本發(fā)明涉及用于對(duì)生物體成分等中包含的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)進(jìn)行分析的、使用利用了酶反應(yīng)的電化學(xué)式生物傳感器的測(cè)定方法和測(cè)定裝置。

背景技術(shù)：

專利文獻(xiàn)1中記載了下述內(nèi)容：在電化學(xué)式生物傳感器的測(cè)定中，使用含有氧化還原酶、氧化劑、緩沖劑的電極，進(jìn)行至酶反應(yīng)實(shí)質(zhì)上結(jié)束的階段后，在電極與試樣之間施加電位并測(cè)定cottrell電流，基于該cottrell電流來測(cè)定物質(zhì)的濃度。該cottrell電流會(huì)受到物質(zhì)擴(kuò)散的影響，因而在反應(yīng)速率理論中公開了擴(kuò)散控速電流的計(jì)測(cè)。另一方面，在專利文獻(xiàn)2中公開了下述方法：檢測(cè)出基于電荷遷移過程、而不是基于物質(zhì)擴(kuò)散過程的電流，基于該電流測(cè)定物質(zhì)的濃度。由于能夠不受物質(zhì)擴(kuò)散的影響而進(jìn)行測(cè)定，因而與專利文獻(xiàn)1的方法相比，能夠以低成本進(jìn)行短時(shí)間的測(cè)定。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本專利第2901678號(hào)說明書

專利文獻(xiàn)2：wo2015/020149

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的課題

如上所述，在專利文獻(xiàn)2中，雖然不依賴于物質(zhì)擴(kuò)散地測(cè)定了電荷遷移控速電流，但測(cè)定電流值會(huì)受到酶活性和酶量的影響，因而傳感器間的測(cè)定值的偏差成為課題。

因此，本發(fā)明的課題在于提供一種方法和裝置，在利用電化學(xué)式生物傳感器的物質(zhì)測(cè)定中，能夠降低基于酶活性和酶量的傳感器間的測(cè)定值的偏差，能夠以良好的精度和簡(jiǎn)便的系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。

用于解決課題的手段

本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過進(jìn)行傳感器的自校準(zhǔn)，能夠降低傳感器間的測(cè)定值的偏差，能夠以良好的精度對(duì)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，由此完成了本發(fā)明。上述自校準(zhǔn)如下所述：對(duì)電極施加第一電位和第二電位，除了試樣中的物質(zhì)濃度的測(cè)定以外，還在傳感器中測(cè)定實(shí)際反映可有助于上述物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)和與電極之間的電子轉(zhuǎn)移的氧化還原酶的量或活性的信號(hào)，利用反映上述氧化還原酶的量或活性的信號(hào)對(duì)試樣中的物質(zhì)濃度的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正。

本發(fā)明的方法包括下述步驟：

將包含測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣導(dǎo)入到電化學(xué)測(cè)定池內(nèi)的步驟，該電化學(xué)測(cè)定池包含絕緣性基板和形成于該絕緣性基板上的電極系統(tǒng)，該電極系統(tǒng)包含2個(gè)以上的電極且至少1個(gè)電極包含氧化還原酶；

對(duì)電極系統(tǒng)施加第一電壓的第一電壓施加步驟；

對(duì)電極系統(tǒng)施加第二電壓的第二電壓施加步驟；

在上述第一電壓施加步驟中獲取第一信號(hào)的步驟，該第一信號(hào)取決于可有助于氧化還原反應(yīng)和與電極之間的電子轉(zhuǎn)移的上述氧化還原酶的量；

在上述第二電壓施加步驟中獲取第二信號(hào)的步驟，該第二信號(hào)取決于上述試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的量；和

利用上述第一信號(hào)對(duì)上述第二信號(hào)進(jìn)行校正，確定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的濃度的步驟。

此處，優(yōu)選的是，上述第一電壓為上述氧化還原酶的還原電位以下的電壓，上述第二電壓為上述氧化還原酶的氧化電位以上的電壓。

另外，優(yōu)選的是，使用預(yù)先按第二信號(hào)的每個(gè)水平區(qū)域制作的上述第一信號(hào)和上述第二信號(hào)的校正曲線，由上述第一信號(hào)的測(cè)定值與該校正曲線的背離度計(jì)算出校正系數(shù)，利用上述校正系數(shù)對(duì)上述第二信號(hào)的測(cè)定值進(jìn)行校正，基于校正后的第二信號(hào)的值來確定物質(zhì)濃度。

上述第二信號(hào)優(yōu)選為電荷遷移控速電流，電荷遷移控速電流優(yōu)選為通過雙電層的充電產(chǎn)生瞬態(tài)電流后的穩(wěn)態(tài)電流，更優(yōu)選由下式(2)表示。

另外，優(yōu)選的是，氧化還原酶包含吡咯并喹啉醌或黃素腺嘌呤二核苷酸、或者具有包含血紅素的亞單元或結(jié)構(gòu)域。

更具體而言，優(yōu)選的是，上述氧化還原酶為具有葡萄糖氧化活性的酶、例如葡萄糖脫氫酶，測(cè)定對(duì)象物質(zhì)為葡萄糖。

本發(fā)明的裝置由下述部件構(gòu)成：

生物傳感器，包含電化學(xué)測(cè)定池，該電化學(xué)測(cè)定池包含絕緣性基板和形成于該絕緣性基板上的電極系統(tǒng)，該電極系統(tǒng)包含2個(gè)以上的電極且至少1個(gè)電極包含氧化還原酶；

