本發(fā)明涉及一種檢測谷胱甘肽(GSH)的方法，具體涉及一種可在醫(yī)療、生命科學(xué)、食品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域應(yīng)用的用于檢測GSH的方法。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽(GSH)是一種由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸構(gòu)成的三肽化合物，來自于半胱氨酸殘基中的巰基使它成為具有重要意義的生物活性物質(zhì)。GSH廣泛存在于動、植物細胞，是細胞內(nèi)含量最豐富的非蛋白巰基物。GSH在人體各種組織及細胞中的含量以及與各種疾病的關(guān)系備受關(guān)注，至今一直是廣泛研究的熱點。GSH參與生物體內(nèi)多種生化反應(yīng)，具有非常重要的生理作用，如氨基酸的轉(zhuǎn)運，蛋白、核酸的合成，抗氧化作用等等。作為機體中廣泛存在的重要抗氧化劑，GSH在防衛(wèi)機體免受自由基傷害、抗腫瘤及抗衰老等方面發(fā)揮了重要作用。特別是GSH所具有的抗突變作用，有利于抑制誘發(fā)癌癥基因的突變，對肝癌、肺癌、皮膚癌、前列腺癌等多種癌細胞病變有一定的抑制作用，據(jù)稱，GSH是人體內(nèi)最有效的抗癌物。
生物體內(nèi)細胞及組織當(dāng)中GSH及相關(guān)巰基物濃度的改變與多種重大疾病相關(guān)聯(lián)。因此，GSH的含量是衡量機體內(nèi)抗氧化能力大小的重要指標(biāo)。報道稱，如果GSH在體內(nèi)的含量低于正常水平，將導(dǎo)致像糖尿病、酒精肝中毒、白內(nèi)障、癌癥、帕金森綜合征、心血管疾病、阿耳茨海默氏病(Alzheimer，早老性癡呆)等一系列病癥在人體的發(fā)生。因此，常規(guī)診斷利用GSH及相關(guān)巰基物的濃度檢測作為某些疾病診斷的重要依據(jù)。由此可見，建立高效、靈敏、經(jīng)濟的GSH及相關(guān)巰基化合物的檢測方法不僅有助于重大疾病的臨床診斷與治療，同時，對于生物、醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、食品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域的研究與應(yīng)用均具有重要意義。
目前，發(fā)展了多種測定GSH的檢測技術(shù)，包括化學(xué)的、儀器的，諸如紫外/可見分光光度法、熒光法、酶循環(huán)法、電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、電致化學(xué)發(fā)光法、高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法等多種方法，每種方法在靈敏度、選擇性、穩(wěn)定性、檢測時間、成本、儀器等方面都各有其優(yōu)缺點，目前還沒有一種既快速、穩(wěn)定、特異，又十分靈敏、經(jīng)濟的測定方法。影響了它們在高通量的常規(guī)臨床檢測及生物研究中的應(yīng)用。根據(jù)GSH檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢來看，迫切需要提高檢測靈敏度以實現(xiàn)微量樣品的高靈敏、高特異性的檢測要求。
近年來，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)及納米技術(shù)的快速發(fā)展為GSH的高靈敏、特異性生物傳感檢測技術(shù)提供了新的思路和技術(shù)。作為金納米粒子家族中的新材料，金納米籠一經(jīng)問世便得到了廣泛的關(guān)注和研究。研究表明，作為還愿型物質(zhì)的GSH能夠與含有雙硫鍵(—S—S—)的物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)，可將其中的雙硫鍵切斷并分別將其還原為巰基(—SH)，同時，自身被氧化，生成氧化型產(chǎn)物GSSG。本發(fā)明根據(jù)GSH的這一反應(yīng)特性，將其巧妙地應(yīng)用到基于納米材料的生物傳感的設(shè)計與應(yīng)用領(lǐng)域，為GSH的高靈敏檢測提供了新型、特異、高效的檢測平臺。采用金納米籠作為納米載體，利用含有雙硫鍵的生物分子構(gòu)建基于可控釋放的熒光傳感器檢測GSH的技術(shù)還未見文獻報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，針對基于可控釋放的熒光傳感器檢測GSH的技術(shù)未見報道，因此，本發(fā)明的第一目的：提出并構(gòu)建一種新型的基于可控釋放技術(shù)的GSH熒光傳感器，具體是利用中空多孔的金納米籠作為納米載體，將含有雙硫鍵的生物分子組裝到金納米籠表面，一方面起到分子生物門的作用封堵金納米籠孔內(nèi)物質(zhì)的外泄，另一方面作為分子識別探針與待測靶分子發(fā)生特異性的分子識別反應(yīng)。