本發(fā)明屬于醫(yī)學檢測領域，涉及一種集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片及該芯片的制備方法，還涉及應用該芯片進行乙肝表面抗原檢測的方法。

背景技術：

乙肝表面抗原(hbsag)檢測是臨床診斷乙型肝炎的一項重要指標，目前常用酶聯(lián)免疫法和羅氏電化學發(fā)光檢測系統(tǒng)對其進行檢測。酶聯(lián)免疫法操作繁瑣、無法進行定量檢測，不適用于實時快速檢測；而羅氏電化學發(fā)光檢測系統(tǒng)存在設備體積龐大、價格高昂的局限性，不適用于現(xiàn)場即時檢測和廣泛推廣使用。因此，急需一種檢測靈敏度高，同時操作簡單、檢測儀器便于攜帶的新型檢測方法。

紙質(zhì)微流控芯片(paper-basedmicrofluidicanalyticaldevices，μpads)是一種新興的微流控分析技術平臺，它以紙張作為基底材料，通過各種加工修飾方法，在紙上形成具有一定構(gòu)造的親/疏水微細通道網(wǎng)絡，并與相關的分析儀器共同組成“紙上微型實驗室”(labonpaper)，可應用于量小、復雜液體樣品的高效、快速檢測，具有操作簡便、儲存運輸方便、價格低廉、易于修飾等優(yōu)良特性，適用于臨床診斷及現(xiàn)場即時檢測。

紙質(zhì)微流控芯片的圖案通道形成方法有紫外光刻、噴墨打印、噴墨溶劑刻蝕、等離子體處理、繪圖、絲網(wǎng)印刷、柔印、激光處理、融蠟浸透及蠟打印等，其中蠟打印的方法最為簡便，適用于大規(guī)模的紙質(zhì)微流控芯片制造。紙質(zhì)微流控芯片的檢測方法有比色法、化學發(fā)光法、電化學法、熒光法等。kubota等人應用電化學法在紙芯片上進行維生素c和尿酸的檢測，但是該檢測技術靈敏度不高、特異性較差，不適用于免疫檢測。liuzhihong等人設計了基于熒光檢測的紙質(zhì)微流控芯片，但是熒光檢測需要外加光源，背景干擾較大，而且熒光試劑易發(fā)生淬滅。

電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ecl)是指直接利用電化學反應形成激發(fā)態(tài)發(fā)光體來發(fā)光或通過電解產(chǎn)物之間、電解產(chǎn)物與體系中某組分之間進行化學反應產(chǎn)生光輻射而實現(xiàn)分析物測定的發(fā)光分析技術，是電化學分析與化學發(fā)光分析相結(jié)合的產(chǎn)物。與其它檢測方法相比，電化學發(fā)光檢測以其自動、快速、特異性強、靈敏度高和線性檢測范圍寬等優(yōu)點展示出良好的應用前景。于京華課題組首次將電化學發(fā)光檢測與紙質(zhì)微流控芯片相結(jié)合，制備了基于電化學發(fā)光檢測的三維紙芯片，實現(xiàn)了腫瘤標志物的檢測，但其在實際應用方面還是存在一定局限性，該紙芯片紙通道的構(gòu)造較為簡單，仍需要手工進行樣品的分離、試劑的滴加、洗滌分離等步驟，操作繁瑣、耗時，不利于廣泛應用。

為提高檢測靈敏度、簡化操作流程，制備一種可用于臨床診斷和現(xiàn)場即時檢測的紙質(zhì)微流控芯片，本發(fā)明將電化學發(fā)光檢測技術與微流控技術相結(jié)合，制備了一種集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片。通過紙通道的優(yōu)化設計和各區(qū)抗體的固定，本發(fā)明將樣品前處理、混合、反應和檢測等步驟集成于一張紙質(zhì)微流控芯片，整個檢測過程只需加入樣品和清洗液，無需人工加入各種反應試劑，實現(xiàn)了全血樣品中乙肝表面抗原的分離、傳輸和檢測。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述技術問題，本發(fā)明的目的在于：提供一種功能豐富、檢測靈敏度高、使用簡單方便和成本低的，集樣品前處理、混合、反應和檢測于一體的，集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片。

本發(fā)明的第二目的在于：提供一種功能豐富、檢測靈敏度高、使用簡單方便和成本低的，集樣品前處理、混合、反應和檢測于一體的，集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片的制備方法。

