本發(fā)明屬于熒光傳感器制備技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種半胱氨酸測(cè)定比率熒光傳感器、制備方法和應(yīng)用，尤其是，利用超分子自組裝方法得到有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合型半胱氨酸比率熒光傳感器。

背景技術(shù)：

在生物化學(xué)領(lǐng)域，半胱氨酸是一種組成人體蛋白質(zhì)中唯一含有巰基的常見(jiàn)非必需氨基酸。人體中半胱氨酸含量的變化往往會(huì)引起一些疾病的發(fā)生。例如半胱氨酸濃度超過(guò)正常水平時(shí)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和腦梗死。半胱氨酸還參與生物體內(nèi)新陳代謝、蛋白質(zhì)合成以及解毒、防御等生命活動(dòng)。因此，高效快捷的檢測(cè)半胱氨酸已成為生物化學(xué)領(lǐng)域研究的熱門(mén)課題之一，目前已發(fā)展出紫外可見(jiàn)分光光度法和高效液相色譜法等測(cè)定方法檢測(cè)半胱氨酸。然而紫外可見(jiàn)分光光度法專屬性較差，線性范圍非常窄且檢測(cè)限只能達(dá)到微摩爾級(jí)；高效液相色譜法雖然靈敏度較高，但是實(shí)驗(yàn)成本較高，操作復(fù)雜。根據(jù)醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展需要，發(fā)展更為快速、高效、操作便捷的檢測(cè)氨基酸濃度的方法是近年來(lái)醫(yī)療、分析領(lǐng)域研究的方向。

熒光傳感器因其靈敏度高、可采集信號(hào)豐富及使用方便等優(yōu)點(diǎn)而倍受關(guān)注，近年來(lái)得到了迅速的發(fā)展。熒光傳感器主要分為兩類：一類是在溶液中使用的均相熒光傳感器，另一類是薄膜熒光傳感器。薄膜熒光傳感器具有可重復(fù)性，保持待測(cè)體系組分、無(wú)試劑消耗、易于器件化等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。薄膜熒光傳感器的研究成為當(dāng)今單分子層化學(xué)研究中最活躍的一個(gè)分支，成為近年來(lái)的研究焦點(diǎn)。

當(dāng)熒光探針實(shí)際應(yīng)用于環(huán)境、生物體系中檢測(cè)被分析物時(shí)，常常面臨的主要問(wèn)題之一就是熒光測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性問(wèn)題，因?yàn)闊晒馓结樤跈z測(cè)被分析物時(shí)，熒光強(qiáng)度的大小常常受到一系列因素的影響，如探針濃度、激發(fā)光強(qiáng)度、檢測(cè)效率、光漂白、探針滲漏、細(xì)胞厚度等等。因此，在單一波長(zhǎng)處測(cè)量熒光強(qiáng)度時(shí)，在實(shí)際應(yīng)用中常常會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)數(shù)據(jù)失真，從而對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生誤差。為了解決這種單一波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度變化為基礎(chǔ)的熒光測(cè)量方法所面臨的熒光信號(hào)人工假象問(wèn)題，通常使用熒光比率探針。

雙金屬?gòu)?fù)合氫氧化物又稱為水滑石(layereddoublehydroxides,簡(jiǎn)寫(xiě)為ldhs)是一種新型的多功能層狀材料，其化學(xué)穩(wěn)定性良好，具有強(qiáng)的抗熱性能，在藥物的緩釋方面也有廣泛的應(yīng)用，且ldhs層板帶有正電荷，常作為超分子組裝的材料，利用此種性能可以分別將帶負(fù)電荷的鈣黃綠素分子和核快紅分子與水滑石層板通過(guò)靜電引力進(jìn)行超分子交替自組裝，形成超分子結(jié)構(gòu)體系，由此開(kāi)發(fā)水滑石在熒光傳感器方面的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用超分子自組裝的方法制備得到的半胱氨酸測(cè)定比率熒光傳感器、制備方法和應(yīng)用，所述半胱氨酸測(cè)定比率熒光傳感器對(duì)半胱氨酸濃度具有很好的熒光響應(yīng)。

一種半胱氨酸測(cè)定比率熒光傳感器，通過(guò)以帶正電荷的水滑石剝層得到的層板為主體分子，以帶負(fù)電荷的鈣黃綠素和核快紅為客體分子，通過(guò)靜電引力層層自組裝形成超分子結(jié)構(gòu)體系后制備成膜得到。

進(jìn)一步的，所述主體分子的水滑石前體化學(xué)式為mg1-xalx(oh)2(no3)x·mh2o,其中0.2≤x≤0.33，m為結(jié)晶水?dāng)?shù)量，取值范圍為0.5-9。