如有待測靶分子GSH的存在，組裝在金納米籠表面的含有雙硫鍵的生物分子將會與之發(fā)生特異性的分子識別反應(yīng)，導(dǎo)致雙硫鍵被切斷，含有雙硫鍵的生物分子從金納米籠表面脫離，從而使封堵籠孔的分子門被打開，并將金納米籠內(nèi)的客體分子如熒光分子釋放出來，實現(xiàn)熒光信號的增強與檢測。因此，可由體系熒光強度的增加來指示GSH的存在及其濃度大小。利用該熒光傳感器，能夠?qū)崿F(xiàn)對GSH的高靈敏、高選擇性檢測，為重大疾病的臨床診斷與治療、食品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域的研究與應(yīng)用提供新技術(shù)和新方法；本發(fā)明的第二目的：提供一種檢測GSH的熒光傳感器的制備方法；本發(fā)明的第三目的：提供一種應(yīng)用該熒光傳感器檢測GSH的方法。將本發(fā)明提出的熒光傳感器用于GSH的熒光檢測，能夠顯著地提高檢測靈敏度和特異性。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)發(fā)明目的的。本發(fā)明提出的檢測GSH的熒光傳感器是以金納米籠作為納米載體，利用其空心多孔的結(jié)構(gòu)特性，在其內(nèi)部裝載客體分子如熒光染料，為了防止熒光染料的外泄，利用含雙硫鍵的生物分子在金納米籠表面組裝具有可生物響應(yīng)的分子門，實現(xiàn)對金納米籠孔的封堵，防止孔內(nèi)物質(zhì)的釋放；其中，所述的含雙硫鍵的生物分子是經(jīng)過特別設(shè)計的、具有一定堿基長度的含有雙硫鍵的核苷酸分子，其堿基序列為5’-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3’，該生物分子作為靶分子的識別探針被組裝到金納米籠表面，同時，該識別探針也被用作封堵籠孔的分子門防止孔內(nèi)物質(zhì)的釋放。具有分子識別作用的探針分子門是通過在金納米籠表面修飾正電荷的方法而將其組裝到金納米籠表面，優(yōu)選地采用聚二烯丙基二甲基氯化銨作為正電荷修飾劑在金納米籠表面修飾一層聚陽離子。
優(yōu)選地，上述的GSH熒光傳感器，所述的熒光染料是羅丹明B。
一種制備本發(fā)明提出的基于可控釋放技術(shù)的GSH熒光傳感器的制備方法，包括如下步驟：
(1)將磁珠與金納米籠溶液混合，37℃恒溫振蕩12h，磁分離，清洗，加入聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液，37℃恒溫振蕩12h，磁分離，清洗；
(2)加入羅丹明B溶液，37℃恒溫振蕩12h后加入GSH識別探針溶液，繼續(xù)37℃振蕩12h后磁分離，清洗，即制得GSH熒光傳感器；
其中，所述的GSH識別探針是經(jīng)過特別設(shè)計的、具有一定堿基長度的含有雙硫鍵的核苷酸分子，其堿基序列為5’-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTCTTA-3’。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提出的基于可控釋放技術(shù)的GSH熒光傳感器是將金納米籠與含有雙硫鍵的GSH識別探針相結(jié)合，通過靜電組裝作用在金納米籠表面形成具有可生物響應(yīng)的分子門，利用識別探針與靶分子GSH之間發(fā)生的特異性的分子識別反應(yīng)，導(dǎo)致雙硫鍵被切斷，含有雙硫鍵的生物分子從金納米籠表面脫離，從而使封堵籠孔的分子門被打開，并將金納米籠內(nèi)的客體分子如熒光分子釋放出來，實現(xiàn)了熒光信號的增強與檢測，該方法使GSH的檢測靈敏度得到顯著提高，可實現(xiàn)對靶分子GSH高靈敏、高選擇性的檢測。本發(fā)明提出的GSH熒光傳感器具有結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性好、可控性強、熒光信號靈敏等優(yōu)點，同時，不受其它常見干擾物質(zhì)如Mg2+，Na+，F(xiàn)e3+，Ca2+，Zn2+等金屬離子的影響，具有高的選擇性，實驗結(jié)果表明，相比于其它非蛋白巰基物如硫氫化鈉(NaSH)、巰基己醇(MCH)、巰基乙酸(TA)、半胱胺酸(CYS)、二硫蘇糖醇(DTT)等物質(zhì)，本發(fā)明提出的GSH熒光傳感器顯示出優(yōu)異的選擇性和特異性，采用本發(fā)明提出的GSH熒光傳感器可在1.0×10-12～6.0×10-10M范圍內(nèi)實現(xiàn)對GSH的高靈敏、高選擇性檢測，與文獻值相比，本發(fā)明對谷胱甘肽的檢測靈敏度提高近100倍?？梢灶A(yù)見，該熒光傳感器及其制備方法和檢測技術(shù)具有較大的應(yīng)用潛力和廣闊的應(yīng)用前景，將在重大疾病的臨床診斷與治療、食品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。
附圖說明
圖1谷胱甘肽的濃度與熒光強度曲線圖。
具體實施方式
以下是本發(fā)明涉及的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步描述，但是本發(fā)明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
下面通過實施例具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受下述實施例的限定。
