本發(fā)明具體涉及一種棉葉中萜烯類物質(zhì)的測(cè)定方法，屬于棉酚(g)及其相關(guān)物含量的測(cè)定方法技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

棉酚及相關(guān)物甲氧基半棉酚(dhg)、半棉酚(hgq)、半棉酚(hg)、殺實(shí)夜蛾素(h1-4)等是棉花中重要的抗蟲(chóng)性萜烯類次生物質(zhì)，廣泛存在于棉花各種組織器官中的色素腺體內(nèi)。國(guó)內(nèi)外對(duì)棉花抗蟲(chóng)萜烯類化合物種類和抗蟲(chóng)性能的研究表明，棉葉色素腺體內(nèi)的棉酚等次生物質(zhì)具有植物抗菌素的功能，可以使棉花抵御外界昆蟲(chóng)和微生物的侵害。棉酚在醫(yī)藥等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)于棉酚的測(cè)定方法很多，如薄層色譜法、紫外-可見(jiàn)分光光度法、核磁共振法(nmr)、高效液相色譜法(hplc)、高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法(hplc-ms)。其中分光光度法應(yīng)用較普遍，smith-苯胺法利用棉酚中含有的芳香醛結(jié)構(gòu)與苯胺反應(yīng)形成黃色物質(zhì)進(jìn)行比色測(cè)定，而棉株中所有的含芳香醛基的物質(zhì)均可與苯胺發(fā)生此反應(yīng)，更不能將萜烯類物質(zhì)分離。液相色譜分析方法，如國(guó)標(biāo)法，適合于植物油或以棉籽餅為原料的食品中游離棉酚的測(cè)定。

由于現(xiàn)有技術(shù)的上述限制，目前還沒(méi)有一種針對(duì)棉花樣品的，在室溫條件下，測(cè)定樣品提取物的穩(wěn)定性，簡(jiǎn)便、快速、可重復(fù)的測(cè)定棉葉中萜烯類物質(zhì)的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)便、快速、可重復(fù)的測(cè)定棉葉中萜烯類物質(zhì)的檢測(cè)方法。

具體的，所述測(cè)定方法包括；

步驟一儀器試劑準(zhǔn)備

準(zhǔn)備液相色譜儀，dad檢測(cè)器，色譜柱，超聲清洗器，振蕩器，離心機(jī)；

準(zhǔn)備棉酚標(biāo)準(zhǔn)品；

步驟二植株材料準(zhǔn)備

采集棉葉樣品；

步驟三棉酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取棉酚標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮溶解，定容至容量瓶中，得到棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存；

步驟四棉葉測(cè)試樣品溶液的制備

稱取粉碎樣品于離心管中，加入提取溶劑，提取溶劑為體積比80∶20∶0.1的乙腈、水、磷酸，超聲提取，提取液離心分離，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，獲得棉葉則試樣品溶液；

步驟五確定棉酚的峰

在相同的色譜條件下，將步驟四獲得的棉葉測(cè)試樣品溶液的hplc(高效液相色譜法)圖譜與棉酚標(biāo)準(zhǔn)品的hplc圖譜對(duì)比，確定棉酚的峰。

進(jìn)一步的，所述步驟一中液相色譜儀為安捷倫1100型高效液相色譜儀，所述色譜柱為eclipseplusc18柱，5μm，4.6×250mm，測(cè)試方法中所用有機(jī)試劑甲醇、丙酮、乙腈、磷酸均為色譜純?cè)噭?，采用超純水?/p>

進(jìn)一步的，所述步驟二中棉葉樣品采集后，液氮研磨后真空干燥脫水處理。

進(jìn)一步的，所述步驟三具體為，稱取棉酚標(biāo)準(zhǔn)品50mg，用丙酮溶解，定容至50ml棕色容量瓶中，得到濃度為1000mg/l的棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冰箱避光保存。

進(jìn)一步的，所述步驟四具體為，稱取粉碎樣品100mg于離心管中，精確至0.0001g，加入2ml提取溶劑，提取溶劑為體積比80∶20∶0.1的乙腈、水、磷酸，超聲提取15min，提取液離心分離，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，獲得棉葉測(cè)試樣品溶液。