本發(fā)明的第三目的在于：提供一種功能豐富、檢測靈敏度高、使用簡單方便和成本低的，集樣品前處理、混合、反應和檢測于一體的，用于乙肝表面抗原檢測的紙質(zhì)微流控芯片的實現(xiàn)方法。

本發(fā)明所采取的第一技術方案是：

一種集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片，包括自上而下分布的上密封層、紙通道層、電極層和下密封層，所述紙通道層集樣品前處理、混合、反應和檢測于一體。

進一步，所述紙通道層包括樣品區(qū)、側(cè)向免疫層析通道、抗體包埋區(qū)、檢測區(qū)和廢液區(qū)，所述樣品區(qū)上覆蓋有濾血膜，所述側(cè)向免疫層析通道的前端與樣品區(qū)連接，所述抗體包埋區(qū)位于側(cè)向免疫層析通道的近樣品區(qū)端，所述檢測區(qū)與側(cè)向免疫層析通道的末端連接，所述廢液區(qū)位于檢測區(qū)的末端和側(cè)向免疫層析通道兩側(cè)。

進一步，所述電極層包括工作電極、對電極和參比電極，所述工作電極、對電極和參比電極位于檢測區(qū)的下方并為檢測區(qū)提供電化學發(fā)光反應所需的電壓；所述上密封層設有正對著樣品區(qū)的加樣區(qū)和正對著檢測區(qū)的檢測口。

本發(fā)明所采取的第二技術方案是：

一種集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片的制備方法，包括以下步驟：

制備電極層；

在紙上制備紙通道層，并在抗體包埋區(qū)和檢測區(qū)固定抗體，以及在樣品區(qū)表面覆蓋濾血膜，以實現(xiàn)紙通道層的功能化；

采用熱壓技術制備自上而下包含上密封層、紙通道層、電極層和下密封層的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片。

進一步，所述制備電極層這一步驟采用了絲網(wǎng)印刷技術及超疏水膜修飾技術來制備電極層；所述在抗體包埋區(qū)和檢測區(qū)固定抗體這一步驟，分別采用了包埋的方法在抗體包埋區(qū)進行抗體包埋和自組裝的方法在檢測區(qū)進行抗體固定。

進一步，所述在紙上制備紙通道層這一步驟，其具體為：使用coreldrawx6軟件設計紙通道層結(jié)構(gòu)，然后以whatman1號層析紙作為基底材料，使用噴蠟打印機打印出紙通道。

本發(fā)明所采取的第三技術方案是：

應用集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片進行乙肝表面抗原檢測的方法，包括以下步驟：

將全血樣品滴加于紙質(zhì)微流控芯片的加樣區(qū)，通過濾血膜對滴入的全血樣品進行血細胞的過濾，得到分離血細胞后的樣品；

分離血細胞后的樣品在流動的過程中發(fā)生免疫反應，使得分離血細胞后的樣品中的乙肝表面抗原最終在檢測區(qū)形成雙抗體夾心復合物；

在加樣區(qū)加入三丙胺清洗液，使得三丙胺清洗液流經(jīng)檢測區(qū)時洗去未結(jié)合的抗體和蛋白，同時使得三丙胺作為共反應物參與電化學發(fā)光反應；

將紙質(zhì)微流控芯片置于電化學發(fā)光檢測儀中進行檢測，得到相應的乙肝表面抗原響應曲線，并根據(jù)乙肝表面抗原響應曲線和預先建立的乙肝表面抗原工作曲線計算全血樣品中乙肝表面抗原的濃度。

進一步，所述分離血細胞后的樣品在流動的過程中發(fā)生免疫反應，使得分離血細胞后的樣品中的乙肝表面抗原最終在檢測區(qū)形成雙抗體夾心復合物這一步驟，其包括：

分離血細胞后的樣品在毛細管作用力下沿側(cè)向免疫層析通道流動；

分離血細胞后的樣品在流經(jīng)三聯(lián)吡啶釕標記的乙肝表面抗體包埋區(qū)時，溶解包埋的乙肝表面抗體并在流動的過程中與之發(fā)生免疫反應，得到抗原-抗體復合物；

