本發(fā)明涉及體外診斷試劑領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于流式細胞術(shù)的精子dfi檢測方法。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)的精液檢測方法主要針對精子的dna碎片化，這些檢測結(jié)果不能全面、準確地反映精子狀況。精子的主要功能是保留并傳遞父輩的遺傳信息，而dna存在于精子體內(nèi)，被魚精蛋白包裹呈致密的結(jié)構(gòu)。dna是一種長鏈聚合物，組成單位為四種脫氧核苷酸，即：腺嘌呤脫氧核苷酸(damp)、胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dtmp)、胞嘧啶脫氧核苷酸(dcmp)、鳥嘌呤脫氧核苷酸(dgmp)。而脫氧核糖(五碳糖)與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長鏈骨架，排列在外側(cè)，四種堿基排列在內(nèi)側(cè)，遵循堿基互補配對原則。每個糖分子都與四種堿基里的其中一種相連，這些堿基沿著dna長鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，指導蛋白質(zhì)的合成。

dna存儲著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，因此維護dna分子的完整性對細胞至關(guān)緊要。外界環(huán)境和生物體內(nèi)部的因素都經(jīng)常會導致dna分子的損傷或改變，而且與rna及蛋白質(zhì)可以在細胞內(nèi)大量合成不同，一般在一個原核細胞中只有一份dna，在真核二倍體細胞中相同的dna也只有一對，如果dna的損傷或遺傳信息的改變不能更正，對體細胞就可能影響其功能或生存，對生殖細胞則可能影響到其后代。dna在正常狀態(tài)下形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，因此，正常狀態(tài)下，dna分子是完整的雙鏈結(jié)構(gòu)，而在體內(nèi)dna由于多種原因會導致dna損傷，而損傷的dna又對生物個體的繁衍產(chǎn)生重大影響；故對精子dna完整性檢測是意義非凡的。傳統(tǒng)的精子dfi檢測依賴于吖啶橙檢測法，并通過顯微鏡觀察精子樣本，通過識別熒光顏色以及計數(shù)來計算dfi值。本公司通過dfi試劑盒對精子樣本進行處理、染色，再通過流式細胞法對樣本進行自動化分析，該方法檢測結(jié)果過于依賴人為操作，檢測結(jié)果主觀性強；操作過程繁瑣，檢測效率低下，重復性差，敏感性較差特點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、結(jié)果易于判定、檢測結(jié)果準確、穩(wěn)定可靠、重復性好、且易于臨床推廣的基于流式細胞術(shù)的精子dfi檢測方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種基于流式細胞術(shù)的精子dfi檢測方法，包括以下步驟：

(1)將液化的精液用37℃緩沖液稀釋精子至1～2×10⁶個/ml；

(2)將500μl稀釋過的精子加入到流式細胞儀上樣管中，加入酸化處理緩沖液(主要成分為鹽酸，目的是使緊密的dna變得結(jié)構(gòu)較為松散，以便于后續(xù)染色步驟進行)，30秒后加入ao染色液；

(3)設(shè)定流式細胞儀的校準，將檢測管上機，每管樣本至少連續(xù)測定兩次，每管樣本至少記錄樣本主群5000個細胞并使用dfiview軟件統(tǒng)計分析；

(4)染色后的精子細胞懸液通過流式細胞儀收集精子的紅綠熒光信號(即fitc與percp熒光信號)，通過收集到的紅色熒光精子占收集精子總數(shù)的比例，判定樣本的dna碎片化程度；結(jié)果判斷依據(jù)于建立的圖像收集模板，主要是對熒光強度的要求(依據(jù)不同儀器的收集條件不同建立對應(yīng)的模板，具體包括，以calibur儀器為例，fitc熒光強度中位數(shù)處于收集范圍的中部為400～600，percp熒光強度中位數(shù)為50～100；

(5)測定后，分別用漂白劑、進樣管清潔劑和除菌的雙蒸水徹底清除殘留于流式細胞儀進樣線中的細胞碎片和熒光染料。

步驟(1)中所述的緩沖液為氯化鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖、氯化鉀、酸鎂、氯化鈣、n-2-羥乙基哌嗪-n-2-乙磺酸二鈉鹽、碳酸氫鈉、丙酮酸鈉、牛血清白蛋白和乳酸鈉的混合物。

