本發(fā)明涉及一種普通小麥中維生素b6含量的高效液相色譜測定方法。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)鞘澜绲诙蠹Z食作物，在全球各地廣泛種植。我國是小麥生產(chǎn)和消費(fèi)量最大的國家，2016年小麥種植面積達(dá)到24186.5千公頃，總產(chǎn)量約為1.29億噸。隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展，消費(fèi)者的生活需求正在發(fā)生變化，小麥營養(yǎng)品質(zhì)備受關(guān)注。b族維生素是維持人體生命活動(dòng)必需的一類有機(jī)物質(zhì)，特別是維生素b6與心血管疾病和老年癡呆疾病緊密相關(guān)，其也是人體免疫系統(tǒng)、脂肪酸代謝、基因表達(dá)、激素調(diào)控及煙酰胺形成的重要調(diào)控因子。由于人類和動(dòng)物自身不能合成維生素b，必須從外界攝取，而谷類食物既富含維生素b族成分又是人們重要的日常食物來源，因此準(zhǔn)確測定小麥面粉中維生素b6的含量對(duì)評(píng)價(jià)小麥營養(yǎng)價(jià)值及品質(zhì)育種具有重要的指導(dǎo)性意義。

現(xiàn)階段，維生素b6的檢測方法包括國際上的微生物法和國標(biāo)的熒光分光光度計(jì)法。其中，微生物法定量結(jié)果準(zhǔn)確，但前處理步驟繁瑣，培養(yǎng)時(shí)間長，技術(shù)難度大，重復(fù)性差；熒光分光光度計(jì)法操作簡單，但由于谷物中維生素b含量較低，有共存物質(zhì)干擾，所以檢測結(jié)果重復(fù)性不高。鑒于人們對(duì)于b6的深入研究，此類方法已不能滿足研究者的要求。目前，液相色譜法因其分離效率高、速度快、檢測靈敏度高、載液流速快、重復(fù)性好、對(duì)環(huán)境污染小、受環(huán)境條件影響小等優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用。國內(nèi)測定麥類作物中b6含量的研究已有報(bào)導(dǎo)，但不同研究者方法不盡相同，提取方法和色譜條件是影響測定結(jié)果的重要原因。

提取方法是定量分析的最重要的環(huán)節(jié)，提取溶劑及方法會(huì)影響終產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量，進(jìn)而干擾后續(xù)的定量分析。目前，對(duì)維生素b族成分的提取因試驗(yàn)材料和儀器不同而沒有統(tǒng)一的提取標(biāo)準(zhǔn)。韓豪等提取黑小麥中維生素b6時(shí)，對(duì)黑小麥?zhǔn)褂妹撝幚?，樣品用量大；王海燕等通過高峰淀粉酶法提取彩色小麥中維生素b6，操作復(fù)雜，需精確調(diào)節(jié)每個(gè)樣品的酸堿度，對(duì)大批量樣品測定費(fèi)時(shí)費(fèi)力。同時(shí)上述方法需要在加熱條件下操作完成，但小麥中淀粉含量較高，高溫會(huì)使淀粉糊化而降低維生素的溶出率。

高效液相色譜(hplc)技術(shù)能對(duì)維生素進(jìn)行快速、靈敏、準(zhǔn)確的測定，并通過改變檢測器和檢測波長提高儀器靈敏度。大量研究利用hplc技術(shù)測定蔬菜、水果、肉類、飲料及乳制品中的維生素含量，但普通小麥中維生素b6的測定研究較少。匙贏贏等利用hplc結(jié)合紫外檢測器測定麥麩中維生素b6的含量，由于受基體干擾，紫外檢測器檢測時(shí)會(huì)出現(xiàn)靈敏度和選擇性下降等問題。