抗原-抗體復合物在流過檢測區(qū)時，被自組裝固定于檢測區(qū)的抗乙肝表面抗原捕獲抗體捕獲，形成雙抗體夾心復合物。

進一步，所述的三丙胺清洗液由磷酸鹽緩沖液、三丙胺、去垢劑和防腐劑組成，ph＝6.8。

進一步，所述的乙肝表面抗原響應曲線為反映電化學發(fā)光強度與時間關系的曲線，所述的乙肝表面抗原工作曲線是反映電化學發(fā)光強度的峰面積與乙肝表面抗原濃度關系的曲線，所述預先建立的乙肝表面抗原工作曲線所采用的線性擬合公式為：y＝2.95126+0.38073x，其中，y為發(fā)光強度的峰面積值以10為底時的對數(shù)值，x為乙肝表面抗原的濃度以10為底時的對數(shù)值。

本發(fā)明的芯片的有益效果是：包括自上而下分布的上密封層、紙通道層、電極層和下密封層，紙通道層集樣品前處理、混合、反應和檢測于一體，將樣品前處理、免疫反應和電化學發(fā)光檢測功能集成于一張紙芯片，功能更豐富，且能通過電化學發(fā)光法進行乙肝表面抗原定量檢測，檢測靈敏度高、使用簡單方便和成本低。

本發(fā)明的制備方法的有益效果是：包括制備電極層，在紙上制備紙通道層，并在抗體包埋區(qū)和檢測區(qū)固定抗體，以及在樣品區(qū)表面覆蓋濾血膜，采用熱壓技術制備自上而下包含上密封層、紙通道層、電極層和下密封層的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片的步驟，通過制備將樣品前處理、免疫反應和電化學發(fā)光檢測功能集成于一張紙芯片，功能更豐富，且能通過電化學發(fā)光法進行乙肝表面抗原定量檢測，檢測靈敏度高、使用簡單方便和成本低。

本發(fā)明的乙肝表面抗原檢測的方法的有益效果是：包括通過濾血膜對滴入的全血樣品進行血細胞的過濾，分離血細胞后的樣品在流動的過程中發(fā)生免疫反應，在加樣區(qū)加入三丙胺清洗液，以及置于電化學發(fā)光檢測儀中進行檢測的步驟，基于側(cè)向免疫層析和雙抗體夾心法原理，將樣品前處理、混合反應和檢測步驟集成于一張芯片上完成，實現(xiàn)了全血樣品中乙肝表面抗原h(huán)bsag的分離、傳輸和檢測，功能更豐富；包括置于電化學發(fā)光檢測儀中進行檢測的步驟，能通過電化學發(fā)光法定量檢測出全血樣品中乙肝表面抗原的濃度，檢測靈敏度高、使用簡單方便和成本低。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一種集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片的整體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明一種集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片的各層結(jié)構(gòu)的分解圖；

圖3為本發(fā)明一種集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片的制備方法的整體流程圖；

圖4為本發(fā)明應用集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片進行乙肝表面抗原檢測的方法的實現(xiàn)方法的整體流程圖；

圖5為本發(fā)明實施例一乙肝表面抗原響應曲線的示意圖；

圖6為本發(fā)明實施例一乙肝表面抗原工作曲線的兩種表示方式示意圖。

具體實施方式

參照圖1和圖2，一種集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片，包括自上而下分布的上密封層c、紙通道層b、電極層a和下密封層d，所述紙通道層b集樣品前處理、混合、反應和檢測于一體。

參照圖1和圖2，進一步作為優(yōu)選的實施方式，所述紙通道層b包括樣品區(qū)1、側(cè)向免疫層析通道2、抗體包埋區(qū)3、檢測區(qū)4和廢液區(qū)5，所述樣品區(qū)1上覆蓋有濾血膜6，所述側(cè)向免疫層析通道2的前端與樣品區(qū)1連接，所述抗體包埋區(qū)3位于側(cè)向免疫層析通道2的近樣品區(qū)端，所述檢測區(qū)4與側(cè)向免疫層析通道2的末端連接，所述廢液區(qū)5位于檢測區(qū)4的末端和側(cè)向免疫層析通道2兩側(cè)。

參照圖1和圖2，所述電極層a包括工作電極a1、對電極a2和參比電極a3，所述工作電極a1、對電極a2和參比電極a3位于檢測區(qū)4的下方并為檢測區(qū)4提供電化學發(fā)光反應的電壓；所述上密封層c設有正對著樣品區(qū)1的加樣區(qū)7和正對著檢測區(qū)4的檢測口8。

參照圖3，一種集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片的制備方法，包括以下步驟：

制備電極層；

在紙上制備紙通道層，并在抗體包埋區(qū)和檢測區(qū)固定抗體，以及在樣品區(qū)表面覆蓋濾血膜，以實現(xiàn)紙通道層的功能化；

采用熱壓技術制備自上而下包含上密封層、紙通道層、電極層和下密封層的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片。

