本發(fā)明涉及人類精子檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種人類精子頂體反應(yīng)能力的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和醫(yī)療水平的提高，不孕不育的發(fā)病率反而呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，已成為當(dāng)今影響人類生活和健康的一類主要疾病，其中在我國(guó)，不孕不育癥在育齡期夫婦中發(fā)病率達(dá)10％以上，并有逐漸增多的趨勢(shì)。男性因素和女性因素各占30％，雙方共同因素占40％。男性因素中精子原因居首位。世界衛(wèi)生組織(WHO)在25個(gè)國(guó)家9000對(duì)不育夫婦的多中心研究中發(fā)現(xiàn)，50％的男性不育癥是特發(fā)性精子異常。精子授精能力與頂體有極為密切的關(guān)系。精卵結(jié)合的過程，是通過頂體破裂釋放頂體酶，使精子穿越卵丘透明帶而完成的。正常的精子頂體及頂體反應(yīng)是精卵結(jié)合的必要條件。在識(shí)別、結(jié)合卵子透明帶的過程中，頂體被誘導(dǎo)發(fā)生頂體反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)精子DNA與卵子DNA融合的重要功能，因此精子頂體完整性與發(fā)生頂體反應(yīng)是評(píng)估精子受精功能的重要指標(biāo)。因此，亟需一種人類精子頂體反應(yīng)能力檢測(cè)的方法來評(píng)估精子受精功能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡(jiǎn)單且方便快速、結(jié)果易于判定、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好的人類精子頂體反應(yīng)能力檢測(cè)的方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種人類精子頂體反應(yīng)能力檢測(cè)的方法，包括如下步驟：
(1)取500μL液化的精液，從含有37℃預(yù)熱的600μL上游液的樣本管底部緩緩加入，用上游法優(yōu)選精子15min；
(2)上游結(jié)束后吸取400μL優(yōu)化好的精子懸液，分成兩份于流式上樣管中，每管200μL，檢測(cè)管加入10μL頂體反應(yīng)誘導(dǎo)劑，對(duì)照管加入10μL頂體反應(yīng)誘導(dǎo)劑溶劑，37℃避光誘導(dǎo)15min；
(3)誘導(dǎo)頂體反應(yīng)結(jié)束后，7000r/min離心2min，去上清后，加入200μL預(yù)冷的70wt％乙醇水溶液振蕩混勻，室溫固定2min，再以7000r/min離心2min，去上清；
(4)兩管中各加500μL緩沖液，振蕩混勻重懸精子，再加入5μL的FITC-PSA染液，37℃避光染色15min；
(5)設(shè)定流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)，對(duì)照管、檢測(cè)管按順序上機(jī)，每管樣本至少連續(xù)測(cè)定兩次，每管樣本至少記錄樣本主群5000個(gè)細(xì)胞并使用AR計(jì)算軟件統(tǒng)計(jì)分析；
(6)依據(jù)軟件計(jì)算出的結(jié)果，頂體反應(yīng)發(fā)生率即為通過Ca2+載體誘導(dǎo)產(chǎn)生的發(fā)生頂體反應(yīng)的精子群百分比減去在自然狀態(tài)下自發(fā)進(jìn)行的頂體反應(yīng)精子群百分比(這些則是通過誘導(dǎo)之后能夠發(fā)生頂體反應(yīng)的精子群體，該群體直接影響的受精發(fā)生比率)，獲得的百分比差值大于15％即為正常人群數(shù)值，低于15％的則可能為異常人群；
(7)測(cè)定后，分別用漂白劑、進(jìn)樣管清潔劑和除菌的雙蒸水徹底清除殘留于流式細(xì)胞儀進(jìn)樣線中的細(xì)胞碎片和熒光染料。
步驟(1)中所述的上游液為氯化鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖、氯化鉀、酸鎂、氯化鈣、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二鈉鹽、碳酸氫鈉、丙酮酸鈉、牛血清白蛋白和乳酸鈉的混合物。
步驟(2)中所述的頂體反應(yīng)誘導(dǎo)劑為Ca2+載體A23187和二甲基亞砜的混合物，所述的頂體反應(yīng)誘導(dǎo)劑溶劑為二甲基亞砜。
