本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析方法。

背景技術(shù)：

軟骨藻酸（da），屬高毒性非蛋白氨基酸類貝類毒素，對生態(tài)安全以及人類健康大，其在環(huán)境中的分布和含量必須受到嚴格監(jiān)控。軟骨藻酸貝類毒素含量低、成分復(fù)雜，主要的分析技術(shù)有小鼠分析法、生物分析法、高效液相色譜法等。由于軟骨藻酸缺乏生色團、無熒光特性，開展高靈敏的熒光分析時需要衍生標記，常規(guī)熒光標記試劑adam極不穩(wěn)定（-80℃保存），難于實現(xiàn)室溫下在線熒光衍生標記；而直接紫外檢測靈敏度低，且特別受海洋背景干擾大，難于滿足超痕量分析監(jiān)測的要求，必須借助固相萃取柱（spe）離線富集以提高檢測靈敏度，流程繁瑣、耗時長，不利于復(fù)雜環(huán)境中軟骨藻酸的高靈敏分析。

目前，柱上富集技術(shù)日趨重要，在液相色譜中得到了良好的發(fā)展。常規(guī)hplc柱上富集主要基于溶質(zhì)在固定相中自發(fā)吸附,在柱頭進樣過程中產(chǎn)生局部堆積的填料自富集濃縮作用。通過固相微萃取技術(shù)與液相色譜的在線聯(lián)用，使得分析樣品用量從立升級減少到毫升級甚至微升級，實現(xiàn)了大體積進樣富集；采用閥切換技術(shù)，使樣品定量恒流富集，雖然大幅度提升了靈敏度，但是背景物質(zhì)同樣得到了富集，導(dǎo)致背景譜線變得十分復(fù)雜，對痕量分析的準確帶來了嚴重的不利影響。二維色譜分析技術(shù)對復(fù)雜組分進行預(yù)分離的基礎(chǔ)上可以選擇性進行二次分離，分離度和分辨率高，發(fā)展迅猛，對于復(fù)雜樣品分析十分有利，但是該技術(shù)在二維切換過程中存在色譜流動相稀釋樣品區(qū)帶、樣品區(qū)帶濃度擴散嚴重、分析靈敏度下降等不足。

因此，將在線熒光衍生技術(shù)、二維液相色譜分離和在線連續(xù)富集等技術(shù)協(xié)同運用，實現(xiàn)痕量毒素樣品在柱熒光標記、背景高效分離及連續(xù)富集濃縮，對切實解決二維色譜流程中普遍存在的流動相稀釋樣品濃度、樣品區(qū)帶擴散、分析靈敏度下降等技術(shù)瓶頸十分有利，對實現(xiàn)復(fù)雜海洋樣品中軟骨藻酸的在線痕量分析具有良好應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析的方法；所述的非蛋白氨基酸毒素為軟骨藻酸。本發(fā)明綜合應(yīng)用了在線熒光標記、二維色譜富集分離和熒光分析，流程連續(xù)、背景干擾小、靈敏度高，可用于痕量軟骨藻酸等非蛋白氨基酸毒素的準確分析。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

所述一種非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析方法，非蛋白氨基酸毒素在線與熒光標記試劑發(fā)生熒光衍生反應(yīng)，熒光標記產(chǎn)物經(jīng)由第一維液相色譜多通閥切換進入第一維色譜分離柱實現(xiàn)第一次大體積進樣富集、分離；然后將所得到的分離組分經(jīng)由第二維多通閥中心切割進入第二維色譜分離柱，完成熒光標記產(chǎn)物的第二次大體積進樣富集、分離和熒光高靈敏分析，從而實現(xiàn)非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析；所述非蛋白氨基酸毒素為軟骨藻酸。

所述一種非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析方法，應(yīng)用一種在線衍生-二維液相色譜連續(xù)富集分離裝置而實現(xiàn)，所述的在線衍生二維液相色譜連續(xù)富集分離裝置是由在線熒光衍生模塊和二維液相色譜連續(xù)富集分離模塊組成；