進一步作為優(yōu)選的實施方式，所述制備電極層這一步驟采用了絲網(wǎng)印刷技術及超疏水膜修飾技術來制備電極層；所述在抗體包埋區(qū)和檢測區(qū)固定抗體這一步驟，分別采用了包埋的方法在抗體包埋區(qū)進行抗體包埋和自組裝的方法在檢測區(qū)進行抗體固定。

進一步作為優(yōu)選的實施方式，所述在紙上制備紙通道層這一步驟，其具體為：使用coreldrawx6軟件設計紙通道層結(jié)構(gòu)，然后以whatman1號層析紙作為基底材料，使用噴蠟打印機打印出紙通道。

參照圖4，應用集成化的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片進行乙肝表面抗原檢測的方法，包括以下步驟：

將全血樣品滴加于紙質(zhì)微流控芯片的加樣區(qū)，通過濾血膜對滴入的全血樣品進行血細胞的過濾，得到分離血細胞后的樣品；

分離血細胞后的樣品在流動的過程中發(fā)生免疫反應，使得分離血細胞后的樣品中的乙肝表面抗原最終在檢測區(qū)形成雙抗體夾心復合物；

在加樣區(qū)加入三丙胺清洗液，使得三丙胺清洗液流經(jīng)檢測區(qū)時洗去未結(jié)合的抗體和蛋白，同時使得三丙胺作為共反應物參與電化學發(fā)光反應；

將紙質(zhì)微流控芯片置于電化學發(fā)光檢測儀中進行檢測，得到相應的乙肝表面抗原響應曲線，并根據(jù)乙肝表面抗原響應曲線和預先建立的乙肝表面抗原工作曲線計算全血樣品中乙肝表面抗原的濃度。

進一步作為優(yōu)選的實施方式，所述分離血細胞后的樣品在流動的過程中發(fā)生免疫反應，使得分離血細胞后的樣品中的乙肝表面抗原最終在檢測區(qū)形成雙抗體夾心復合物這一步驟，其包括：

分離血細胞后的樣品在毛細管作用力下沿側(cè)向免疫層析通道流動；

分離血細胞后的樣品在流經(jīng)三聯(lián)吡啶釕標記的乙肝表面抗體包埋區(qū)時，溶解包埋的乙肝表面抗體并在流動的過程中與之發(fā)生免疫反應，得到抗原-抗體復合物；

抗原-抗體復合物在流過檢測區(qū)時，被自組裝固定于檢測區(qū)的抗乙肝表面抗原捕獲抗體捕獲，形成雙抗體夾心復合物。

進一步，所述的三丙胺清洗液由磷酸鹽緩沖液、三丙胺、去垢劑和防腐劑組成，ph＝6.8。

進一步作為優(yōu)選的實施方式，所述的乙肝表面抗原響應曲線為反映電化學發(fā)光強度與時間關系的曲線，所述的乙肝表面抗原工作曲線是反映電化學發(fā)光強度的峰面積與乙肝表面抗原濃度關系的曲線，所述預先建立的乙肝表面抗原工作曲線所采用的線性擬合公式為：y＝2.95126+0.38073x，其中，y為發(fā)光強度的峰面積值以10為底時的對數(shù)值，x為乙肝表面抗原的濃度以10為底時的對數(shù)值。

下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步解釋和說明。

實施例一

針對現(xiàn)有技術缺乏一種使用簡單方便、耗時短，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場快速檢測的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片來進行乙肝表面抗原檢測的問題，本發(fā)明提出了基于一種集成化電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片及其制備方法和應用該芯片來進行乙肝表面抗原檢測的方法，實現(xiàn)了將樣品前處理、混合、免疫反應和電化學發(fā)光檢測等步驟集成于一張紙質(zhì)微流控芯片的功能，并且具有檢測靈敏度高、使用簡單方便和成本低的特點。下面從紙質(zhì)微流控芯片的結(jié)構(gòu)與制備、乙肝表面抗原檢測方法和具體實施效果對本發(fā)明的實現(xiàn)原理和過程進行詳細說明：