控制部，控制向生物傳感器進(jìn)行的第一電壓施加和第二電壓施加；

檢測(cè)部，檢測(cè)通過向生物傳感器進(jìn)行的第一電壓施加和第二電壓施加而得到的第一信號(hào)和第二信號(hào)；

運(yùn)算部，利用上述第一信號(hào)對(duì)上述第二信號(hào)進(jìn)行校正，確定試樣中包含的物質(zhì)的濃度；和

輸出部，輸出上述計(jì)算出的上述物質(zhì)的濃度。

測(cè)定裝置中，優(yōu)選的是，測(cè)定對(duì)象物質(zhì)為葡萄糖，氧化還原酶為具有葡萄糖氧化活性的酶、例如葡萄糖脫氫酶。

發(fā)明的效果

根據(jù)本發(fā)明，在利用電化學(xué)式生物傳感器的物質(zhì)測(cè)定中，酶活性和酶量的影響得到改善，能夠抑制傳感器間的測(cè)定值的偏差。迄今為止，生物傳感器的校準(zhǔn)通常是按照傳感器的每個(gè)制造批次進(jìn)行的，但根據(jù)本發(fā)明，能夠進(jìn)行各個(gè)傳感器的校準(zhǔn)，有助于進(jìn)一步提高測(cè)定精度。

附圖說明

圖1是示出本發(fā)明的生物傳感器的結(jié)構(gòu)的一個(gè)方式的圖。(a)表示整體立體圖，(b)表示分解立體圖。

圖2是示出對(duì)2個(gè)以上的傳感器施加還原電位并進(jìn)行還原電流的測(cè)定的結(jié)果的圖。試樣使用了包含600mg/dl的葡萄糖的全血樣品。

圖3是示出對(duì)2個(gè)以上的傳感器施加氧化電位并進(jìn)行計(jì)時(shí)安培分析法測(cè)定的結(jié)果的圖。試樣使用了包含600mg/dl的葡萄糖的全血樣品。

圖4是對(duì)在各傳感器中使用包含600mg/dl的葡萄糖的全血樣品進(jìn)行測(cè)定時(shí)的還原電流的測(cè)定值和氧化電流的測(cè)定值進(jìn)行作圖而得到的圖。

圖5是對(duì)使用包含134mg/dl或600mg/dl的葡萄糖的全血樣品對(duì)各傳感器進(jìn)行測(cè)定時(shí)的校正前與校正后的葡萄糖濃度測(cè)定值進(jìn)行作圖而得到的圖。

圖6是示出本發(fā)明的測(cè)定裝置的一個(gè)方式的示意圖。

圖7是示出使用本發(fā)明的測(cè)定裝置的測(cè)定程序的一個(gè)方式的流程圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明，但以下舉出的實(shí)施方式分別為例示，本發(fā)明并不限于以下的實(shí)施方式。

本發(fā)明的使用生物傳感器的物質(zhì)測(cè)定方法包括下述步驟：

將包含測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣導(dǎo)入到電化學(xué)測(cè)定池內(nèi)的步驟，該電化學(xué)測(cè)定池包含絕緣性基板和形成于該絕緣性基板上的電極系統(tǒng)，該電極系統(tǒng)包含2個(gè)以上的電極且至少1個(gè)電極包含氧化還原酶；

對(duì)電極系統(tǒng)施加第一電壓的第一電壓施加步驟；

對(duì)電極系統(tǒng)施加第二電壓的第二電壓施加步驟；

在上述第一電壓施加步驟中獲取第一信號(hào)的步驟，該第一信號(hào)取決于可有助于氧化還原反應(yīng)和與電極之間的電子轉(zhuǎn)移的上述氧化還原酶的量；

在上述第二電壓施加步驟中獲取第二信號(hào)的步驟，該第二信號(hào)取決于上述試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的量；和

利用上述第一信號(hào)對(duì)上述第二信號(hào)進(jìn)行校正，確定試樣中包含的物質(zhì)的濃度的步驟。

此處，作為測(cè)定對(duì)象物質(zhì)，只要是可通過使用本發(fā)明的生物傳感器的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定的物質(zhì)就沒有特別限制，優(yōu)選為來源于生物體且可作為疾病或健康狀態(tài)的指標(biāo)的物質(zhì)，例如可以舉出葡萄糖、膽固醇、乳酸等。

試樣只要是包含測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣就沒有特別限制，優(yōu)選為生物體試樣，可以舉出血液、尿等。

下面對(duì)可在本發(fā)明的測(cè)定方法中使用的電化學(xué)式生物傳感器的電化學(xué)測(cè)定池的構(gòu)成要素進(jìn)行說明。

<工作電極>

工作電極例如可通過在絕緣性基板上配置電極材料、在所得到的電極的附近配置至少包含氧化還原酶的試劑層而得到。

電極例如使用碳之類的碳材料來形成?；蛘咭部梢允褂媒?au)、鉑(pt)、銀(ag)、鈀(pd)、釕(ru)之類的金屬材料。

絕緣性基板例如由聚醚酰亞胺(pei)、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚乙烯(pe)之類的熱塑性樹脂、聚酰亞胺樹脂、環(huán)氧樹脂之類的各種樹脂(塑料)、玻璃、陶瓷、紙之類的絕緣性材料來形成。