實驗儀器：THZ-82A氣浴恒溫振蕩器(金壇市醫(yī)療器械廠)；F-4600熒光分光光度計(日立，日本)；磁性分離架(天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心)。
實驗試劑：3-4μm巰基修飾磁珠(天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心)；羅丹明B(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；含有雙硫鍵的GSH識別探針的堿基序列為：5’-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3’(上海生工生物工程股份有限公司)，PBS緩沖溶液為0.01M(pH 7.4,Na2HPO4-NaH2PO4)。
實施例1：
一種制備本發(fā)明提出的基于可控釋放技術(shù)的GSH熒光傳感器的方法，包括如下步驟：
(1)20μL清洗后的巰基磁珠與400μL金納米籠溶液均勻混合，37℃恒溫振蕩12h，磁分離，清洗，在制得的金納米籠復(fù)合物中加入200μL聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液(11.664mg/mL)，37℃恒溫振蕩12h，磁分離，清洗；
(2)加入100μL羅丹明B溶液(1.0×10-5mol/L)，37℃恒溫振蕩12h后加入10μL GSH識別探針溶液(1.0×10-5M)，37℃振蕩12h，磁分離，清洗，即制得GSH熒光傳感器；
其中，所述的GSH識別探針是含有雙硫鍵的核苷酸分子，其堿基序列為5’-ACG AGTCA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3’；所述的巰基磁珠是購買的商品(天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心)；所述的金納米籠按文獻方法獲得(G.D.Moon,S.W.Choi,X.Cai,W.Y.Li,E.C.Cho,U.Jeong,L.V.Wang and Y.N.Xia.J.Am.Chem.Soc.2011,133,4762–4765)。
實施例2:
一種采用本發(fā)明提出的基于可控釋放技術(shù)的GSH熒光傳感器檢測GSH的方法如下：
(1)將10μL待測GSH樣品溶液加入到本發(fā)明提出的基于可控釋放技術(shù)的GSH熒光傳感器中，用PBS緩沖溶液(PH＝7.4)稀釋至100μL，37℃恒溫振蕩2h，識別探針與靶分子GSH之間發(fā)生特異性的分子識別反應(yīng)，導(dǎo)致雙硫鍵被切斷，含有雙硫鍵的識別探針從金納米籠表面脫離，從而使封堵籠孔的分子門被打開，并將金納米籠內(nèi)的熒光分子羅丹明B釋放出來；
(2)磁分離，收集上清液及洗液進行熒光檢測，檢測條件：激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為530、573nm。
圖1為GSH的濃度與熒光強度曲線圖，GSH的濃度分別為(a→l：0；1.0×10-12；5.0×10-12；1.0×10-11；4.0×10-11；8.0×10-11；1.0×10-10；2.0×10-10；4.0×10-10；6.0×10-10；2.0×10-9；1.0×10-8M)；結(jié)果表明，GSH濃度在1.0×10-12～6.0×10-10M時，熒光信號強度與GSH濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為：FL＝220.464+0.805CGSH(10-12M)，線性相關(guān)系數(shù)為0.9939。
本發(fā)明將分子識別技術(shù)、可控釋放技術(shù)與納米技術(shù)相結(jié)合，通過特異性的分子識別反應(yīng)，可實現(xiàn)對非蛋白巰基物GSH的高靈敏、高選擇性檢測。具體是將中空多孔的金納米籠與含有雙硫鍵的GSH識別探針相結(jié)合，使該熒光傳感器具有可生物響應(yīng)的分子門，一旦有待測靶分子GSH的存在，則發(fā)生識別探針與GSH之間的特異性的分子識別反應(yīng)，導(dǎo)致雙硫鍵被切斷，含有雙硫鍵的識別探針從金納米籠表面脫離，從而使封堵籠孔的分子門被打開，金納米籠內(nèi)的熒光分子羅丹明B得以釋放，實現(xiàn)熒光信號的增強與檢測，因此，利用該熒光傳感器，能夠?qū)崿F(xiàn)對GSH的高靈敏、高選擇性檢測。
本發(fā)明提出的基于可控釋放技術(shù)的GSH熒光傳感器具有結(jié)構(gòu)簡單，穩(wěn)定性好，可控性強，熒光信號靈敏等優(yōu)點，同時，不受其它常見干擾物質(zhì)如Mg2+，Na+，F(xiàn)e3+，Ca2+，Zn2+等金屬離子的影響，具有高的選擇性，可用于微量樣品中低含量乃至極低含量GSH的高靈敏、高選擇性檢測，不但能夠為醫(yī)療衛(wèi)生、食品、生命科學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用與研究提供新的途徑和方法，尤為重要的是，基于本發(fā)明的可控釋放技術(shù)也將為腫瘤靶向、藥物輸送、重大疾病的早期診斷與治療帶來全新的方法和技術(shù)。