目前，我國對(duì)維生素b的定量研究主要集中于彩色小麥，其分析樣本量較少，沒有統(tǒng)一的測定標(biāo)準(zhǔn)，無法為普通小麥維生素b含量的分析打下基礎(chǔ)。因此，確立高效準(zhǔn)確的維生素b6提取和檢測方法，可以為普通小麥維生素b的遺傳研究提供可靠的表型鑒定方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供普通小麥中維生素b6的提取方法。

本發(fā)明所提供的普通小麥中維生素b6的提取方法，包括如下步驟：

將普通小麥粉制成全麥粉，在乙醛酸水溶液和硫酸亞鐵水溶液存在的條件下，所述全麥粉在醋酸鈉水溶液中進(jìn)行酶解；所述酶解結(jié)束后的體系經(jīng)過濾后的濾液進(jìn)行衍生化，然后加入乙酸振蕩后離心，取上清液，即得到維生素b6。

所述維生素b6的提取方法中，所述酶解采用復(fù)合酶，所述復(fù)合酶可為木瓜蛋白酶、酸性磷酸酶、α-淀粉酶和還原性谷胱甘肽的復(fù)合物。

所述復(fù)合酶的用量為：所述全麥粉、所述木瓜蛋白酶、所述酸性磷酸酶、所述α-淀粉酶的質(zhì)量比為2.5g：0.05～0.1g：0.01～0.02g：0.005～0.01g，所述全麥粉與所述還原性谷胱甘肽的用量比為2.5g：250～500μl；

所述全麥粉、所述木瓜蛋白酶、所述酸性磷酸酶、所述α-淀粉酶的質(zhì)量比具體可為2.5g：0.05g：0.01g：0.005g，所述全麥粉與所述還原性谷胱甘肽的用量比具體可為2.5g：250μl。

所述木瓜蛋白酶的酶活為6000u/mg(如北京索萊寶科技有限公司提供的木瓜蛋白酶，貨號(hào)為ls003126)，所述酸性磷酸酶的酶活≥0.4u/mg(如sigma-aldrich公司提供的酸性磷酸酶，產(chǎn)品目錄號(hào)為p3627)，所述α-淀粉酶的酶活為30u/mg(如sigma-aldrich公司提供的α-淀粉酶，產(chǎn)品目錄號(hào)為10065)。

所述酶解可采用恒溫酶解的方式，溫度可為36～38℃，具體可為37℃，時(shí)間可為16～18h，具體可為18h，可在轉(zhuǎn)速為180rpm的條件下進(jìn)行。

所述維生素b1的提取方法中，所述醋酸鈉水溶液的ph值可為4.50～4.52；

所述全麥粉與所述醋酸鈉水溶液的質(zhì)量體積比為2.5～5g：25～50ml，具體可為2.5g：25ml。

所述乙醛酸水溶液的摩爾濃度可為1m，所述硫酸亞鐵水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可為2％；

所述全麥粉與所述乙醛酸水溶液的用量比可為1g：0.5ml；

所述全麥粉與所述硫酸亞鐵水溶液的用量比可為1g：80μl。

所述維生素b6的提取方法中，所述衍生化采用的衍生化試劑可為硼氫化鈉水溶液；

所述硼氫化鈉水溶液的摩爾濃度具體可為0.1m；

所述濾液、所述硼氫化鈉水溶液與所述乙酸的體積比可為10：9：1；

所述離心在如下條件下進(jìn)行：

溫度可為2～8℃，具體可為4℃；

轉(zhuǎn)速為4000～4500×g，具體可為4400×g；

時(shí)間可為10～15min，具體可為12min。

本發(fā)明提取方法中，所述全麥粉采用旋風(fēng)式粉碎磨。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供普通小麥中維生素b6含量的測定方法。

本發(fā)明所提供的普通小麥中維生素b6含量的測定方法，包括如下步驟：

(1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

1)配制至少3種(如5種)不同濃度的維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品的水溶液；

2)將所述維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品的水溶液進(jìn)行如普通小麥中維生素b6的提取方法中所述衍生化和所述離心步驟，得到的上清液過醋酸纖維膜得到維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