(一)紙質(zhì)微流控芯片的結(jié)構(gòu)和制備

如圖2所示，該紙質(zhì)微流控芯片由電極層a、紙通道層b、上密封層c和下密封層d組成。

如圖2中a所示，電極層a包含工作電極a1、對電極a2和參比電極a3，用于提供電化學發(fā)光反應的電壓。電極層a采用絲網(wǎng)印刷技術及超疏水膜修飾技術制備，具體制備方法如下：使用coreldrawx6軟件設計如圖2中a所示的電極層；然后將設計好的電極印制在紙芯片上，印制時導電層和參比電極a3漿料均采用現(xiàn)有的導電銀漿，絕緣層漿料采用現(xiàn)有的絕緣漿并對其進行超疏水化處理，對電極a2漿料采用現(xiàn)有的導電碳漿，工作電極a1采用摻雜有納米顆粒的自行設計的導電碳漿。

如圖2中b所示，紙通道層b由樣品區(qū)1、側(cè)向免疫層析通道2、三聯(lián)吡啶釕ru(bpy)3²⁺標記的乙肝表面抗體包埋區(qū)3、檢測區(qū)4和廢液區(qū)5這五部分組成。紙通道層的具體制備方法如下：使用coreldrawx6軟件設計紙通道層結(jié)構(gòu)，然后以whatman1號層析紙作為基底材料，使用噴蠟打印機打印出如圖2中b所示的紙通道層(圖2中b的疏水區(qū)用黑色表示，親水區(qū)用白色表示)；接著，將完成打印的層析紙放置在125℃的加熱臺上加熱1min，使表面蠟層滲透到層析紙內(nèi)，并在樣品區(qū)1的表面覆蓋一層濾血膜6，以過濾血細胞，使得本發(fā)明可直接用于全血樣品的檢測而無需額外的血細胞分離過程。本發(fā)明側(cè)向免疫層析通道2的寬為2mm，長為35mm，可以延長層析的時間，實現(xiàn)抗原-抗體的充分結(jié)合。ru(bpy)3²⁺標記的乙肝表面抗體包埋于側(cè)向免疫層析通道2的近樣品區(qū)端，當樣品流經(jīng)該區(qū)域時，抗體迅速溶解并在層析過程中與乙肝表面抗原充分結(jié)合。抗乙肝表面抗原捕獲抗體通過自組裝技術(如分子交聯(lián)法等)穩(wěn)定固定于檢測區(qū)4，乙肝表面抗原-標記抗體復合物流經(jīng)該區(qū)時被捕獲抗體捕獲，由電極層a施加電壓后，在三丙胺的共同作用下，發(fā)生電化學發(fā)光反應。廢液區(qū)5位于檢測區(qū)4的末端和側(cè)向免疫層析通道2兩側(cè)，用于提供液體在紙表面層析的驅(qū)動力同時儲存廢液。

上密封層c和下密封層d，用于有效減少樣品和試劑的蒸發(fā)、防止污染。如圖2中c所示，上密封層c采用透明密封材料的蓋片，留有為樣品區(qū)1添加樣品的加樣區(qū)7以及用于進行觀察和電化學發(fā)光檢測的檢測口8。如圖2中d所示，下密封層d以透明密封材料的襯底片作為密封層。

(二)乙肝表面抗原的檢測方法

本發(fā)明基于側(cè)向免疫層析原理，應用雙抗體夾心法，通過三聯(lián)吡啶釕-三丙胺(即ru(bpy)3²⁺-tpa)電化學發(fā)光法來檢測全血樣品9中的乙肝表面抗原濃度。參照圖1、2和4，本發(fā)明檢測乙肝表面抗原的具體過程為：首先將100微升全血樣品9滴入紙質(zhì)微流控芯片的加樣區(qū)7；然后通過濾血膜6對滴入的全血樣品9進行過濾；接著，經(jīng)濾血膜6分離血細胞后的樣品在毛細管作用力下沿側(cè)向免疫層析通道2流動；當分離血細胞后的樣品流經(jīng)ru(bpy)3²⁺標記的乙肝表面抗體包埋區(qū)3時，ru(bpy)3²⁺標記的乙肝表面抗體迅速溶解并與樣品中的乙肝表面抗原發(fā)生免疫反應，結(jié)合形成抗原-抗體復合物；抗原-抗體復合物沿著紙通道水平方向(即圖1中的水平箭頭方向)進行側(cè)向移動；抗原-抗體復合物移動至檢測區(qū)4時，被預先通過自組裝固定于該區(qū)的抗乙肝表面抗原捕獲抗體捕獲形成雙抗體夾心復合物；反應12min后，在加樣區(qū)7加入200微升三丙胺清洗液(該三丙胺清洗液由磷酸鹽緩沖液、三丙胺、去垢劑和防腐劑組成，ph＝6.8，例如采用磷酸鹽緩沖液300mmol/l、三丙胺180mmol/l和去垢劑≦0.1％制成的三丙胺清洗液)，充分洗滌；3min后，將紙質(zhì)微流控芯片置于電化學發(fā)光檢測儀中進行檢測(紙質(zhì)微流控芯片的檢測區(qū)4需置于光電倍增管的檢測范圍內(nèi))；然后采用origin6.0軟件對通過光電倍增管得到的峰型圖進行分析并計算峰面積，最后根據(jù)預先建立的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片檢測乙肝表面抗原的工作曲線計算樣品中乙肝表面抗原h(huán)bsag的濃度。電化學發(fā)光反應過程的發(fā)光強度的峰面積與三聯(lián)吡啶釕的濃度呈線性關系，故通過光電倍增管檢測出光強度后，即可通過建模和曲線擬合法測出全血樣品中乙肝表面抗原的濃度。

