本發(fā)明涉及免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種豬瘟新型抗體ELISA檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

豬瘟(CSFV)是嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的一個豬病，抗體檢測是防控的關(guān)鍵，然而目前我國CSF ELISA抗體檢測試劑盒主要依賴進口，成本極高。

CSF ELISA抗體檢測試劑盒在國內(nèi)市場多以進口產(chǎn)品為主，成本極高。近年來雖然有多家公司開發(fā)或轉(zhuǎn)化生產(chǎn)了一些診斷試劑盒，但其穩(wěn)定性，可重復(fù)性和敏感性仍無法與進口產(chǎn)品相媲美，而且多未獲得管理部門的正式批文。目前進口試劑盒多屬于競爭ELISA，是采用全病毒作為抗原和HRP標記的單克隆抗體作為二抗，相比于本發(fā)明，全病毒和單克隆抗體的制備與獲得工藝更加復(fù)雜，耗時更久，成本更高，并且在檢測的過程中，其抗原抗體的孵育時間至少需要兩個時間或者過夜孵育，檢測時間較長，不利于進行大批量的樣品檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種豬瘟新型抗體ELISA檢測試劑盒，以桿狀病毒系統(tǒng)表達的CSFV抗原為基礎(chǔ)，靈敏度高、特異性和穩(wěn)定性好，可用于豬瘟抗體的快速檢測。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種豬瘟新型抗體ELISA檢測試劑盒，所述試劑盒包括包被了豬瘟抗原的酶標板、陰性對照血清、陽性對照血清、20X濃縮洗液、酶標抗原、底物緩沖液A、底物液B、終止液。

進一步地，在上述方案中，所述包被了豬瘟抗原的酶標板的制備過程中，所用的包被原是通過桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得的CSFV E2蛋白，所用包被液是碳酸鹽緩沖液，所用封閉液是含2％明膠的PBST。有前期研究結(jié)果表明，在CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白中，E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保護性抗原蛋白，具有更好的活性和免疫原性，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生CSFV的中和抗體，保護機體免受強毒的攻擊，因此E2糖蛋白，既是人們研究CSFV新型疫苗的主要對象，也是建立CSFV血清學檢測方法的首選抗原。本發(fā)明將CSFV-E2蛋白克隆入桿狀病毒表達載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，獲得體外表達的外源蛋白，并將該蛋白作為診斷抗原建立ELISA抗體檢測方法，與原核表達的蛋白作為包被抗原相比，桿狀病毒表達系統(tǒng)所表達的外源蛋白更加接近真實的天然蛋白的空間構(gòu)象和功能，利用該系統(tǒng)表達的蛋白與豬血清中抗體的結(jié)合更加具有特異性和敏感性，可作為理想的包被抗原蛋白。

進一步地，在上述方案中，所述酶標抗原是利用辣根過氧化物酶(HRP)通過過碘酸鈉法對CSFV-E2蛋白進行標記。

進一步地，在上述方案中，所述陰、陽性對照血清通過IFA試驗鑒定獲得。

進一步地，在上述方案中，所述20X濃縮洗滌液配方為：氯化鈉8g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鈉3g、氯化鉀5g、吐溫-20 2mL、蒸餾水20mL。

進一步地，在上述方案中，所述底物緩沖液A配方：過氧化脲1g，10.3g檸檬酸，35.8g Na2 HPO4·12 H2O，吐溫-20 100μL，蒸餾水1000mL，pH5。

進一步地，在上述方案中，所述底物液B配方：四甲基聯(lián)苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g檸檬酸，蒸餾水1000mL，pH2.4。

進一步地，在上述方案中，所述終止液配方：2M濃硫酸。

本發(fā)明還提供了一種豬瘟新型抗體ELISA檢測試劑盒的使用方法：

S1：待測血清經(jīng)前處理后備用；

取出試劑盒，在室溫下平衡30分鐘備用；

20X的濃縮洗液按所需量稀釋成1X備用，陰、陽性對照血清或初乳各做兩個重復(fù)，加入100μL1:100 1X濃縮洗液稀釋的待檢血清，37℃孵育1h；

倒出孔中的液體，用稀釋好的PBST洗5次，將酶標板倒置在吸水紙上拍干；加入按1:200稀釋好的酶標抗原100μL，37℃孵育30分鐘；

倒出孔中的液體，用PBST洗板5次，拍干；取底物緩沖液A和底物液B等體積混勻，每孔加100μL，在暗處顯色10-15分鐘，每孔加入50μl的終止液終止反應(yīng)，酶標儀上測定各孔在波長為450nm處的OD值；