3)將所述維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行高效液相檢測，得到不同濃度所述維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積，以所述峰面積為橫坐標(biāo)，以所述維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(2)測定普通小麥中維生素b6的含量

按照普通小麥中維生素b6的提取方法得到的維生素b6過所述醋酸纖維膜后進(jìn)行所述高效液相檢測，得到所述維生素b6的峰面積，根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，并經(jīng)折算后即得到所述普通小麥中維生素b6的含量；

所述高效液相檢測的條件如下：

色譜柱：watersxterrarp18色譜柱；

流動(dòng)相：a相為甲醇，b相為含有5mm庚烷磺酸鈉的摩爾濃度為0.05m的磷酸二氫鉀溶液，所述a相與所述b相的體積比為3：97，用磷酸調(diào)ph為2.5；洗脫方式為等度洗脫；柱溫為：35℃；進(jìn)樣體積為20μl；流速為0.7ml/min。

按照本發(fā)明提供的普通小麥中維生素b6的提取方法提取得到的維生素b6，需在提取后的24小時(shí)內(nèi)完成維生素b6含量的測定工作。

小麥中維生素b6前處理的好壞直接影響最終測定結(jié)果，不同植物中維生素b6提取方法不同。本發(fā)明通過比較不同處理間試驗(yàn)結(jié)果得出：采用高峰淀粉酶法和混合酶法提取，通過比較維生素b6的提取效率，最終選擇混合酶法。選取醋酸鈉作為提取液，混合酶提取，該法相比高峰淀粉酶法操作更加簡單，無需加熱和精確調(diào)節(jié)每個(gè)樣品的酸堿度，減少提取時(shí)間，且避免加熱淀粉糊化而降低維生素的溶出率，也更適合大量小麥樣品中維生素b6的提取。

本發(fā)明中采用hplc搭配熒光檢測器，靈敏度更高，選擇性更強(qiáng)。維生素b6以吡哆胺和吡哆醛的形式存在，添加乙醛酸和硫酸亞鐵將吡哆胺轉(zhuǎn)化為吡哆醛，吡哆醛還原生成吡哆醇，其在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生穩(wěn)定熒光，可用于熒光檢測器檢測。通過高效液相色譜儀確定維生素b6的色譜條件，其中維生素b6的保留時(shí)間為9.780min。

附圖說明

圖1為標(biāo)準(zhǔn)樣品中維生素b6色譜圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所繪制的標(biāo)準(zhǔn)樣品中維生素b6濃度和峰面積之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中所用試劑：甲醇，色譜純；正丁醇，分析純；鹽酸，分析純；醋酸，分析純；醋酸鈉，分析純；硫酸亞鐵，分析純；硼氫化鈉，分析純；鐵氰化鉀，分析純；磷酸二氫鉀，分析純；磷酸，分析純。

下述實(shí)施例中，木瓜蛋白酶的酶活為6000u/mg，酸性磷酸酶的酶活為≥0.4u/mg，α-淀粉酶的酶活為30u/mg。

下述實(shí)施例中所用維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品、高峰淀粉酶、α-淀粉酶、酸性磷酸酶、還原型谷胱甘肽、乙醛酸、庚烷磺酸鈉購于sigma公司，木瓜蛋白酶購于索萊寶生物科學(xué)有限公司。