步驟(4)中所述的緩沖液為氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀的混合物。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明一種人類精子頂體反應(yīng)能力檢測(cè)的方法，采用Ca2+載體誘導(dǎo)頂體反應(yīng)發(fā)生、異硫氰酸耦聯(lián)的豌豆凝集素(FITC-PSA)作為染料來檢測(cè)人類精子頂體反應(yīng)能力。人類精子頂體含有大量糖蛋白，能與FITC耦聯(lián)的豌豆凝集素(FITC-PSA)特異性結(jié)合。頂體功能異常未發(fā)生頂體反應(yīng)的精子具有完整的頂體，頂體內(nèi)容物能夠與FITC-PSA特異結(jié)合，精子頭部發(fā)高強(qiáng)度綠色熒光；頂體功能正常時(shí)發(fā)生頂體反應(yīng)，反應(yīng)后的精子頂體內(nèi)容物釋放，不結(jié)合或很少結(jié)合FITC-PSA，精子不發(fā)熒光或弱熒光，具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果易于判定、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好方便快速。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
具體實(shí)施例
一種人類精子頂體反應(yīng)能力檢測(cè)的方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)取500μL液化的精液，從含有37℃預(yù)熱的600μL上游液的樣本管底部緩緩加入，用上游法優(yōu)選精子15min；其中上游液為氯化鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖、氯化鉀、酸鎂、氯化鈣、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二鈉鹽、碳酸氫鈉、丙酮酸鈉、牛血清白蛋白和乳酸鈉的混合物。
(2)上游結(jié)束后吸取400μL優(yōu)化好的精子懸液，分成兩份于流式上樣管中，每管200μL，檢測(cè)管加入10μL頂體反應(yīng)誘導(dǎo)劑，對(duì)照管加入10μL頂體反應(yīng)誘導(dǎo)劑溶劑，37℃避光誘導(dǎo)15min；其中頂體反應(yīng)誘導(dǎo)劑為Ca2+載體A23187和二甲基亞砜的混合物，所述的頂體反應(yīng)誘導(dǎo)劑溶劑為二甲基亞砜；
(3)誘導(dǎo)頂體反應(yīng)結(jié)束后，7000r/min離心2min，去上清后，加入200μL預(yù)冷的70wt％乙醇水溶液振蕩混勻，室溫固定2min，再以7000r/min離心2min，去上清；
(4)兩管中各加500μL緩沖液，振蕩混勻重懸精子，再加入5μL的FITC-PSA染液，37℃避光染色15min；其中緩沖液為氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀的混合物；
(5)設(shè)定流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)，對(duì)照管、檢測(cè)管按順序上機(jī)，每管樣本至少連續(xù)測(cè)定兩次，每管樣本至少記錄樣本主群5000個(gè)細(xì)胞并使用AR計(jì)算軟件統(tǒng)計(jì)分析；
(6)依據(jù)軟件計(jì)算出的結(jié)果，頂體反應(yīng)發(fā)生率即為通過Ca2+載體誘導(dǎo)產(chǎn)生的發(fā)生頂體反應(yīng)的精子群百分比減去在自然狀態(tài)下自發(fā)進(jìn)行的頂體反應(yīng)精子群百分比(這些則是通過誘導(dǎo)之后能夠發(fā)生頂體反應(yīng)的精子群體，該群體直接影響的受精發(fā)生比率)，獲得的百分比差值大于15％即為正常人群數(shù)值，低于15％的則可能為異常人群；
(7)測(cè)定后，分別用漂白劑、進(jìn)樣管清潔劑和除菌的雙蒸水徹底清除殘留于流式細(xì)胞儀進(jìn)樣線中的細(xì)胞碎片和熒光染料。
上述漂白劑為50％的雙蒸水ddH2O和50％約含5％的次氯酸鈉的混合物，進(jìn)樣管清潔劑為50％的乙醇、50％的漂白劑和0.5MNaCl的混合物。
當(dāng)然，上述說明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。