一種半胱氨酸測(cè)定比率熒光傳感器的制備方法，包括以下步驟：

a.對(duì)水滑石前體進(jìn)行剝層處理，

b.對(duì)石英片預(yù)組裝處理，使石英基底上負(fù)載一層正電荷；

c.將預(yù)組裝處理后的石英片依次浸泡于鈣黃綠素水溶液、剝層處理得到的水滑石膠體溶液、核快紅水溶液、剝層處理得到的水滑石膠體溶液中，通過(guò)靜電引力進(jìn)行單層自組裝；

d.重復(fù)步驟c進(jìn)行多層自組裝。

進(jìn)一步的，所述步驟a中的所述水滑石前體采用水熱合成法制備，化學(xué)式為：mg1-xalx(oh)2(no3)x·mh2o,其中0.2≤x≤0.33，m為結(jié)晶水?dāng)?shù)量，取值范圍為0.5-9。

進(jìn)一步的，所述步驟a中的剝層處理為：氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將所述水滑石前體置于于甲酰胺溶劑中，攪拌反應(yīng)48h后離心，棄去沉淀物，得到剝層后的水滑石膠體溶液。

進(jìn)一步的，所述步驟b中的預(yù)組裝處理為：將石英片用體積比為7:3的濃h2so4和h2o2的混合溶液清洗，再用乙醇和去離子水交替超聲各兩次，每次15min。然后將其置于pdda溶液中浸泡30min，取出后用去離子水沖洗并在室溫下吹干。

進(jìn)一步的，所述步驟c中的鈣黃綠素水溶液和核快紅水溶液的濃度為10^-4mol/l，并用naoh調(diào)節(jié)ph值為7。

進(jìn)一步的，所述步驟c中的單層自組裝過(guò)程為：將預(yù)組裝處理后的石英片置于鈣黃綠素水溶液中浸泡10min，取出后用去離子水清洗并在室溫下吹干；然后置于剝層后的水滑石膠體溶液中浸泡10min，取出后去離子水清洗并在室溫下吹干；再置于核快紅水溶液中浸泡10min，取出后去離子水清洗并在室溫下吹干；然后再置于剝層后的水滑石膠體溶液中浸泡10min，取出后去離子水清洗并在室溫下吹干。

進(jìn)一步的，重復(fù)10次步驟c，交替組裝成20層復(fù)合薄膜。

上述半胱氨酸測(cè)定比率熒光傳感器的應(yīng)用，使用過(guò)的半胱氨酸測(cè)定比率熒光傳感器經(jīng)硫酸銅溶液浸泡后熒光會(huì)發(fā)生猝滅，可再次使用。

熒光傳感器性能測(cè)試：

a.取制備的半胱氨酸濃度比率熒光傳感器置于不同濃度硝酸銅溶液中，考察其兩個(gè)熒光響應(yīng)值變化；

b.取制備的半胱氨酸濃度熒光傳感器置于不同濃度半胱氨酸溶液中，考察其熒光響應(yīng)值變化。

我們對(duì)熒光傳感器的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了研究，銅離子是典型的熒光猝滅劑，當(dāng)加入銅離子時(shí)，銅離子可以分別與層間客體分子發(fā)生螯合作用，使熒光傳感器熒光猝滅；隨后加入半胱氨酸，銅離子與半胱氨酸配位進(jìn)而從復(fù)合薄膜中釋放出來(lái)，使熒光傳感器的熒光恢復(fù)，由于層間客體分子與銅離子結(jié)合方式和能力的不同，導(dǎo)致二者熒光強(qiáng)度的比值隨半胱氨酸加入量發(fā)生變化并在一定濃度范圍內(nèi)有很好線性關(guān)系。依次反復(fù)，就可以實(shí)現(xiàn)半胱氨酸濃度測(cè)定比率熒光傳感器的重復(fù)使用。

本發(fā)明的技術(shù)效果在于：

本發(fā)明的制備方法中，采用水熱合成法制備水滑石前體，并分別利用鈣黃綠素帶有的羧基和核快紅帶有的磺酸根與水滑石膠體溶液進(jìn)行層層交替自組裝，從而形成薄膜。本發(fā)明所制備的半胱氨酸濃度測(cè)定比率熒光傳感器，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，該傳感器檢測(cè)范圍寬，檢測(cè)限低，成本低廉，簡(jiǎn)捷實(shí)用，易實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)；運(yùn)用比率熒光方法，在兩個(gè)不同波長(zhǎng)測(cè)定的熒光強(qiáng)度比率校準(zhǔn)，可克服由于離子濃度的變化而造成的熒光信號(hào)人工假象，能夠有效消除測(cè)試中其他離子干擾；組成該傳感器的水滑石層板穩(wěn)定、無(wú)毒，生物相容性良好，與其它聚合物載體相比不易老化，保存時(shí)間長(zhǎng)；而且水滑石層板可以保持客體分子最大程度的分散，有效阻止因氫鍵伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的非輻射弛豫現(xiàn)象引起的熒光淬滅現(xiàn)象，從而保持客體分子的光學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性；檢測(cè)過(guò)程中該傳感器不污染待測(cè)體系，且無(wú)試劑損耗；而且可以實(shí)現(xiàn)傳感器的再生和重復(fù)使用。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中mgalco3-ldhs和mgalno3-ldhs前體的x射線粉末衍射圖；其中橫坐標(biāo)為2θ值，單位：度；縱坐標(biāo)為強(qiáng)度；a為mgalco3-ldhs，b為mgalno3-ldhs前體。