S2：結(jié)果計算，用建立的雙抗原夾心ELISA方法檢測40份陰性血清，血清不稀釋，100μL/孔，每份血清重復(fù)2孔，按照以上已確立的ELISA程序進行ELISA測定，讀出D450值，計算40份血清的D450平均值和標準差；

S3：根據(jù)統(tǒng)計學原則，D450值平均數(shù)+3×標準方差時，可以在99.9％的水準上判定為陽性，因而設(shè)定陰陽性臨界值等于陰性血清的D450值平均數(shù)+3×標準方差，求得陰陽性臨界值0.4，在規(guī)定的實驗條件下，其D450值大于臨界值，即待檢血清樣本D450﹥0.4，判為陽性，反之為陰性。

進一步地，所述豬瘟新型抗體ELISA檢測試劑盒的的檢測原理是：

酶標板上的每個孔均包被有相同量的抗原，加入待測血清后，固相包被抗原和待測血清中的抗體反應(yīng)，形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)，再加入酶標抗原，固相免疫復(fù)合物上的抗體與酶標抗原結(jié)合，徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗原，加入底物液(即顯色液A液)和顯色液(即B液)，顯色反應(yīng)淺，用酶標儀檢測的OD值低，表明血清中抗體水平低；反之，當待測血清中抗體含量高時，則所測的OD值高，顯色反應(yīng)深。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明以桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得的CSFV-E2蛋白作為包被抗原，利用辣根過氧化物酶(HRP)通過過碘酸鈉法對CSFV-E2蛋白進行標記，獲得酶標抗原。以此作為開發(fā)的新型CSF ELISA抗體檢測試劑盒能夠替代國外同類產(chǎn)品。相比完整的CSFV，重組的結(jié)構(gòu)蛋白具有無毒性等優(yōu)點，因此，實驗無須在專門的實驗室中進行。更重要的是，抗原的產(chǎn)生和純化，相對于全病毒來說重組蛋白較容易獲得。囊膜E2蛋白作為CSFV主要抗原蛋白，包含許多在CSFV毒株中高度保守的抗原區(qū)域。而在ELISA檢測中，針對BVDV和BDV的抗體檢測中存在交叉反應(yīng)。但這一情況，在使用重組E2蛋白代替全病毒后降低。本試劑盒采用雙抗原夾心法，具有較高的特異性和敏感性，并且大大縮短了檢測時間。本發(fā)明對解決大批量樣品豬血清中的豬瘟病毒抗體檢測具有重要的現(xiàn)實意義，通過對豬群抗體水平的檢測，可以實時監(jiān)控豬群的整體免疫效果，為該病的診斷、檢測和監(jiān)測等提供了有力的工具。

附圖說明

圖1是本發(fā)明試劑盒的制備工藝流程圖；

圖2是抗原包被ELISA板的保存期測定結(jié)果；

圖3是酶標抗原的保存期測定結(jié)果。

具體實施方式

一種豬瘟新型抗體ELISA檢測試劑盒，所述試劑盒包括包被了豬瘟抗原的酶標板、陰性對照血清、陽性對照血清、20X濃縮洗液、酶標抗原、底物緩沖液A、底物液B、終止液。包被了豬瘟抗原的酶標板的制備過程中，所用的包被原是通過桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得的CSFV E2蛋白，所用包被液是碳酸鹽緩沖液，所用封閉液是含2％明膠的PBST。有前期研究結(jié)果表明，在CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白中，E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保護性抗原蛋白，具有更好的活性和免疫原性，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生CSFV的中和抗體，保護機體免受強毒的攻擊，因此E2糖蛋白，既是人們研究CSFV新型疫苗的主要對象，也是建立CSFV血清學檢測方法的首選抗原。本發(fā)明將CSFV-E2蛋白克隆入桿狀病毒表達載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，獲得體外表達的外源蛋白，并將該蛋白作為診斷抗原建立ELISA抗體檢測方法，與原核表達的蛋白作為包被抗原相比，桿狀病毒表達系統(tǒng)所表達的外源蛋白更加接近真實的天然蛋白的空間構(gòu)象和功能，利用該系統(tǒng)表達的蛋白與豬血清中抗體的結(jié)合更加具有特異性和敏感性，可作為理想的包被抗原蛋白。