所述在線熒光衍生模塊包括熒光反應(yīng)組件、流路輸送及切換組件和反應(yīng)終止組件，所述熒光反應(yīng)組件包括樣品溶液（2）、鹽溶液（3）、熒光標記試劑（4）和在線反應(yīng)管（9），所述流路輸送及切換組件包括注射泵（7、8）、三通閥（6）和蒸餾水（1），所述反應(yīng)終止組件包括無機酸溶液（5）；所述二維液相色譜連續(xù)富集分離模塊包括多通閥（11、16）、餾分收集定量環(huán)（10、15)、色譜柱(14、19)、高壓泵(13、18)和熒光檢測器（20）；

所述餾分收集定量環(huán)（10）入口端與在線反應(yīng)器（9）出口相連，在“進樣”模式中出口端與第一維液相色譜分離柱（14）入口端相連，大體積連續(xù)進樣；所述餾分收集定量環(huán)（15）入口端與第一維液相色譜分離柱（14）出口相連，在“進樣”模式中出口端與第二維液相色譜分離柱（19）入口端相連，大體積連續(xù)進樣。

所述一種非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析方法，具體包括以下步驟：

1）以體積比1：1：1將樣品溶液（2）與鹽溶液（3）和熒光標記試劑（4）在線混合，經(jīng)三通閥（6）由注射泵（7）以流速125μl/min將三者混合液注入反應(yīng)管（9），連續(xù)注射熒光衍生反應(yīng)液總體積為375μl；

2）調(diào)節(jié)三通閥（6）控制流路，停止采集樣品溶液（2）、鹽溶液（3）和熒光標記試劑（4）；運行注射泵（7）以流速125μl/min注射蒸餾水（1），驅(qū)動反應(yīng)管（9）中衍生反應(yīng)液；運行注射泵（8）以流速125μl/min注射無機酸溶液，與上述蒸餾水（1）驅(qū)動的衍生反應(yīng)液混合，終止熒光衍生反應(yīng)，并將混合后溶液推入第一維液相色譜的餾分收集定量環(huán)（10）；

3）切換多通閥（11），以含體積分數(shù)0.1%三氟乙酸溶液、體積比為32：68的乙腈-水溶液為流動相，經(jīng)由高壓泵（13）以流速1.0ml/min將步驟（2）所得的反應(yīng)液注入第一維液相色譜分離柱（14）進行預(yù)分離，分離產(chǎn)物進入第二維液相色譜的餾分收集定量環(huán)（15）；

4）切換多通閥（16），以含體積分數(shù)0.1%三氟乙酸溶液、體積比為46：54的乙腈-水溶液為流動相，經(jīng)由高壓泵（18）以流速1.0ml/min將步驟（3）所得的反應(yīng)液注入第二維液相色譜分離柱（19）進行二次分離和熒光高靈敏檢測，實現(xiàn)非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析。

所述鹽溶液為濃度為0.10mol/l的硼砂溶液；

所述熒光標記試劑為濃度為1.0mg/ml的4-氟-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑；

所述無機酸溶液為濃度為1.0mol/l的鹽酸溶液；

所述第一維色譜分離柱和第二維色譜分離柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠填充柱；

所述第一維液相色譜的餾分收集定量環(huán)10的采樣體積為500μl；

所述第二維液相色譜的的餾分收集定量環(huán)15的采樣體積為200μl。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：

針對軟骨藻酸常規(guī)熒光標記試劑adam極不穩(wěn)定（-80℃保存）、難于實現(xiàn)室溫下在線熒光衍生標記，傳統(tǒng)在柱富集導(dǎo)致背景物質(zhì)同時得到濃縮、背景十分復(fù)雜，常規(guī)二維色譜流動相稀釋樣品區(qū)帶嚴重、分析靈敏度下降嚴重等不利影響，將在線熒光衍生技術(shù)、二維液相色譜分離和在線連續(xù)富集等技術(shù)協(xié)同運用，實現(xiàn)痕量毒素樣品在柱熒光標記、背景高效分離及連續(xù)富集濃縮，在線進行熒光標記，產(chǎn)物經(jīng)由第一維液相色譜實現(xiàn)大體積進樣富集、分離，然后將分離組分經(jīng)由多通閥中心切割進入第二維色譜完成第二次大體積進樣富集、分離和熒光高靈敏分析，實現(xiàn)非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析，富集后熒光檢測的靈敏度最低可達0.0001μg/ml，切實解決二維色譜流程中普遍存在的流動相稀釋樣品濃度、樣品區(qū)帶擴散、分析靈敏度下降等技術(shù)瓶頸，對實現(xiàn)復(fù)雜海洋樣品中軟骨藻酸的在線痕量分析具有良好應(yīng)用前景。