電極和絕緣性基板的尺寸、厚度可以適當(dāng)設(shè)定。

<氧化還原酶>

氧化還原酶只要是可將測(cè)定對(duì)象物質(zhì)氧化還原的酶即可，可以包含吡咯并喹啉醌(pqq)、黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)中的至少一者作為催化亞單元和催化結(jié)構(gòu)域。例如，作為包含pqq的氧化還原酶，可以舉出pqq葡萄糖脫氫酶(pqqgdh)；作為包含fad的氧化還原酶，可以舉出具有包含fad的α亞單元的細(xì)胞色素葡萄糖脫氫酶(cygdh)、葡萄糖氧化酶(god)。

另外，氧化還原酶可以包含電子傳遞亞單元或電子傳遞結(jié)構(gòu)域。作為電子傳遞亞單元，例如可以舉出具有擁有電子轉(zhuǎn)移功能的血紅素的亞單元。作為包含該具有血紅素的亞單元的氧化還原酶，可以舉出包含細(xì)胞色素的氧化還原酶，例如可以應(yīng)用葡萄糖脫氫酶、pqqgdh與細(xì)胞色素的融合蛋白。

另外，作為包含電子傳遞結(jié)構(gòu)域的酶，可以舉出膽固醇氧化酶、吡咯并喹啉醌乙醇脫氫酶(qhedh(pqq乙醇脫氫酶)。此外，電子傳遞結(jié)構(gòu)域優(yōu)選應(yīng)用包含具有擁有電子轉(zhuǎn)移功能的血紅素的細(xì)胞色素的結(jié)構(gòu)域。例如可以舉出“qhgdh”(融合酶；帶有qhgdh的血紅蛋白結(jié)構(gòu)域的gdh))、山梨糖醇脫氫酶(sorbitoldh)、d-果糖脫氫酶(fructosedh)、根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefasience)來源的葡萄糖-3-脫氫酶(glucose-3-dehydrogenase)(來自根癌農(nóng)桿菌的g3dh)、纖維二糖脫氫酶、乳酸脫氫酶。需要說明的是，作為上述包含細(xì)胞色素的亞單元的例示的pqqgdh與細(xì)胞色素的融合蛋白以及作為包含細(xì)胞色素的結(jié)構(gòu)域的例示的pqqgdh的細(xì)胞色素結(jié)構(gòu)域例如在國(guó)際公開wo2005/030807號(hào)公報(bào)中有公開。

另外，氧化還原酶優(yōu)選應(yīng)用至少由催化亞單元和包含具有擁有電子受體功能的血紅素的細(xì)胞色素的亞單元構(gòu)成的低聚物酶。

需要說明的是，測(cè)定對(duì)象物質(zhì)只要為氧化還原酶的底物即可。例如，纖維二糖脫氫酶氧化纖維二糖，但也氧化葡萄糖，因而也可使用葡萄糖作為測(cè)定對(duì)象物質(zhì)。

為了測(cè)定后述的電荷遷移控速電流，優(yōu)選使工作電極為“直接電子遷移型的酶電極”。此處，“直接電子遷移型的酶電極”是指下述類型的酶電極：在試劑層中通過酶反應(yīng)產(chǎn)生的電子在沒有電子傳遞介體之類的氧化還原物質(zhì)參與的情況下直接被傳遞至電極，由此進(jìn)行酶與電極間的電子轉(zhuǎn)移。

需要說明的是，在生理學(xué)的反應(yīng)體系中，產(chǎn)生直接電子遷移的極限距離據(jù)稱為1nm～2nm。因此，按照從酶向電極的電子遷移不會(huì)受損的方式配置酶很重要。

為了測(cè)定電荷遷移控速電流，在電極的附近配置氧化還原酶很重要，作為用于該配置的方法沒有特別限制，例如可以舉出將氧化還原酶以化學(xué)方法固定化至電極上的方法、使用粘結(jié)劑等將氧化還原酶間接固定化至電極上的方法、使氧化還原酶物理吸附至電極上的方法等。

工作電極上的酶試劑層可以包含導(dǎo)電性顆粒。通過包含導(dǎo)電性顆粒，可期待電子向電極更為適宜的傳遞。具體而言，導(dǎo)電性顆?？梢詰?yīng)用金、鉑、銀、鈀之類的金屬制顆粒、或者以碳為材料的高級(jí)結(jié)構(gòu)體。高級(jí)結(jié)構(gòu)體可以包含例如導(dǎo)電性炭黑、碳納米管(cnt)、富勒烯之類的碳顆?；蛱嘉⒘?。作為導(dǎo)電性炭黑，可以舉出科琴黑(degussa制造)、blackpearl(cabot)等等。

工作電極上的酶試劑層可以還包含導(dǎo)電性高分子。作為導(dǎo)電性高分子，優(yōu)選為水溶性的高分子，可以舉出聚苯胺、聚亞乙基二氧噻吩等，作為代表例，可以舉出三菱麗陽制造的磺化聚苯胺水溶液(商品名aquapass)。

