionmolecule-1，中文名：神經(jīng)細胞粘附分子-1）是一種非鈣依賴性粘附因子，在細胞信號識別及傳導、神經(jīng)再生等方面都具有一定的作用。
技術實現(xiàn)要素：
發(fā)明人在長期的研究中發(fā)現(xiàn)，ncam-1在活躍期狼瘡腎炎患者尿液中的濃度明顯的高于非活躍期狼瘡腎炎患者及未合并狼瘡腎炎的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者尿液中的濃度，因此，基于這一研究結果，ncam-1可作為狼瘡腎炎患者腎炎活躍度的診斷指標應用于檢測試劑盒中。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術通過穿刺活檢術檢測狼瘡腎炎活躍度的不足，提供一種的新的可用于檢測狼瘡腎炎活躍度的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，該試劑盒通過檢測尿液樣本中ncam-1為檢測指標，從而判斷狼瘡腎炎活躍度，實現(xiàn)快速、無創(chuàng)檢測。
為解決上述技術問題，本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)：
本發(fā)明首次將ncam-1作為檢測指標，特定的應用到雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒中，得到雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒通過檢測尿液樣本中的ncam-1作為判斷狼瘡腎炎活躍度的依據(jù)。
上述所述的檢測狼瘡腎炎活躍度的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括包被有ncam-1單克隆抗體的多孔板、生物素標記的ncam-1多克隆抗體檢測液、與生物素標記的ncam-1多克隆抗體結合的親和素-辣根過氧化物酶、顯色底物3′，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺、終止液硫酸和ncam-1重組蛋白。
優(yōu)選，所述包被有ncam-1單克隆抗體的多孔板，其每孔包被ncam-1單克隆抗體0.1～0.2μg。
進一步的，所述生物素標記的ncam-1多克隆抗體檢測液包括生物素標記的ncam-1多克隆抗體、牛血清白蛋白和磷酸鹽緩沖液；檢測液中，所述生物素標記的ncam-1多克隆抗體的最終濃度為0.1～0.2μg/ml，牛血清白蛋白的最終濃度為1g/100ml。
進一步的，所述生物素標記的ncam-1多克隆抗體由生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯和ncam-1多克隆抗體耦聯(lián)而成，所述生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯與ncam-1多克隆抗體的分子比率為4∶1。
進一步的，所述包被有ncam-1單克隆抗體的多孔板按下述方法制備：先用牛血清白蛋白濃度為1g/100ml的磷酸鹽緩沖液將ncam-1單克隆抗體稀釋為濃度1μg/ml的工作液，然后將所述ncam-1單克隆抗體工作液按100～200μl/孔的量加入多孔板的各孔內，在20℃～25℃包被12～16小時；包被完成后，將含牛血清白蛋白1g/100ml的磷酸鹽緩沖液加入多孔板上的各孔，加入量為200μl/孔，并在20℃～25℃進行封閉反應，反應時間為1～4小時；封閉反應結束后，用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌多孔板除去多孔板上的未反應物，即獲得包被有ncam-1單克隆抗體的多孔板，于4℃保存。
本發(fā)明進一步提供了所述生物素標記的ncam-1多克隆抗體檢測液的制備方法，所述方法包括下述步驟：
（1）以二甲基亞砜為溶劑，生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯為溶質配制濃度為1μg/μl的生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯溶液；以碳酸鹽緩沖液為溶劑，ncam-1多克隆抗體為溶質配制濃度為1mg/ml的ncam-1多克隆抗體溶液，
（2）將步驟（1）制備得到的生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯溶液和ncam-1多克隆抗體溶液混合，并將得到的混合液在攪拌下于室溫反應2～4小時，即獲得生物素標記的ncam-1多克隆抗體；
（3）將步驟（2）得到的含生物素標記的ncam-1多克隆抗體溶液裝入透析袋中，用磷酸鹽緩沖液在4℃進行透析，透析時間為12～16小時；
（4）將步驟（3）透析得到的液體加入到1ml的分子篩柱中，以3ml磷酸鹽緩沖液緩慢洗脫，收集到的洗脫液中加入適量牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的終濃度為1g/100ml，然后加入牛血清蛋白和洗脫液總體積的50%甘油，即形成生物素標記的ncam-1多克隆抗體檢測液，置-20℃保存。
本發(fā)明具有以下有益效果：
1、本發(fā)明為狼瘡腎炎患者檢測腎炎活躍度提供了一種采用新檢測指標的新型檢測工具。
2、使用本發(fā)明的檢測試劑盒，操作簡單，檢測一個樣品僅需3～6分鐘，與臨床上現(xiàn)有檢測方法相比，檢測效率大幅度提高。由于檢測樣品為患者的尿液樣本，因而是一種無創(chuàng)檢測。
3、本發(fā)明所述檢測工具結構簡單，易于加工制作，生產(chǎn)成本低，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
附圖說明
圖1為實施例3的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒的標準曲線。
具體實施方式
下面結合具體實施方式詳細說明本發(fā)明。
下述實施例中：
鼠抗人ncam-1單克隆抗體、羊抗人ncam-1多克隆抗體和ncam-1重組蛋白購自美國bio-techne公司。