所述的酸化處理緩沖液為0.08mol/l鹽酸。在酸化處理后利用吖啶橙染料與雙鏈dna結(jié)合發(fā)綠色或黃色熒光，與單鏈dna結(jié)合發(fā)紅色熒光的特性，確定精子dna碎片化程度。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明一種基于流式細胞術(shù)的精子dfi檢測方法，通過dfi試劑盒對精子樣本進行處理、染色，包括精子dna熒光染液和染色緩沖液。通過熒光標記、流式上機檢測精子dna碎片率，從而評估精子的dna損傷程度，為不育癥檢查、輔助生殖治療方案的選擇提供幫助。該方法避免了傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果過于依賴人為操作，檢測結(jié)果主觀性強；操作過程繁瑣，檢測效率低下，重復性差，敏感性較差特點，實現(xiàn)了精子dfi檢測的簡單、快速、準確、高通量檢測并計算dfi的目的。

附圖說明

圖1為精子細胞群圖形，圖中用門圈中區(qū)域即為精子細胞主群；

圖2為精子細胞群熒光表達圖，圖中分為三群細胞，靠近fitc(縱軸)的群即為dna完整性好的細胞群，靠近percp(橫軸)的細胞群即為dna完整性差的細胞群，位于倆群中間的細胞群是完整性較差的細胞群。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。

具體實施例

一種基于流式細胞術(shù)的精子dfi檢測方法，包括以下步驟：

(1)將液化的精液用37℃緩沖液稀釋精子至1～2×10⁶個/ml；其中緩沖液為氯化鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖、氯化鉀、酸鎂、氯化鈣、n-2-羥乙基哌嗪-n-2-乙磺酸二鈉鹽、碳酸氫鈉、丙酮酸鈉、牛血清白蛋白和乳酸鈉的混合物；

(2)將500μl稀釋過的精子加入到流式細胞儀上樣管中，加入酸化處理緩沖液(為0.08mol/l鹽酸，目的是使緊密的dna變得結(jié)構(gòu)較為松散，以便于后續(xù)染色步驟進行)，30秒后加入ao染色液；在酸化處理后利用吖啶橙染料與雙鏈dna結(jié)合發(fā)綠色或黃色熒光，與單鏈dna結(jié)合發(fā)紅色熒光的特性，確定精子dna碎片化程度；

(3)設(shè)定流式細胞儀的校準，將檢測管上機，每管樣本至少連續(xù)測定兩次，每管樣本至少記錄樣本主群5000個細胞并使用dfiview軟件統(tǒng)計分析；

(4)染色后的精子細胞懸液通過流式細胞儀收集精子的紅綠熒光信號(即fitc與percp熒光信號)，通過收集到的紅色熒光精子占收集精子總數(shù)的比例，判定樣本的dna碎片化程度；結(jié)果判斷依據(jù)于建立的圖像收集模板，主要是對熒光強度的要求(依據(jù)不同儀器的收集條件不同建立對應(yīng)的模板，具體包括，以calibur儀器為例，fitc熒光強度中位數(shù)處于收集范圍的中部為400～600，percp熒光強度中位數(shù)為50～100；如圖1所示，為精子細胞群圖形，圖中用門圈中區(qū)域即為精子細胞主群；圖2所示為精子細胞群熒光表達圖，圖中分為三群細胞，靠近fitc(縱軸)的群即為dna完整性好的細胞群，靠近percp(橫軸)的細胞群即為dna完整性差的細胞群，位于倆群中間的細胞群是完整性較差的細胞群；

(5)測定后，分別用漂白劑、進樣管清潔劑和除菌的雙蒸水徹底清除殘留于流式細胞儀進樣線中的細胞碎片和熒光染料。

當然，上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明保護范圍。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基于流式細胞術(shù)的精子DFI檢測方法，特點是包括以下步驟：(1)將液化的精液用37℃緩沖液稀釋精子至1～2×106個/mL；(2)將500μL稀釋過的精子加入到流式細胞儀上樣管中，加入酸化處理緩沖液，30秒后加入AO染色液；(3)設(shè)定流式細胞儀的校準，將檢測管上機，每管樣本至少連續(xù)測定兩次，每管樣本至少記錄5000個細胞并使用DFIView軟件統(tǒng)計分析；(4)如何進行結(jié)果判斷；(5)測定后，分別用漂白劑、進樣管清潔劑和除菌的雙蒸水徹底清除殘留于流式細胞儀進樣線中的細胞碎片和熒光染料，優(yōu)點是操作簡單、檢測結(jié)果準確、穩(wěn)定可靠、重復性好、且易于臨床推廣。

技術(shù)研發(fā)人員：曾橋;江南;房海燕;陳繼勇;胡潤環(huán)
受保護的技術(shù)使用者：浙江星博生物科技股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：2017.03.07
技術(shù)公布日：2017.07.07