工作電極上的酶試劑層可以還包含粘結(jié)劑。作為粘結(jié)劑，優(yōu)選水溶性粘結(jié)劑，具體而言，可以舉出含有噁唑啉基的水溶性聚合物等。

上述這樣的工作電極例如如下制作。即，在絕緣性基板的單面上形成作為電極發(fā)揮功能的碳層。例如，可以在規(guī)定厚度(例如100μm左右)的膜狀絕緣性基板的單面上進(jìn)行碳油墨的絲網(wǎng)印刷，形成具有期望厚度(例如10μm左右)的碳膜。代替碳層，也可以通過利用物理蒸鍍(pvd，例如濺射)或化學(xué)蒸鍍(cvd)將金屬材料成膜而形成具有期望厚度(例如30nm左右)的金屬層。

接著，在電極上形成酶試劑層。首先制備包含氧化還原酶和導(dǎo)電性顆粒或?qū)щ娦愿叻肿拥娜芤?，將該溶液滴加到電極的表面。該溶液在電極上通過干燥而固化，由此能夠得到在電極上形成有酶試劑層的工作電極。

本發(fā)明中使用的生物傳感器的電極系統(tǒng)除了上述工作電極之外還包含反電極。作為反電極，只要是作為生物傳感器的反電極而通常使用的電極即可，例如可以使用通過絲網(wǎng)印刷進(jìn)行成膜的碳電極、通過物理蒸鍍(pvd，例如濺射)或化學(xué)蒸鍍(cvd)進(jìn)行成膜的金屬電極、通過絲網(wǎng)印刷進(jìn)行成膜的銀/氯化銀電極。另外，本發(fā)明中使用的生物傳感器的電極系統(tǒng)也可以為進(jìn)一步將銀/氯化銀電極作為參比電極的三電極系統(tǒng)。

(試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定方法)

在本發(fā)明的使用生物傳感器的物質(zhì)測(cè)定方法中，將包含物質(zhì)的試樣導(dǎo)入到電化學(xué)測(cè)定池內(nèi)后，對(duì)電極系統(tǒng)施加第一電壓和第二電壓，獲取第一信號(hào)和第二信號(hào)。

此處，第一電壓優(yōu)選為工作電極中使用的氧化還原酶的還原電位以下的電壓。通過施加氧化還原酶的還原電位以下的電壓，能夠得到不取決于試樣中的物質(zhì)濃度而取決于可有助于氧化還原反應(yīng)和與電極之間的電子轉(zhuǎn)移的氧化還原酶的量的第一信號(hào)、即第一電流值(還原電流值)。

另一方面，第二電壓優(yōu)選為工作電極中使用的氧化還原酶的氧化電位以上的電壓。通過施加氧化還原酶的氧化電位以上的電壓，能夠得到取決于試樣中的物質(zhì)濃度的第二信號(hào)、即第二電流值(氧化電流值)。

所使用的酶的氧化電位、還原電位可以利用公知的方法來調(diào)查。例如，為了掌握酶的電子傳遞部位的還原電位，可以利用循環(huán)伏安法等已知的分析方法進(jìn)行確認(rèn)。

舉例來說，在氧化還原酶為cygdh的情況下，作為第一電壓，可以設(shè)定為-0.01、-0.03、-0.05、-0.08或-0.10v～-0.20、-0.25、-0.30、-0.35或-0.40v的范圍，優(yōu)選為-0.01～-0.4v，進(jìn)一步更優(yōu)選為-0.1～-0.2v，作為第二電壓，可以設(shè)定為0.01、0.02、0.03、0.04或0.05v～0.40、0.50、0.60、0.70或0.80v的范圍，優(yōu)選為0.01～0.8v，進(jìn)一步更優(yōu)選為0.05～0.4v。

取決于試樣中的物質(zhì)濃度的第二信號(hào)的種類沒有特別限制，優(yōu)選基于來源于測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的電子向電極的遷移而產(chǎn)生的電荷遷移控速電流。此處，基于來源于測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的電子向電極的遷移而產(chǎn)生的電荷遷移控速電流是指，通過氧化還原酶與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的反應(yīng)而使電子由該酶向電極遷移時(shí)產(chǎn)生的電流，其是不取決于時(shí)間的穩(wěn)態(tài)電流，優(yōu)選為通過雙電層的充電產(chǎn)生瞬態(tài)電流后的穩(wěn)態(tài)電流。

該電荷遷移控速電流優(yōu)選由下述式(1)表示。由該式可知，電流與底物的濃度和酶反應(yīng)速率常數(shù)成比例，設(shè)常數(shù)項(xiàng)為x時(shí)，可展開成式(2)。需要說明的是，盡管式(1)、(2)中未示出，但常數(shù)項(xiàng)x中也可以包含校正系數(shù)等。

【數(shù)1】

i：電流(a)、

n：反應(yīng)電子數(shù)(eq/mol)、

f：法拉第常數(shù)(96,485c/eq)、

a：電極面積(cm²)、

c⁰s：底物(s)的濃度(mol/cm³)、

τe：酶量(mol)、

kcat/km：酶反應(yīng)速率常數(shù)