(三)具體實施效果

應用(一)的芯片和(二)的方法進行乙肝表面抗原檢測，可得到如圖5所示的乙肝表面抗原響應曲線，其中，應用電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片檢測乙肝表面抗原的最小檢測限為0.020ng/ml。從圖5可知，對于0.2025ng/ml陽性樣品的乙肝表面抗原來說，其峰高值為1450，噪聲值為50；而對于陰性樣品來說，其一直穩(wěn)定在100附近即峰高值為100，噪聲值為50。故可以根據(jù)峰高值的大小來區(qū)分陽性樣品和陰性樣品。

電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片檢測乙肝表面抗原工作曲線則分別如圖6(a)和圖6(b)所示。其中，圖6(a)是反映電化學發(fā)光強度峰面積的對數(shù)值與乙肝表面抗原濃度關系的曲線。而圖6(b)則反映了電化學發(fā)光強度峰面積的對數(shù)值y與乙肝表面抗原濃度的對數(shù)值x間呈良好的線性關系：y＝2.95126+0.38073x，r²＝0.99157。

而應用本發(fā)明的電化學發(fā)光紙質(zhì)微流控芯片對同一乙肝表面抗原陽性樣品進行了八次重復檢測，其cv值(標準差與均值的比率，反映了單位均值上的離散程度)如下表1所示：

表1hbsag檢測重復性實驗結(jié)果

本實施例具有以下優(yōu)點：

(1)本實施例設計并制備了可用于電化學發(fā)光法檢測乙肝表面抗原的紙質(zhì)微流控芯片，該芯片以紙質(zhì)為基底，綜合采用了蠟打印技術、抗體定區(qū)固定技術和微流控技術，將樣品前處理、混合、反應和檢測等步驟集成于一張紙質(zhì)微流控芯片，整個檢測過程只需加入樣品和清洗液，無需人工加入各種反應試劑，實現(xiàn)了全血樣品中乙肝表面抗原的分離、傳輸和檢測；該芯片還將電極層、紙通道層、密封層集成于一體，成本低廉、操作簡單、使用方便，可以實現(xiàn)現(xiàn)場實時快速檢測。

(2)本實施例通過電化學發(fā)光法進行乙肝表面抗原定量檢測，檢測靈敏度高，克服了傳統(tǒng)檢測方法靈敏度低、特異性差、定量不精確的局限性。

(3)本實施例的紙質(zhì)微流控芯片在樣品區(qū)的表面覆蓋了一層濾血膜，以過濾血細胞，使得本發(fā)明可直接用于全血樣品的檢測而無需額外的血細胞分離過程。

(4)本實施例的紙質(zhì)微流控芯片設計有上下密封層，可以有效減少樣品和試劑的蒸發(fā)、防止污染。

(5)本實施例建立了乙肝表面抗原工作曲線，經(jīng)過校準后可用于樣品中乙肝表面抗原的定量檢測。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明將樣品前處理、混合、反應和檢測等步驟集成在一張紙質(zhì)微流控芯片上，實現(xiàn)了全血樣品中乙肝表面抗原的分離、傳輸和檢測，只需加入全血樣品，15min后即可完成檢測，使用簡單方便；采用電化學發(fā)光法作為檢測手段，檢測靈敏度高，反應可控。

以上是對本發(fā)明的較佳實施進行了具體說明，但本發(fā)明并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明精神的前提下還可做作出種種的等同變形或替換，這些等同的變形或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。