甘油、二甲基亞砜，生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯、牛血清白蛋白分別購自sigma-aldrich公司和索萊寶公司。
磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液可自制，制備方法如下：
1.磷酸鹽緩沖液：稱取8g氯化鈉、0.2g氯化鉀、1.44g磷酸氫二鈉和0.24g磷酸二氫鉀溶于900ml雙蒸水中，用鹽酸調節(jié)溶液ph值至7.2，最后加入雙蒸水定容至1l，溶液通過0.45μm濾膜過濾后保存于4℃冰箱中。
2.碳酸鹽緩沖液：稱取63.6g碳酸鈉和33.6g碳酸氫鈉溶于1l雙蒸水中，用鹽酸調節(jié)溶液ph值為8.0的碳酸鹽緩沖液，溶液通過0.45μm濾膜過濾后保存于4℃冰箱中。
實施例1
檢測狼瘡腎炎活躍度的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，所述試劑盒包括包被有ncam-1單克隆抗體的多孔板、生物素標記的ncam-1多克隆抗體檢測液、與生物素標記的ncam-1多克隆抗體結合的親和素-辣根過氧化物酶、顯色底物3′，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺、終止液硫酸和ncam-1重組蛋白。
本實施例中，所述包被有ncam-1單克隆抗體的多孔板，其每孔包被ncam-1單克隆抗體0.1μg。
本實施例中，所述生物素標記的ncam-1多克隆抗體檢測液包括生物素標記的ncam-1多克隆抗體、牛血清白蛋白和磷酸鹽緩沖液，在得到的檢測液中，生物素標記的ncam-1多克隆抗體和牛血清白蛋白的濃度分別0.1μg/ml和1g/100ml。
本實施例中，所述生物素標記的ncam-1多克隆抗體由生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯和ncam-1多克隆抗體耦聯(lián)而成，所述生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯與ncam-1多克隆抗體的分子比率為4∶1。
實施例2
本實施例與實施例1的區(qū)別：
本實施例中，所述包被有ncam-1單克隆抗體的多孔板，其每孔包被ncam-1單克隆抗體0.2μg。在得到的檢測液中，生物素標記的ncam-1多克隆抗體的濃度分別0.2μg/ml。
實施例3
本實施例在實施例1的基礎上，進一步提供實施例1中的包被有ncam-1單克隆抗體的多孔板的制備方法和生物素標記的ncam-1多克隆抗體檢測液的制備方法；
其中，包被有ncam-1單克隆抗體的多孔板的制備方法：先用含牛血清白蛋白1g/100ml的磷酸鹽緩沖液將ncam-1單克隆抗體稀釋為濃度1μg/ml的工作液，然后將所述ncam-1單克隆抗體工作液按100μl/孔的量加入多孔板的各孔內，在20℃包被12小時；包被完成后，將含牛血清白蛋白1g/100ml的磷酸鹽緩沖液加入多孔板上的各孔，加入量為200μl/孔，并在20℃進行封閉反應，反應時間為1小時；封閉反應結束后，用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌多孔板除去多孔板上的未反應物，即獲得包被有ncam-1單克隆抗體的多孔板，于4℃保存。
生物素標記的ncam-1多克隆抗體檢測液的制備方法：
（1）以二甲基亞砜為溶劑，生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯為溶質配制濃度為1μg/μl的生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯溶液；以碳酸鹽緩沖液為溶劑，ncam-1多克隆抗體為溶質配制濃度為1mg/ml的ncam-1多克隆抗體溶液，
（2）將步驟（1）制備得到的生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯溶液和ncam-1多克隆抗體溶液混合，并將得到的混合液在攪拌下于室溫反應2小時，即獲得生物素標記的ncam-1多克隆抗體；
（3）將步驟（2）得到的含生物素標記的ncam-1多克隆抗體溶液裝入透析袋中，用磷酸鹽緩沖液在4℃進行透析，透析時間為12小時；
（4）將步驟（3）透析得到的液體加入到體積為1ml分子篩柱中，以3ml磷酸鹽緩沖液緩慢洗脫，收集到的洗脫液中加入適量牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白的終濃度為1g/100ml，然后加入牛血清蛋白和洗脫液總體積的50%甘油，即形成生物素標記的ncam-1多克隆抗體檢測液，置-20℃保存。
實施例4
本實施例在實施例2的基礎上，進一步提供實施例2中的包被有ncam-1單克隆抗體的多孔板的制備方法和生物素標記的ncam-1多克隆抗體檢測液的制備方法；
在多孔板的制備中，其方法與實施例3的區(qū)別在于：所述ncam-1單克隆抗體工作液按200μl/孔的量加入多孔板的各孔內，在25℃包被16小時；包被完成后，加入含牛血清白蛋白1g/100ml的磷酸鹽緩沖液后在25℃進行封閉反應，反應時間為4小時；
在生物素標記的ncam-1多克隆抗體檢測液制備中，其制備方法與實施例3的區(qū)別在于：
步驟（2）中，混合液在攪拌下于室溫反應時間為4小時；
步驟（3）中，透析時間為16小時。
上述實施例1-4中，ncam-1單克隆抗體選用鼠抗人ncam-1單克隆抗體，ncam-1多克隆抗體選用羊抗人ncam-1多克隆抗體。
本發(fā)明的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒的使用與現(xiàn)有技術使用方法一致。使用本發(fā)明實施例1-4中得到的試劑盒對臨床確診狼瘡腎炎活躍期和臨床確診狼瘡腎炎非活躍期患者進行采樣檢測，加入終止液變黃色為陽性（狼瘡腎炎活躍期），并將檢測結果統(tǒng)計在下表1中，檢測結果表明：該檢測工具的靈敏性可達81%左右，特異性可達80%左右。
表1
本發(fā)明將實施例3的試劑盒繪制標準曲線，其標準曲線如圖1所示，由標準曲線可知本發(fā)明試劑盒工作正常，結果較為可靠。