【數(shù)2】

需要說明的是，電極系統(tǒng)為電荷遷移控速這一點(diǎn)可通過利用循環(huán)伏安法等調(diào)查峰的有無或基于電壓掃描方向的電流的增加趨勢(shì)來確認(rèn)。

向工作電極進(jìn)行的第一電壓的施加與第二電壓的施加可以連續(xù)進(jìn)行，但優(yōu)選按時(shí)間差來進(jìn)行，例如可以例示在第一電壓的施加后隔開3～10秒的間隔、之后施加第二電壓的方式。向電極施加電壓的方式?jīng)]有特別限制，為了高效地測(cè)定電荷遷移控速電流，優(yōu)選階躍施加。

另外，第一信號(hào)的測(cè)定優(yōu)選在第一電壓施加后1～5秒后進(jìn)行，第二信號(hào)的測(cè)定優(yōu)選在第二電壓施加后3～60秒進(jìn)行。

需要說明的是，向工作電極進(jìn)行的第一電壓的施加和第二電壓的施加、以及基于此的第一信號(hào)和第二信號(hào)的測(cè)定也可以完全獨(dú)立地進(jìn)行。例如，如下所述，由于第一信號(hào)的值不取決于試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的量，因而可以在不存在包含測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣的狀態(tài)下先進(jìn)行第一電壓的施加和第一信號(hào)的測(cè)定，之后在存在包含測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的試樣的狀態(tài)下進(jìn)行第二電壓的施加和第二信號(hào)的測(cè)定。

第二信號(hào)的值取決于試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的量，但也取決于可有助于氧化還原反應(yīng)和與電極之間的電子轉(zhuǎn)移的氧化還原酶的量。另一方面，第一信號(hào)的值取決于上述氧化還原酶的量，但不取決于試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的量。因此，若利用第一信號(hào)的值對(duì)第二信號(hào)的值進(jìn)行校正，則能夠不受氧化還原酶的活性和酶量的影響地測(cè)定試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的量。

更具體而言，對(duì)電極系統(tǒng)施加氧化還原酶的還原電位以下的恒壓時(shí)的電流值(第一信號(hào)：還原電流值)與上述氧化還原酶的量具有正的相關(guān)關(guān)系(比例關(guān)系)。因此，預(yù)先由還原電流值可知測(cè)定中所用的酶電極的相對(duì)酶量(相對(duì)總活性)。

另一方面，通過對(duì)電極系統(tǒng)施加氧化還原酶的氧化電位以上的恒壓，有與測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的濃度成比例的電流流通，因而由其電流值(第二信號(hào)：氧化電流值)可知葡萄糖等測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的濃度的值(臨時(shí)值)。

需要說明的是，在電荷遷移控速電流的情況下，測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的濃度(臨時(shí)值)可以基于上述式(1)由測(cè)定電流值來算出。另外，也可以使用濃度已知的試樣預(yù)先制作校正曲線，基于該校正曲線由測(cè)定電流值來算出。另外，也可以通過將由試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的校正系數(shù)與式(1)相乘等來算出被測(cè)物的濃度。這種情況下，式(2)的常數(shù)項(xiàng)x中還包含校正系數(shù)。

并且，若預(yù)先求出基于測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的氧化電流值與基于上述酶量的還原電流值的關(guān)系，則通過利用還原電流值進(jìn)行校正，能夠測(cè)定葡萄糖等測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的準(zhǔn)確濃度。

需要說明的是，可以預(yù)先由氧化電流值求出測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的濃度(臨時(shí)值)，利用還原電流值對(duì)其進(jìn)行校正，從而求出測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的濃度(校正后)；也可以利用還原電流值對(duì)氧化電流值進(jìn)行校正，基于氧化電流值(校正后)求出測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的濃度(校正后)。

根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定方法，可進(jìn)行連續(xù)測(cè)定和斷續(xù)測(cè)定中的任一種測(cè)定。在連續(xù)測(cè)定的情況下，若先求出還原電流值，則可以基于該值連續(xù)地對(duì)測(cè)定值進(jìn)行校正，不需要每次都求出還原電流值。

(試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定裝置)

接著，使用附圖對(duì)本發(fā)明的測(cè)定裝置2進(jìn)行說明。此處，對(duì)使用葡萄糖傳感器作為生物傳感器的葡萄糖測(cè)定裝置進(jìn)行了例示，但本發(fā)明的測(cè)定裝置并不限于以下的方式。

本發(fā)明的測(cè)定裝置由下述部件構(gòu)成：

上述生物傳感器；

控制部，控制向生物傳感器進(jìn)行的第一電壓施加和第二電壓施加；

檢測(cè)部，檢測(cè)通過向生物傳感器進(jìn)行的第一電壓施加和第二電壓施加而得到的第一信號(hào)和第二信號(hào)；

運(yùn)算部，利用上述第一信號(hào)對(duì)上述第二信號(hào)進(jìn)行校正，確定試樣中包含的物質(zhì)的濃度；和

輸出部，輸出上述計(jì)算出的上述物質(zhì)的濃度。

圖6示出了容納在測(cè)定裝置2內(nèi)的主要電子部件的構(gòu)成例?？刂朴?jì)算機(jī)3、恒電位儀3a、電力供給裝置21被設(shè)置在容納于殼體內(nèi)的基板3a上。