進(jìn)一步的，所述步驟五中色譜條件為，hplc法，流動(dòng)相為甲醇：1％磷酸，v/v＝85∶15，等度洗脫；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量20μl。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供一種棉葉中萜烯類物質(zhì)的測(cè)定方法，樣品經(jīng)過(guò)處理后，不需要濃縮及進(jìn)一步的凈化程序，采用高效液相色譜儀(hplc)，對(duì)棉酚(g)及其相關(guān)物進(jìn)行分離和含量的測(cè)定；在室溫條件下，測(cè)定樣品提取物的穩(wěn)定性，精密度好，穩(wěn)定性高，建立了一套簡(jiǎn)便、快速、可重復(fù)的檢測(cè)方法，為棉花抗蟲(chóng)和育種工作者提供技術(shù)支持。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例中棉酚標(biāo)準(zhǔn)品的hplc檢測(cè)圖譜；

圖2為實(shí)施例中棉葉樣品的hplc檢測(cè)圖譜；

圖3為實(shí)施例中棉酚標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明：

本實(shí)施例中，棉葉中萜烯類物質(zhì)的測(cè)定方法的材料與方法如下：

儀器與試劑

安捷倫1100型高效液相色譜儀，dad檢測(cè)器，色譜柱：eclipseplusc18柱(5μm，4.6×250mm)，超聲清洗器，振蕩器，離心機(jī)。

棉酚標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自sigma公司(批號(hào)g8761-(±)-gossypolfromcottonseeds，≥95％)，所用有機(jī)試劑甲醇、丙酮、乙腈、磷酸均為色譜純?cè)噭?，?gòu)自sigma公司，實(shí)驗(yàn)中均采用miliq超純水。

植株材料

供試棉花為試驗(yàn)田棉花(石抗-126)，常規(guī)管理。

棉葉樣品采集后，液氮研磨后真空干燥脫水備用。

色譜條件

hplc法，流動(dòng)相為甲醇：1％磷酸(v/v＝85∶15)，等度洗脫；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量20μl。

棉酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取棉酚標(biāo)準(zhǔn)品50mg，用丙酮溶解，定容至50ml棕色容量瓶中，得到濃度為1000mg/l的棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冰箱避光保存。

測(cè)試樣品溶液的制備

稱取粉碎樣品100mg(精確至0.0001g)于離心管中，加入2ml提取溶劑-乙腈/水/磷酸(體積比：80∶20∶0.1)，超聲提取15min，提取液離心分離，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液按照色譜條件選樣20μl測(cè)定。在以上確定的提取與色譜條件下，與棉酚標(biāo)準(zhǔn)品圖譜相比，以確定棉酚的峰，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

精密度實(shí)驗(yàn)

取40μg/ml的棉酚標(biāo)液，按上述的色譜條件進(jìn)行分析，在同一條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，得到棉酚峰面積為6227.6、6192.2、6232.5、6235.9、6095.7，rsd為0.95％(n＝5)，說(shuō)明該方法精密度良好。

平行性與重復(fù)性測(cè)定

稱取六份樣品各100mg，冷凍干燥后研磨過(guò)40目篩，以乙腈/水/磷酸為提取劑，振蕩、超聲15min提取，離心分離后測(cè)定棉酚的含量，所得數(shù)據(jù)如表1所示。表明該方法重復(fù)性好。

表1

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取待測(cè)樣品溶液，于室溫下放置12h，分別在0、1、3、6、10、12h依次測(cè)定，記錄峰面積分別為4224.9、4223.4、4149.2、4107.5、4036.8、4022.4，結(jié)果rsd為2.13％(n＝6)。樣品溶液放置12h后，棉酚含量可達(dá)到95.2％，表明棉酚含量沒(méi)有顯著的減小，棉酚在酸化的乙腈/水溶液提取劑中沒(méi)有產(chǎn)生降解物。

加標(biāo)回收率測(cè)定

精確稱取6份已知棉酚含量的樣品100mg，分成2組，每組3個(gè)平行，每組分別加入棉酚標(biāo)準(zhǔn)品0.04mg、0.06mg、0.10mg進(jìn)行測(cè)定，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得加標(biāo)后濃度，進(jìn)而得到其含量值，按下式計(jì)算回收率，所得回收率為80.15％～113.00％，結(jié)果如表2所示。

加標(biāo)回收率(％)＝(樣液加標(biāo)后測(cè)定值-樣液測(cè)定值)/加標(biāo)量×100％。

表2

以上是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。