本發(fā)明屬于納米材料和分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種抗壞血酸光學(xué)檢測方法。

背景技術(shù)：

抗壞血酸(aa)是腦系統(tǒng)中最重要的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)之一，某些疾病與aa水平是密切相關(guān)，因此有必要發(fā)展一種具有高度選擇性和快速靈敏檢測aa的分析方法。

目前關(guān)于抗壞血酸的含量的測定方法有熒光光度法、直接碘量法、紫外分光光度法、動力學(xué)光度法、間接光度法、化學(xué)發(fā)光法、電極催化氧化法、高效液相色譜法等。其中紫外可見光度法檢測抗壞血酸具有檢測范圍大、準確度高、快速、簡便、誤差小等優(yōu)點。但同時存在檢測限高、反應(yīng)時間長和操作麻煩等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種檢測抗壞血酸的顯色劑及其應(yīng)用。利用本發(fā)明所述的顯色劑檢測抗壞血酸更加簡單、快速，靈敏度高。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種顯色劑，為含1.5-2.5mm的oxtmb的藍色水溶液；所得顯色劑為藍色水溶液，ph值為5.0-7.0。

所述oxtmb的結(jié)構(gòu)式如下：

所述顯色劑由羥基氧化鈷納米片混懸液與3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺水溶液混合制得；其中所述羥基氧化鈷納米片與所述3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺的摩爾比為2:1。

優(yōu)選地，所述羥基氧化鈷納米片混懸液的濃度為35-45μg/ml，所述3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺水溶液的濃度為1.5-2.5mm。優(yōu)選地，所述顯色劑中所述羥基氧化鈷濃度為40μg/ml；優(yōu)選3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺濃度為2.0mm。所述羥基氧化鈷納米片混懸液與所述3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺水溶液按體積比1:1混合。

所述羥基氧化鈷納米片與tmb水溶液混合發(fā)生氧化還原反應(yīng)，得到含有oxtmb的藍色水溶液，其中所述oxtmb的濃度為1.5-2.5mm；將含有oxtmb的水溶液(即顯色劑)與aa接觸，二者反應(yīng)使體系由藍色變?yōu)闊o色，從而利用該性質(zhì)來檢測待測物中aa含量。

進一步優(yōu)選地，所述顯色劑在制備過程中還加入檸檬酸和edta，起到緩沖溶液的作用，更有利于tmb與羥基氧化鈷納米片反應(yīng)順利進行。其中所述檸檬酸在顯色劑中濃度為0.05-0.15mm，所述edta在顯色劑中濃度為0.4-0.6m。

作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式之一，所述顯色劑中所述羥基氧化鈷納米片混懸液由下述方法制得：

將氯化鈷(cocl2)與氫氧化鈉(naoh)加入水中，超聲處理，再加入次氯酸鈉(naclo)，超聲處理，得到深棕色的混合溶液，離心，過濾得到羥基氧化鈷納米片；再將羥基氧化鈷納米片溶于水中配制得到羥基氧化鈷納米片混懸液。

所得羥基氧化鈷納米片的粒徑為95-105nm，平均粒徑為100nm。

所述氯化鈷、氫氧化鈉、次氯酸鈉的摩爾比為9-12：0.5-2.0：500-1000，優(yōu)選10:1:900。

所述超聲處理時間為10-13min，具體為11min。

所述水選自二次水。

作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式之一，所述顯色劑中所述tmb水溶液由如下方法制得：常溫下，先將3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺粉末溶于有機溶劑中直至完全溶解，得到混合液a；再將緩沖劑和螯合劑加入水中得到混合液b，將混合液a加入混合液b中，混勻，得到tmb水溶液。

所述3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺粉末與緩沖劑、螯合劑的用量比例為：10mg：0.05-0.15mm：0.4-0.6m。

所述緩沖劑優(yōu)選檸檬酸；所述螯合劑優(yōu)選乙二胺四乙酸二鈉(edta)。

所述檸檬酸水溶液的濃度為0.05-0.15mm，具體為0.1mm。所述edta水溶液的濃度為0.4-0.6m，具體為0.5m。所述3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液與檸檬酸和edta的混合溶液的體積比為1：1-1.05，具體為1：1.02。

所述有機溶劑優(yōu)選二甲亞砜dmso。

本發(fā)明還提供上述顯色劑在還原性生物分子檢測中的應(yīng)用；優(yōu)選對抗壞血酸的檢測。

本發(fā)明還提供一種抗壞血酸的檢測方法，包括如下步驟：

(1)向待測樣品中加入顯色劑，檢測其在652nm處的紫外吸光度值，記為a；

(2)計算δa＝a0–a，其中a0為顯色劑在652nm處的紫外吸光度值；

(3)代入線性方程δa＝0.19296c+0.01428，相關(guān)系數(shù)為0.994，求得c值；其中c為待測樣品中抗壞血酸的濃度。

其中，所述線性方程由如下方法獲得：向所述顯色劑中依次加入0nm、10nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1μm、10μm、50μm、100μm和200μm的aa溶液后，在652nm處的紫外可見吸收強度逐漸減小，如圖4a所示。將紫外吸收強度的變化值δa(a0-a)與加入的aa的濃度作圖，其中a0及a為加入aa前后的藍色溶液在652nm處紫外可見吸收的強度，如圖4b所示。插圖為紫外吸收變化值與aa濃度的線性關(guān)系圖，線性范圍為10nm-1μm，線性方程為a0-a＝0.19296c+0.01428，相關(guān)系數(shù)為0.994，方程中c代表加入的aa濃度。檢測時，藍色溶液與aa溶液的體積比為1:2，相當于每一份aa樣品被稀釋了1.5倍，所以本發(fā)明對aa的檢測限為6.67nm。