控制計(jì)算機(jī)3從硬件來說包含cpu(中央運(yùn)算處理裝置)之類的處理器、存儲(chǔ)器(ram(randomaccessmemory，隨機(jī)存取存儲(chǔ)器)、rom(readonlymemory，只讀存儲(chǔ)器))之類的記錄介質(zhì)和通信單元，處理器將記錄介質(zhì)(例如rom)中存儲(chǔ)的程序加載至ram并運(yùn)行，由此，作為具備輸出部20、控制部22、運(yùn)算部23和檢測(cè)部24的裝置發(fā)揮功能。需要說明的是，控制計(jì)算機(jī)3也可以包含半導(dǎo)體存儲(chǔ)器(eeprom，閃存)或硬盤之類的輔助存儲(chǔ)裝置。

控制部22對(duì)電壓施加的時(shí)機(jī)、施加電壓值等進(jìn)行控制。

電力供給裝置21具有電池26，向控制部計(jì)算機(jī)3和恒電位儀3a供給工作用的電力。需要說明的是，電力供給裝置21也可以設(shè)置在殼體的外部。

恒電位儀3a是使工作電極的電位相對(duì)于參比電極保持恒定的裝置，由控制部22進(jìn)行控制，使用端子cr、w在葡萄糖傳感器(酶電極)4的反電極(參比電極)和工作電極之間施加規(guī)定的電壓(第一電壓和第二電壓)，對(duì)在端子w中得到的工作電極的響應(yīng)電流(第一電流和第二電流)進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)定結(jié)果送到檢測(cè)部24。

運(yùn)算部23利用第一電流值對(duì)在葡萄糖傳感器中檢測(cè)出的第二電流值進(jìn)行校正，基于校正后的第二電流值計(jì)算出葡萄糖的濃度，并存儲(chǔ)所得到的值。需要說明的是，也可以先進(jìn)行用于由第二電流值求出葡萄糖的濃度(臨時(shí)值)的運(yùn)算，之后利用第一電流值對(duì)葡萄糖的濃度(臨時(shí)值)進(jìn)行校正。輸出部20與顯示部單元25之間進(jìn)行數(shù)據(jù)通信，將由運(yùn)算部23得到的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的濃度的運(yùn)算結(jié)果發(fā)送到顯示部單元25。顯示部單元25例如可以將由測(cè)定裝置2接收到的葡萄糖濃度的運(yùn)算結(jié)果以規(guī)定格式顯示在顯示屏幕上。

圖7是示出利用控制計(jì)算機(jī)3進(jìn)行的葡萄糖濃度測(cè)定處理的示例的流程圖?？刂朴?jì)算機(jī)3的cpu(控制部22)受理葡萄糖濃度測(cè)定的開始指示時(shí)，控制部22控制恒電位儀3a，對(duì)葡萄糖傳感器施加規(guī)定的電壓(第一電壓和第二電壓)，分別開始響應(yīng)電流(第一電流和第二電流)的測(cè)定(步驟s01)。需要說明的是，也可以將檢測(cè)到傳感器向測(cè)定裝置上的安裝作為濃度測(cè)定開始指示。

接著，恒電位儀3a測(cè)定通過電壓施加得到的響應(yīng)電流、即第一電流和第二電流，并送到檢測(cè)部24(步驟s02)。

運(yùn)算部23首先利用第一電流值對(duì)第二電流值進(jìn)行校正(步驟s03)。例如，控制計(jì)算機(jī)3的運(yùn)算部23預(yù)先保存有表示第二電流值與第一電流值的關(guān)系的計(jì)算式或校正曲線數(shù)據(jù)，使用這些計(jì)算式或校正曲線對(duì)第二電流值進(jìn)行校正。

需要說明的是，上述表示第二電流值與第一電流值的關(guān)系的計(jì)算式或校正曲線數(shù)據(jù)優(yōu)選按各葡萄糖濃度區(qū)域來準(zhǔn)備。例如，在葡萄糖濃度為0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg/dl的各情況下準(zhǔn)備上述計(jì)算式或校正曲線數(shù)據(jù)，選擇與上述第二電流值最接近的校正曲線，對(duì)該校正曲線中的第一電流值的理論值和實(shí)測(cè)值相對(duì)于第二電流值的背離進(jìn)行評(píng)價(jià)，基于該背離度計(jì)算出校正系數(shù)，對(duì)第二電流值進(jìn)行校正。需要說明的是，用于準(zhǔn)備表示上述第二電流值與第一電流值的關(guān)系的計(jì)算式或校正曲線數(shù)據(jù)的葡萄糖濃度區(qū)域不限于上述情況，可以以每5mg/dl或每10mg/dl等的方式任意設(shè)定。

進(jìn)而，運(yùn)算部23基于上述校正后的第二電流值計(jì)算出葡萄糖濃度(步驟s04)。例如，控制計(jì)算機(jī)3的運(yùn)算部23預(yù)先保存有葡萄糖濃度的計(jì)算式或葡萄糖濃度的校正曲線數(shù)據(jù)，使用這些計(jì)算式或校正曲線計(jì)算出葡萄糖濃度。