酶標抗原是利用辣根過氧化物酶(HRP)通過過碘酸鈉法對CSFV-E2蛋白進行標記。陰、陽性對照血清通過IFA試驗鑒定獲得。

20X濃縮洗滌液配方為：氯化鈉8g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鈉3g、氯化鉀5g、吐溫-20 2mL、蒸餾水20mL。

底物緩沖液A配方：過氧化脲1g，10.3g檸檬酸，35.8g Na2HPO4·12 H2O，吐溫-20 100μL，蒸餾水1000mL，pH5。

底物液B配方：四甲基聯(lián)苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g檸檬酸，蒸餾水1000mL，pH2.4。

終止液配方：2M濃硫酸。

本實施例的豬瘟新型抗體ELISA檢測試劑盒的使用方法為：

S1：待測血清經(jīng)前處理后備用；

取出試劑盒，在室溫下平衡30分鐘備用；

20X的濃縮洗液按所需量稀釋成1X備用，陰、陽性對照血清或初乳各做兩個重復(fù)，加入100μL1:100 1X濃縮洗液稀釋的待檢血清，37℃孵育1h；

倒出孔中的液體，用稀釋好的PBST洗5次，將酶標板倒置在吸水紙上拍干；加入按1:200稀釋好的酶標抗原100μL，37℃孵育30分鐘；

倒出孔中的液體，用PBST洗板5次，拍干；取底物緩沖液A和底物液B等體積混勻，每孔加100μL，在暗處顯色10-15分鐘，每孔加入50μl的終止液終止反應(yīng)，酶標儀上測定各孔在波長為450nm處的OD值；

S2：結(jié)果計算，用建立的雙抗原夾心ELISA方法檢測40份陰性血清，血清不稀釋，100μL/孔，每份血清重復(fù)2孔，按照以上已確立的ELISA程序進行ELISA測定，讀出D450值，計算40份血清的D450平均值和標準差；

S3：根據(jù)統(tǒng)計學原則，D450值平均數(shù)+3×標準方差時，可以在99.9％的水準上判定為陽性，因而設(shè)定陰陽性臨界值等于陰性血清的D450值平均數(shù)+3×標準方差，求得陰陽性臨界值0.4，在規(guī)定的實驗條件下，其D450值大于臨界值，即待檢血清樣本D450﹥0.4，判為陽性，反之為陰性。

該豬瘟新型抗體ELISA檢測試劑盒的的檢測原理是：

酶標板上的每個孔均包被有相同量的抗原，加入待測血清后，固相包被抗原和待測血清中的抗體反應(yīng)，形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)，再加入酶標抗原，固相免疫復(fù)合物上的抗體與酶標抗原結(jié)合，徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗原，加入底物液(即顯色液A液)和顯色液(即B液)，顯色反應(yīng)淺，用酶標儀檢測的OD值低，表明血清中抗體水平低；反之，當待測血清中抗體含量高時，則所測的OD值高，顯色反應(yīng)深。

本發(fā)明的工藝流程圖如圖1所示。

保存期穩(wěn)定性實驗

將豬瘟新型抗體檢測試劑盒中的抗原包被ELISA板，置37℃恒溫箱中加速老化，將其余成分仍放于4℃?？乖籈LISA板于37℃恒溫箱中放置1d、2d、3d、4d、5d、6d后，依次取出繼續(xù)保存于4℃。當抗原包被ELISA板于37℃恒溫箱中放置至第7d后，取出所有之前保存于4℃的抗原包被ELISA板，對背景已知的6份被檢血清(4份陽性血清P1、P2、P3、P4，2份陰性血清N1、N2)進行檢測，以判斷抗原包被ELISA板的保存情況。保存期測定結(jié)果如圖2所示。