圖2為實(shí)施例1水滑石的sem圖。a為mgalco3-ldhs，b為mgalno3-ldhs前體。

圖3為實(shí)施例1中鈣黃綠素@核快紅ldhs復(fù)合薄膜紫外-可見(jiàn)光吸收?qǐng)D譜，其中橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，單位：nm；縱坐標(biāo)為吸收強(qiáng)度；里面的小圖為不同組裝層數(shù)的薄膜在265nm，502nm，552nm吸收強(qiáng)度值的線性圖。橫坐標(biāo)為復(fù)合薄膜的組裝層數(shù)，縱坐標(biāo)為吸收強(qiáng)度。

圖4為實(shí)施例1中鈣黃綠素@核快紅ldhs復(fù)合薄膜熒光圖譜，其中橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，單位：nm；縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度；里面的小圖為不同組裝層數(shù)的薄膜在520nm和607nm熒光強(qiáng)度值的線性圖。橫坐標(biāo)為復(fù)合薄膜的組裝層數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖5為制備的熒光傳感器對(duì)不同濃度的銅離子溶液的熒光響應(yīng)值；其中橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，單位：nm；縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度；從上至下硫酸銅的濃度依次為0、10、20、40、80、100、150、300、600、1200、2400、4800nm的溶液的熒光響應(yīng)圖。

圖6為制備的半胱氨酸熒光傳感器對(duì)不同濃度的半胱氨酸溶液的熒光響應(yīng)值；其中橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，單位：nm；縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度值；從下至上半胱氨酸的濃度依次為0、10、20、30、40、50、60、70、85、95、110、120*10^-8m的溶液的熒光響應(yīng)值圖。其中插圖為其線性關(guān)系圖，橫坐標(biāo)為半胱氨酸的濃度，單位：10^-8m；縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖7實(shí)施例1制備的半胱氨酸熒光傳感器對(duì)不同物質(zhì)溶液的熒光響應(yīng)相對(duì)變化值柱狀圖，左圖為初始熒光傳感器：橫坐標(biāo)依次為4800nm的銅離子、鈉離子、鈣離子、鐵離子、鎂離子、鋁離子、鉀離子、鋅離子、銀離子的溶液；右圖為加入銅離子后的熒光傳感器：橫坐標(biāo)依次為1.2*10^-6m半胱氨酸、β-環(huán)糊精、甘露醇、纖維素、聚乙二醇、尿素、葡萄糖、淀粉。兩圖縱坐標(biāo)為熒光比值相對(duì)變化值，即變化后比值與初始熒光比值的比值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.制備水滑石前體：將0.008molmg(no3)2·6h2o，0.04molal(no3)3·9h2o和0.048mol尿素溶于280ml的去離子水中，放于4個(gè)90ml的聚四氟乙烯襯底的壓力反應(yīng)容器中，于110℃條件下反應(yīng)24小時(shí)，用去離子水離心洗滌至ph值約為7，60℃條件下在空氣中干燥，得到碳酸根型陰離子插層的水滑石微晶。取上述碳酸根型陰離子水滑石0.3g與固體nano363.75g溶于300ml除co2的去離子水中均勻分散后，加入0.08ml濃硝酸酸化后在25℃，氮?dú)鈿夥諚l件下攪拌，進(jìn)行離子交換反應(yīng)。48小時(shí)后用除co2的的去離子熱水離心洗滌至ph約為7，60℃干燥12小時(shí)，得到鎂鋁硝酸根陰離子插層的水滑石。

2.取上述硝酸根插層水滑石0.3g，在氮?dú)鈿夥諚l件下，于300ml甲酰胺溶劑中攪拌48小時(shí)，攪拌速度為2000轉(zhuǎn)/分，將剝離后的水滑石溶液離心，棄去沉淀物，得到澄清透明膠體溶液。

3.分別配制濃度為10^-4mol/l的鈣黃綠素和濃度為10^-4mol/l的核快紅溶液，用naoh調(diào)節(jié)ph值為7后，避光保存在100ml容量瓶中；配制濃度為1g/ml的pdda溶液100ml；