需要說明的是，也可以先于步驟s03而進(jìn)行步驟s04。例如，可以先進(jìn)行用于由第二電流值求出葡萄糖的濃度(臨時(shí)值)的運(yùn)算，之后利用第一電流值對(duì)葡萄糖的濃度(臨時(shí)值)進(jìn)行校正。

輸出部20通過在其與顯示部單元25之間形成的通信鏈路將校正后的葡萄糖濃度的計(jì)算結(jié)果發(fā)送到顯示部單元25(步驟s05)。之后，控制部22對(duì)測(cè)定錯(cuò)誤的有無進(jìn)行檢測(cè)(步驟s06)，若沒有錯(cuò)誤則結(jié)束測(cè)定，將葡萄糖濃度顯示于顯示部。若有錯(cuò)誤，則在進(jìn)行錯(cuò)誤顯示后，結(jié)束基于圖7的流程的處理。

[實(shí)施例]

下面舉出實(shí)施例進(jìn)一步具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于下述實(shí)施例的方式。

下面使用葡萄糖傳感器對(duì)生物傳感器的實(shí)施例進(jìn)行說明。

<葡萄糖傳感器的制作方法>

將葡萄糖傳感器的結(jié)構(gòu)的一例示于圖1。

如圖1所示，葡萄糖傳感器1具有罩板10、隔板11和基板12。

在罩板10上設(shè)有孔部13，在隔板11上設(shè)有與孔部13連通并且前端開口部14a敞開的窄寬度的縫隙14。在罩板10和隔板11層疊于基板12的上表面12a的狀態(tài)下，利用縫隙14規(guī)定了毛細(xì)管15。該毛細(xì)管15藉由縫隙14的前端開口部14a和孔部13與外部連通。前端開口部14a構(gòu)成試樣液導(dǎo)入口15a，從該試樣液導(dǎo)入口15a供給的試樣液由于毛細(xì)管現(xiàn)象向著孔部13在毛細(xì)管15內(nèi)行進(jìn)。

在基板12的上表面12a上設(shè)有第1電極16、第2電極17和試劑層18。

第1電極和第2電極16、17作為整體在基板12的長(zhǎng)邊方向上延伸，它們的端部16a、17a在基板12的短邊方向上延伸。基板12的上表面12a按照第1電極和第2電極16、17的端部16a、16b、17a、17b露出的方式由絕緣膜19覆蓋。

試劑層18按照在第1電極和第2電極16、17的端部16a、17a間搭橋的方式設(shè)置。該試劑層18包含葡萄糖脫氫酶。

更具體而言，葡萄糖傳感器通過下述方法進(jìn)行制作。

<基底電極>

作為基底電極材料，使用導(dǎo)電性碳油墨(旭化學(xué)研究所制ftu系列)，利用絲網(wǎng)印刷方法將該油墨在聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯基材(東麗制e-22)(長(zhǎng)50mm、寬5mm、厚250μm)的一個(gè)表面上進(jìn)行圖案化印刷，形成二電極圖案。在一個(gè)電極上涂布銀-氯化銀油墨(bas公司制造)，在80℃下干燥20分鐘，形成銀-氯化銀電極，作為反電極。

接著，將絕緣性樹脂聚酯油墨(旭化學(xué)研究所制uvf系列)在上述電極上進(jìn)行絲網(wǎng)印刷。由電極圖案和絕緣圖案形成的電極面積分別設(shè)定為0.5mm²。

<酶試劑層的形成>

制備包含含有細(xì)胞色素的葡萄糖脫氫酶(cygdh)、導(dǎo)電性顆粒(炭黑：科琴黑kjb)、作為導(dǎo)電助劑的導(dǎo)電性高分子(聚苯胺)和粘結(jié)劑(含有噁唑啉基的水溶性聚合物)的酶試劑，在電極上滴加0.04μl，在100℃下干燥30分鐘，由此在電極上形成酶試劑層。酶試劑的最終濃度如下。

<酶試劑的配方>

·kjb：0.4wt％

·酶(cygdh)：7mg/ml

·磷酸鈉緩沖液：10mmph7

·粘結(jié)劑(含有噁唑啉基的水溶性聚合物eprcrosws-700、日本觸媒制造)5.0％(w/v)

·聚苯胺(aquapass、三菱麗陽制造)0.2％(w/v)

<毛細(xì)管形成>

利用下述方法形成毛細(xì)管。

在上述形成有酶試劑層的基底電極上粘貼雙面膠帶和親水性膜而形成毛細(xì)管，制成傳感器。

<葡萄糖的測(cè)定>

利用下述方法測(cè)定葡萄糖濃度。

(1)酶量測(cè)定(自校準(zhǔn)測(cè)定)

對(duì)電極系統(tǒng)施加從-0.14v至-0.2v的階躍電壓5秒鐘，檢測(cè)還原電流。取電壓施加后4秒鐘的值，作為酶的還原電流值。

(2)葡萄糖測(cè)定

在(1)結(jié)束后，設(shè)置5秒鐘的開路，之后對(duì)電極系統(tǒng)施加0.07v的電壓15秒鐘，檢測(cè)取決于葡萄糖濃度的氧化電流。將電壓施加后10秒鐘的值作為用于確定葡萄糖濃度的氧化電流值。