本發(fā)明小麥中維生素b6的提取方法，所述提取液是按如下方法確定的：選用中優(yōu)206小麥品種為試驗(yàn)材料，2種提取方法，具體為鹽酸和高峰淀粉酶(記為單酶法)；醋酸鈉和木瓜蛋白酶、酸性磷酸酶、α-淀粉酶、還原性谷胱甘肽混合使用(記為混合酶法)，比較不同提取方法對(duì)試驗(yàn)材料中維生素b6的提取量多少與方法的穩(wěn)定性。每個(gè)處理重復(fù)3次，維生素b6的含量用平均值±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。結(jié)果顯示，單酶法提取維生素b6的含量為2.29μg/g±3.9％，混合酶法提取維生素b6的含量為5.81μg/g±1.2％，混合酶法提取b6的含量比單酶法提取含量高，且總體相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均較低。這說明用醋酸鈉結(jié)合混合酶提取方法重復(fù)性更好。此外，該方法操作簡單，無需加熱，通過醋酸鈉處理，變性蛋白質(zhì)，釋放維生素，并將淀粉等多糖轉(zhuǎn)化為單糖；混合酶處理將維生素脫磷酸化轉(zhuǎn)化為自由態(tài)，提取更徹底。

實(shí)施例1：30份普通小麥中維生素b6含量的測定

一、普通小麥中維生素b6的提取

(1)小麥籽粒收獲后，曬干，采用旋風(fēng)磨制粉，充分混勻后將磨好的粉狀樣品(即全麥粉)于-20℃條件下避光保存。

(2)稱取小麥粉2.5g于100ml的藍(lán)蓋試劑瓶中，加入25ml醋酸鈉溶液(0.05m，ph4.5)，蓋緊蓋子，放在混旋器上混合，使粉狀樣品充分濕潤。

(3)將混合后的粉狀樣品分別加入1m乙醛酸(1.25ml)，2％硫酸亞鐵溶液(200μl)，木瓜蛋白酶(50mg)，1％還原型谷胱甘肽水溶液(250μl)，酸性磷酸酶(10mg)，α-淀粉酶(5mg)，每次添加酶后充分混勻。

(4)將混合后的粉狀樣品置于恒溫振蕩器中，180rpm，37℃，酶解18h。

(5)振蕩完成后，放置室溫。轉(zhuǎn)移至50ml的容量瓶中用超純水定容，濾紙過濾。

(6)取1ml濾液放入10ml的離心管中，加入0.9ml的硼氫化鈉溶液(0.1m)，搖勻，靜置5min。

(7)再加0.1ml乙酸，振蕩，4℃，4400×g離心12min，吸取上層清液，過濾0.45μm的醋酸纖維膜，用于維生素b6的色譜測定。

2、小麥中維生素b6含量的測定

(1)依據(jù)如下色譜條件進(jìn)行hplc檢測：

儀器：島津lc-2010系統(tǒng)，配備rf10axl熒光檢測器；

色譜柱：watersxterrarp18(150×4.6mm，5μm)高效液相色譜柱；

流動(dòng)相：甲醇-0.05m磷酸二氫鉀溶液(含5mm庚烷磺酸鈉)，體積比為3:97，用磷酸調(diào)ph為2.5；洗脫方式為等度洗脫；

柱溫：35℃；樣品室溫度：4℃；

激發(fā)波長/發(fā)射波長：290nm/395nm；

進(jìn)樣體積：20μl。

(2)測試數(shù)據(jù)處理：工作站軟件為labosolutions；

根據(jù)維生素b6標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間(如附圖1所示)確定小麥中維生素b6的出峰時(shí)間，根據(jù)如下步驟分別制作標(biāo)準(zhǔn)樣品中維生素b6濃度和峰面積之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線：

1)配制5種不同濃度的維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品的水溶液；

2)將維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品的水溶液進(jìn)行上述小麥中維生素b6的提取方法中的衍生化和所述離心步驟(具體條件相同)，得到的上清液過0.45μm醋酸纖維膜得到維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

3)將維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行高效液相檢測，得到不同濃度維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)，以維生素b6標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

然后將已測30份小麥樣品的峰面積數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，即可得到維生素b6含量。

30份普通小麥中，維生素b6含量變異范圍從4.58到9.34μg/g，平均值為6.77μg/g。30份小麥樣品中維生素b6的含量如下表1所示，小麥品種全部來源于黃淮麥區(qū)，每個(gè)品種兩次重復(fù)，取其平均值。

表130份普通小麥維生素b6含量