4.取3cm×1cm大小的石英片，用體積比為7:3的濃h2so4和h2o2的混合溶液清洗，再用乙醇和去離子水交替超聲2次，每次15min，然后將其置于步驟3中配制的pdda溶液中浸泡30min，取出后用去離子水沖洗并在室溫下吹干。此過(guò)程為預(yù)組裝處理，使石英基底上負(fù)載一層正電荷；

5.將步驟4得到的石英片置于步驟3配制的鈣黃綠素水溶液中浸泡10min，取出后用去離子水清洗并在室溫下吹干；然后置于步驟2制備的水滑石膠體溶液中浸泡10min，取出后去離子水清洗并在室溫下吹干；再置于步驟3配制的核快紅水溶液中浸泡10min，取出后去離子水清洗并在室溫下吹干；然后置于步驟2制備的水滑石膠體溶液中浸泡10min，取出后去離子水清洗并在室溫下吹干。

6.重復(fù)步驟5，10次，得到組裝20層的復(fù)合薄膜，即為半胱氨酸濃度測(cè)定熒光傳感器。

由uv-vis、xrd、熒光譜圖可知，成功組裝成規(guī)則有序的復(fù)合薄膜。

熒光傳感器性能測(cè)試：

(1)對(duì)不同濃度硫酸銅溶液的熒光響應(yīng)值變化：

將所制得半胱氨酸濃度測(cè)定熒光傳感器置于比色皿中，檢測(cè)其初始熒光值；將石英片依次放置于配置好的濃度為10nm、20nm、40nm、80nm、100nm、150nm、300nm、600nm、1200nm、2400nm、4800nm硫酸銅溶液中5min，然后用洗耳球吹干后測(cè)試其熒光強(qiáng)度值，考察其熒光圖譜變化并記錄。由熒光圖譜可以看出，浸泡過(guò)硫酸銅溶液后，520nm和607nm處熒光發(fā)射峰均明顯減弱。

(2)對(duì)不同濃度的半胱氨酸的熒光值響應(yīng)值變化：

將經(jīng)硫酸銅猝滅后的半胱氨酸濃度測(cè)定熒光傳感器置于去離子水溶液5min，用洗耳球吹干后檢測(cè)其初始熒光值。將石英片依次放置于配置好的濃度為1*10^-8、20*10^-8、30*10^-8、40*10^-8、50*10^-8、60*10^-8、70*10^-8、85*10^-8、95*10^-8、110*10^-8、120*10^-8m半胱氨酸溶液中5min，然后用洗耳球吹干后測(cè)試其熒光強(qiáng)度值，考察其熒光圖譜變化并記錄。通過(guò)熒光圖譜的變化可以看出，該半胱氨酸濃度測(cè)定熒光傳感器對(duì)半胱氨酸具有較寬的檢測(cè)范圍，較高的靈敏度，并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出線性關(guān)系。

(3)傳感器的再生和重復(fù)使用：

經(jīng)半胱氨酸進(jìn)行熒光恢復(fù)的半胱氨酸濃度測(cè)定熒光傳感器，再次經(jīng)硫酸銅溶液浸泡后，熒光又會(huì)發(fā)生猝滅。然后再將其經(jīng)半胱氨酸溶液浸泡后，熒光又會(huì)再次恢復(fù)，從而，可以實(shí)驗(yàn)熒光傳感器的重復(fù)使用。

本發(fā)明通過(guò)層層自組裝方法得到了鈣黃綠素@核快紅/水滑石復(fù)合薄膜，并考察了該熒光傳感器對(duì)不同濃度的銅離子和半胱氨酸的熒光響應(yīng)。該熒光傳感器運(yùn)用比率熒光的方法，利用兩個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度比率校準(zhǔn)，提供一個(gè)不受環(huán)境干擾的背景信號(hào)，將熒光探針的高光學(xué)穩(wěn)定性和比率熒光探針的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，這將在檢測(cè)方面具有很好的發(fā)展前景。由于不受光源強(qiáng)度和儀器靈敏度的影響，將有效避免背景的干擾，比率熒光探針的靈敏度、選擇性大大提高；制備方法簡(jiǎn)捷實(shí)用，成本低廉，可重復(fù)使用；對(duì)半胱氨酸的檢測(cè)具有很好的選擇性并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出線性關(guān)系且具有靈敏度高、檢測(cè)限低、高效快捷等特點(diǎn)；薄膜還保持了水滑石無(wú)毒、穩(wěn)定、良好生物相溶性、不易老化的特點(diǎn)。

可以理解的是，以上實(shí)施方式僅僅是為了說(shuō)明本發(fā)明的原理而采用的示例性實(shí)施方式，然而本發(fā)明并不局限于此。對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明的精神和實(shí)質(zhì)的情況下，可以做出各種變型和改進(jìn)，這些變型和改進(jìn)也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。