<結(jié)果>

對(duì)多個(gè)制造批次的傳感器添加包含600mg/dl葡萄糖的全血樣品，按照上述(1)、(2)施加還原電位、接著施加氧化電位，進(jìn)行還原電流和氧化電流的測(cè)定。將其結(jié)果示于圖2和圖3。需要說明的是，圖3中是省略了(1)的自校準(zhǔn)的測(cè)定結(jié)果的圖?？芍€原電流值和氧化電流值在各傳感器中存在偏差。

對(duì)于各傳感器，將還原電流和氧化電流的測(cè)定值進(jìn)行作圖，結(jié)果可知，如圖4所示，基于試樣中的物質(zhì)濃度的氧化電流與基于傳感器中的酶活性和酶量的還原電流具有相關(guān)關(guān)系，認(rèn)為通過利用還原電流的測(cè)定值對(duì)氧化電流的測(cè)定值進(jìn)行校正，能夠降低傳感器間的測(cè)定值的偏差。

因此，使用包含134mg/dl或600mg/dl的葡萄糖的全血樣品進(jìn)行還原電流和氧化電流的測(cè)定，計(jì)算出葡萄糖濃度。校正的過程如下。需要說明的是，表示還原電流值與氧化電流值的相關(guān)性的校正曲線分別制作了葡萄糖濃度為134mg/dl的校正曲線和葡萄糖濃度為600mg/dl的校正曲線。

(3)基于相對(duì)酶量的葡萄糖測(cè)定值的校正

(3-1)對(duì)各傳感器中計(jì)測(cè)的還原電流值和氧化電流值進(jìn)行作圖，制作出表示還原電流值與氧化電流值(10秒值)的相關(guān)性的校正曲線(例如圖4)。

(3-2)使用(3-1)中預(yù)先制作的表示還原電流值與氧化電流值的相關(guān)性的校正曲線，由還原電流的實(shí)測(cè)值與該校正曲線的背離度計(jì)算校正系數(shù)。

(3-3)將氧化電流的實(shí)測(cè)值乘以(3-2)中計(jì)算的校正系數(shù)，作為用于確定葡萄糖濃度的氧化電流值(校正后)，基于該值計(jì)算出葡萄糖濃度(校正后)。

對(duì)于將校正前和校正后的葡萄糖濃度測(cè)定值進(jìn)行作圖的自校準(zhǔn)測(cè)定對(duì)葡萄糖測(cè)定值的校正效果進(jìn)行了確認(rèn)，結(jié)果如圖5和表1所示，與無校正(自校準(zhǔn))的數(shù)據(jù)相比，確認(rèn)到同時(shí)再現(xiàn)性的提高，確認(rèn)到校正效果高。

【表1】

表1

c.v.(％)

由以上可知，能夠進(jìn)行下述自校準(zhǔn)：通過檢測(cè)酶的電子傳遞部位的還原電流，計(jì)算出起因于可有助于氧化還原反應(yīng)和與電極之間的電子轉(zhuǎn)移的酶量(酶活性)的校正系數(shù)，基于該校正系數(shù)對(duì)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正。

即，通過對(duì)作為氧化還原酶的電子傳遞部位的β亞單元的血紅素來源的還原反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出反映可有助于氧化還原反應(yīng)和與電極之間的電子轉(zhuǎn)移的酶量(酶活性)的校正系數(shù)。具體而言，以比血紅素的氧化還原電位更負(fù)的電位測(cè)定血紅素的還原反應(yīng)電流，捕捉傳感器間之差。由此，能夠掌握酶與電極材料的結(jié)合狀態(tài)，能夠掌握可有助于氧化還原反應(yīng)和與電極之間的電子轉(zhuǎn)移的酶量。之后，計(jì)算出自校準(zhǔn)結(jié)果與預(yù)先制作的自校準(zhǔn)校正曲線的背離，由此計(jì)算出校正系數(shù)，將其乘以葡萄糖的測(cè)定結(jié)果，由此能夠?qū)Ω鱾€(gè)傳感器進(jìn)行校正。另外，本自校準(zhǔn)的方法利用已知的方法掌握酶的氧化還原電位，因此也能夠適用于其它底物的測(cè)定。

此外，本校正方法還能夠適用于傳感器制造時(shí)的制造批次的評(píng)價(jià)。即，可以對(duì)在制造批次內(nèi)采樣的傳感器實(shí)施自校準(zhǔn)，由此對(duì)傳感器計(jì)算出每個(gè)制造批次的平均校正系數(shù)，作為批次校正系數(shù)的一部分。由此，即使不在每次使用傳感器進(jìn)行測(cè)定時(shí)實(shí)施自校準(zhǔn)，也能夠進(jìn)行簡(jiǎn)易的測(cè)定值的校正。

符號(hào)說明

1···葡萄糖傳感器

10···罩板

11···隔板

12···基板

13···孔部

14···縫隙

15···毛細(xì)管

16···第1電極

17···第2電極

18···試劑層

19···絕緣膜

2···測(cè)定裝置

20···輸出部

21···電力供給裝置

22···控制部

23···運(yùn)算部

24···檢測(cè)部

25···顯示部單元

26···電池

3···控制計(jì)算機(jī)

3a···恒電位儀

3a···基板

cr、w···端子

4···葡萄糖傳感器