附圖說明：

圖1為非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析裝置示意圖：

1：蒸餾水；2：樣品溶液；3：鹽溶液；4：熒光試劑；5：無機酸溶液；6：三通閥；7、8：微量注射泵；9：在線反應(yīng)管；10、15：餾分收集定量環(huán)；11、16：多通閥；12、17：色譜流動相；13、18：高壓泵；14、19：色譜柱；20：熒光檢測器；21：廢液。

圖2為非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析譜圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實施例1：應(yīng)用非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析裝置（圖1），在線衍生非蛋白氨基酸毒素，二維液相色譜連續(xù)富集分離，實現(xiàn)非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析。

所述非蛋白氨基酸毒素的在線痕量分析裝置是由在線熒光衍生模塊和二維液相色譜連續(xù)富集分離模塊組成；所述在線熒光衍生模塊包括熒光衍生組件、流路輸送及切換組件和反應(yīng)終止組件，所述熒光反應(yīng)組件包括樣品溶液（2）、鹽溶液（3）、熒光標記試劑（4）和在線反應(yīng)管（9），所述流路輸送及切換組件包括注射泵（7、8）、三通閥（6）和蒸餾水（1），所述反應(yīng)終止組件包括無機酸溶液（5）；所述二維液相色譜連續(xù)富集分離模塊包括多通閥（11、16）、餾分收集定量環(huán)（10、15)、色譜柱(14、19)、高壓泵(13、18)和熒光檢測器（20）；

所述非蛋白氨基酸毒素的在線超痕量分析，其方法具體為：

1）在線熒光標記反應(yīng)：以體積比1：1：1將軟骨藻酸溶液與0.10mol/l硼砂溶液和1.0mg/ml4-氟-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑熒光標記試劑在線混合，經(jīng)三通閥（6）由注射泵（7）以流速125μl/min將三者混合液注入反應(yīng)管（9），連續(xù)注射熒光衍生反應(yīng)液總體積為375μl；

調(diào)節(jié)三通閥（6）控制流路，停止采集樣品溶液、硼砂溶液和熒光標記試劑；運行注射泵（7）以流速125μl/min注射蒸餾水（1），驅(qū)動反應(yīng)管（9）中衍生反應(yīng)液；運行注射泵（8）以流速125μl/min注射1.0mol/l鹽酸溶液，與上述蒸餾水（1）驅(qū)動的衍生反應(yīng)液混合，終止熒光衍生反應(yīng)，并將混合后溶液推入第一維液相色譜的餾分收集定量環(huán)（10）；

2）第一維色譜富集分離：切換多通閥（11），以三氟乙酸含量為0.1%（v/v）的乙腈-水=32：68（v/v）溶液為流動相，進樣體積500μl，分離柱為ods柱（250×5mmi.d.，5μm），經(jīng)由高壓泵（13）以流速1.0ml/min將步驟2）所得的反應(yīng)液注入第一維色譜分離柱（14）進行預(yù)分離，對軟骨藻酸進行第一維的富集、分離，分離產(chǎn)物進入第二維色譜的餾分收集定量環(huán)（15）；

3）第二維色譜富集分離：切換多通閥（16），以三氟乙酸含量為0.1%（v/v）的乙腈-水46：54（v/v）溶液為流動相，采樣體積為200μl，色譜分離柱為ods柱（250×5mmi.d.，5μm），經(jīng)由高壓泵（18）以流速1.0ml/min將步驟3）所得的反應(yīng)液注入第二維液相色譜分離柱（19）進行二次分離和熒光高靈敏檢測。

在以上最優(yōu)條件下，實現(xiàn)了軟骨藻酸的在線衍生、富集分離，富集后熒光檢測的靈敏度最低可達0.0001μg/ml，譜圖如圖2所示。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。