本發(fā)明所述顯色劑的載體可為可視化試紙或其它便于檢測的載體形式。所述可視化試紙具體制作方法為：將試紙浸漬顯色劑中3-10min，于空氣中放置3-10min，即得。

在試紙上滴上不同濃度(如0μm、5μm、20μm、50μm、100μm、200μm)的aa時，可以在試紙上觀察到不同的顏色變化。依據(jù)不同顏色，判斷aa濃度。

本發(fā)明提供的顯色劑，在檢測抗壞血酸時，顯色劑的顏色變化過程如圖1所示，首先，上述制得的改性六邊形羥基氧化鈷混合溶液直接與tmb溶液混合，即可得到上述的藍色溶液，因為六邊形羥基氧化鈷納米片與tmb發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使無色的tmb氧化成藍色的oxtmb(氧化態(tài))，這就制得了上述所述的紫外藍色溶液體系。

其次，由于抗壞血酸具有很強的還原性，所以當在這個體系中加入抗壞血酸過后，氧化態(tài)的oxtmb會被還原為tmb，溶液的藍色會很快的褪去，而且加入不同濃度的抗壞血酸，溶液顏色的變化也會不同，即抗壞血酸的濃度越大，顏色褪去的程度越大。

我們發(fā)現(xiàn)六邊形羥基氧化鈷納米片可以氧化tmb，氧化產(chǎn)物呈現(xiàn)明顯的藍色，具有強烈的可見光吸收，當體系中加入抗壞血酸時，因抗壞血酸具有強烈的還原性，可以將tmb氧化態(tài)還原，體系藍色消失，從而可以建立抗壞血酸的快速紫外可見分析方法。據(jù)此，本發(fā)明建立了一種簡單、快速檢測抗壞血酸分子的比色方法，并能夠應(yīng)用于實際生物樣品的檢測。

本發(fā)明具有的優(yōu)勢在于：

1)所述六邊形羥基氧化鈷納米片和tmb溶液制備簡便，進而可建立一種簡單、快速的比色方法來檢測生理環(huán)境中的生理分子。

2)本發(fā)明所述顯色劑可負載于可視化試紙，從而簡單有效的檢測抗壞血酸。

3)本發(fā)明所述用于檢測抗壞血酸的方法靈敏度較高，檢測限為6.67nm。

附圖說明

圖1為六邊形羥基氧化鈷納米片混合溶液與tmb溶液混合的藍色體系檢測抗壞血酸的策略圖；

圖2為實施例1所得三種體系的透射電子顯微鏡(tem)表征圖，其中，a為coooh納米片；b為tmb-coooh納米片；c為tmb-aa-coooh納米片。

圖3為可行性試驗的紫外可見光譜圖，其中a為tmb-coooh納米片；b為tmb-h2o2-coooh納米片；c為tmb-h2o-coooh納米片；d為tmb-aa-coooh納米片；e為tmb-aa。

圖4為加入不同濃度aa的紫外可見吸收光譜圖。a圖所示為在652nm處的紫外吸收光譜圖，分別加入了aa溶液濃度為0nm、10nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1μm、10μm、50μm、100μm和200μm的紫外可見吸收光度值a；b圖為六邊形羥基氧化鈷納米片比色檢測aa的標準曲線圖。

圖5所示為檢測鼠腦透析液中aa含量的紫外吸收光譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實施例。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑獲得。

下述實施例中的試劑來源為：六水合氯化鈷(cocl2·6h2o)；氫氧化鈉(naoh)；次氯酸鈉(naclo)；抗壞血酸(aa)；檸檬酸(c6h8o7·h2o)；乙二胺四乙酸二鈉(c10h14n2o8na·2h2o)；3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(c16h20n2)；二甲基亞砜((ch3)2so)，所有試劑均為分析純，所提及的水溶劑均為二次水。

實施例1

第一步，前體的制備和表征

(a)六邊形羥基氧化鈷納米片混懸液的制備：將0.0238gcocl2粉末置于10ml離心管中得10mmcocl2水溶液；0.4gnaoh顆粒置于10ml離心管中得1.0mmnaoh溶液；6.696mlnaclo溶液置于10ml離心管中，并用二次水稀釋至10ml得0.9mnaclo溶液。取250μlnaoh與1mlcocl2溶液置于5ml離心管中，超聲1min，再加入50μlnaclo溶液，超聲10min，然后離心、干燥即可得到深棕色的六邊形羥基氧化鈷納米片。將羥基氧化鈷納米片分散于水中得到羥基氧化鈷納米片混懸液。

coooh納米片的表征：利用透射電子顯微鏡對coooh納米片混懸液進行表征，所得結(jié)果如圖2a所示。由圖可知，coooh在水相中分布均勻，且粒徑均一。據(jù)統(tǒng)計分析，coooh的粒徑分布在90-110nm，平均粒徑為100nm。