將試劑盒中的抗原包被ELISA板，置37℃放置7d后，檢測背景已知的6份血清，結(jié)果見上圖，從結(jié)果可知抗原包被ELISA板在37℃恒溫箱中放置7d，其檢測結(jié)果數(shù)值仍較穩(wěn)定，說明試劑盒中的抗原包被ELISA板在37℃恒溫箱中可保存一周，即相對于4℃能保存一年。

將豬瘟新型抗體檢測試劑盒中的酶標抗原分裝成7管后，置37℃恒溫箱中加速老化，將其余成分仍放于4℃。酶標抗原于37℃恒溫箱中放置1d、2d、3d、4d、5d、6d后，依次取出繼續(xù)保存于4℃。當酶標抗原于37℃恒溫箱中放置至第7d后，取出所有之前保存于4℃的酶標抗原，對背景已知的6份被檢血清(4份陽性血清P1、P2、P3、P4，2份陰性血清N1、N2)進行檢測，以判斷酶標抗原的保存情況。保存期測定結(jié)果如圖3所示。

將試劑盒中的酶標抗原，置37℃放置7d后，檢測背景已知的6份血清，結(jié)果見上圖，從結(jié)果可知酶標抗原在37℃恒溫箱中放置7d，其檢測結(jié)果數(shù)值仍較穩(wěn)定，說明試劑盒中的酶標抗原在37℃恒溫箱中可保存一周，即相對于4℃能保存一年。

試劑盒特異性實驗

用E2蛋白以10倍的反應(yīng)濃度與CSFV陽性血清混合，進行阻斷試驗。E2蛋白吸附陽性血清后，所測抗體的OD值顯著降低，(N-P)/N的值均大于0.5，阻斷陽性。阻斷試驗的結(jié)果表明，以E2蛋白為抗原建立的雙抗原夾心法ELISA具有較好的特異性。

(N-P)/N＝(未阻斷孔OD值一阻斷孔OD值)/未阻斷孔OD值(此比值大于0.5即判為阻斷陽性)

用表達蛋白包被酶標板，分別取豬鏈球菌陽性血清(MRP)、大腸桿菌陽性血清(ED)和豬細小陽性血清(APP)，豬胸膜肺炎放線菌陽性血清(PPV)等，進行交叉試驗。CSFV陽性血清ELISA試驗P/N值較高，在4.0以上，而與豬鏈球菌陽性血清、大腸桿菌陽性血清和口蹄疫陽性血清反應(yīng)的P/N值則比較低，均在2.0以下，結(jié)果說明建立的夾心ELISA具有較好的特異性(見表1)。

根據(jù)阻斷試驗和交叉試驗結(jié)果可知該試劑盒其特異性較好，可用于CSFV的血清學診斷。

表1

血清樣品1:100稀釋

試劑盒敏感性實驗

選擇保存的1份強陽性血清(S1)、1份陽性血清(S2)、2份弱陽性血清(S3、S4)，一份陰性血清S5，分別進行倍比稀釋(25～6400)，設(shè)置重復(fù)孔，按優(yōu)化的ELISA方法進行檢測，讀取其OD值，由表2可見，強陽性血清經(jīng)6400倍稀釋，陽性血清經(jīng)800倍稀釋，弱陽性血清經(jīng)200倍稀釋，OD值均大于0.4，而陰性樣品經(jīng)25～6400倍稀釋，OD值均小于0.4，表明該方法具有良好的敏感性。

表2

與豬瘟IDEXX抗體檢測ELISA試劑盒檢測結(jié)果符合率的比較

將建立的E2-1 ELISA方法對140份臨床血清的檢測結(jié)果與豬瘟IDEXX抗體檢測試劑盒進行比較。用豬瘟DEXX抗體檢測ELISA試劑盒檢測出的120份陽性血清中，E2重組蛋白建立的夾心ELISA檢測出113份陽性，而用豬瘟IDEXX抗體檢測ELISA試劑盒檢測出20份陰性血清，用E2重組蛋白建立的夾心ELISA檢測出14份陰性，6份陽性；二者符合符合率為90.7％。

最后應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實施例技術(shù)方案的精神和范圍。