(b)tmb水溶液的制備：將10mg的tmb粉末置于5ml的離心管中，加入1ml的二甲基亞砜(dmso)使其完全溶解；0.021g檸檬酸顆粒置于5ml離心管中，加入1ml二次水使其溶解；0.0037g乙二胺四乙酸二鈉(edta)粉末置于1ml離心管中，加入20μl二次水使其溶解；將上述溶液置于50ml離心管中，用二次水稀釋至20ml即可得到tmb水溶液。

第二步，藍色混合溶液體系的制備及其表征

藍色體系的制備：將上述制得的濃度為40μg/ml的coooh納米片懸濁液與濃度為2mm的tmb的水溶液按體積比1：1于常溫下混合均勻，靜止放置維持15分鐘，待溶液由無色變?yōu)樗{色且穩(wěn)定時，即得到本發(fā)明提供的藍色混合溶液體系，該溶液的ph值為5.0。

表征：利用tem對藍色溶液體系進行表征，所得結(jié)果如圖2b所示。由圖可知，六邊形的羥基氧化鈷納米片被tmb溶液刻蝕，據(jù)統(tǒng)計分析，刻蝕了的圓形納米片尺寸分布為40-60nm，平均尺寸為50nm。

向所得藍色溶液中加入aa，體系藍色消失，利用tem對加入aa的溶液體系進行表征，所得結(jié)果如圖2c所示。

實施例2

利用紫外可見分光光度計，就實施例1所得顯色劑的可行性試驗作圖，如圖3所示，(a)為在5ml離心管中分別加入1ml的coooh納米片懸濁液與tmb的水溶液待其顏色穩(wěn)定后，置入比色皿中，測其紫外吸收強度；(b)為在2ml藍色溶液中加入1mlh2o2的紫外吸收曲線；(c)為在2ml藍色溶液中加入1mlh2o的紫外吸收曲線；(d)為上述同樣方法制得的藍色溶液中加入100μl濃度為100μm的aa溶液的紫外吸收曲線；(e)為分別加入1ml的tmb和上述濃度的aa水溶液的紫外吸收曲線。

b、c紫外吸收曲線在652nm處的強度基本一樣，說明h2o2對體系是沒有影響的，d曲線的紫外吸收強度有明顯的變化，說明在上述所制的藍色溶液體系對aa有很好的響應(yīng)，那是因為強還原性的aa使具有藍色的oxtmb還原為無色的tmb。

實施例3

將實施例1所得顯色劑制成可視化試紙，利用可視化的顏色變化來檢測aa，具體步驟如下：

1)確定對aa的檢測限：

在實施例1所制得的顯色劑藍色水溶液中依次加入0nm、10nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1μm、10μm、50μm、100μm和200μm的aa溶液后，在652nm處的紫外可見吸收強度逐漸減小，如圖4a所示。將紫外吸收強度的變化值δa(a0-a)與加入的aa的濃度作圖，其中a0及a為加入aa前后的藍色溶液在652nm處紫外可見吸收的強度，如圖4b所示。插圖為紫外吸收變化值與aa濃度的線性關(guān)系圖，線性范圍為10nm-1μm，線性方程為a0-a＝0.19296c+0.01428，相關(guān)系數(shù)為0.994，方程中c代表加入的aa濃度。檢測時，藍色溶液與aa溶液的體積比為1:2，相當于每一份aa樣品被稀釋了1.5倍，所以利用本發(fā)明所述顯色劑對aa檢測的檢測限為6.67nm。

2)設(shè)置大鼠腦透析液液實驗?zāi)Ｐ停脤嵤├?所得顯色劑檢測含有aa的大鼠腦透析液：

在正常情況下對大鼠的腦區(qū)進行微透析，得到含有aa的腦透析液。利用本發(fā)明提供的藍色溶液體系測定抗壞血酸得到的紫外吸收可見光譜圖，如圖5a所示。圖5b所示，在652nm處，紫外吸收強度變化值δa與[aa]的線性關(guān)系，線性方程為δa＝6.33*10^-3c+0.11143，相關(guān)系數(shù)為0.983，方程中c代表aa的濃度，根據(jù)上述方程求得正常大鼠腦透析液中的aa濃度為10.23μm。后進行加標實驗，在正常狀態(tài)下大鼠腦透析液中aa平均含量為8.30±1.93μm，由此證明了本發(fā)明提供的藍色溶液體系具有對aa的高選擇性及高靈敏檢測的能力，并能夠成功應(yīng)用于實際生物樣品的動物模型中，進一步體現(xiàn)了該方法的實際應(yīng)用能力。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。